Aufzeichnung der Muskelaktivität der Vordergliedmaßen bei Mäusen mit fixiertem Kopf mit chronisch implantierten EMG-Elektroden
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die manuelle Herstellung und chirurgische Implantation von elektromyographischen (EMG) Elektroden in die Vordergliedmaßenmuskulatur von Mäusen, um die Muskelaktivität während kopffixierter Verhaltensexperimente aufzuzeichnen.
Abstract
Leistungsfähige genetische und molekulare Werkzeuge, die in der neurowissenschaftlichen Forschung zu Maussystemen zur Verfügung stehen, haben es Forschern ermöglicht, die Funktion des motorischen Systems mit beispielloser Präzision bei Mäusen mit fixiertem Kopf zu untersuchen, die eine Vielzahl von Aufgaben ausführen. Die geringe Größe der Maus erschwert die Messung der motorischen Leistung, da die traditionelle Methode der elektromyographischen (EMG) Aufzeichnung der Muskelaktivität für größere Tiere wie Katzen und Primaten konzipiert wurde. In Erwartung der kommerziell verfügbaren EMG-Elektroden für Mäuse besteht die derzeitige Goldstandardmethode zur Aufzeichnung der Muskelaktivität bei Mäusen darin, Elektrodensätze im eigenen Haus herzustellen. Dieser Artikel beschreibt eine Verfeinerung der etablierten Verfahren für die manuelle Herstellung eines Elektrodensets, die Implantation von Elektroden in der gleichen Chirurgie wie die Implantation der Kopfplatte, die Fixierung eines Verbindungsstücks auf der Kopfplatte und die postoperative Genesungsversorgung. Nach der Wiederherstellung können EMG-Aufzeichnungen mit Millisekundenauflösung über mehrere Wochen hinweg ohne merkliche Veränderungen der Signalqualität aufgenommen werden, wenn der Kopf fixiert ist. Diese Aufzeichnungen ermöglichen eine präzise Messung der Muskelaktivität der Vordergliedmaßen neben in vivo neuronaler Aufzeichnung und/oder Störung, um Mechanismen der motorischen Kontrolle bei Mäusen zu untersuchen.
Introduction
In den letzten Jahrzehnten haben sich Mäuse zu einem attraktiven Modellorganismus für die Erforschung des motorischen Systems von Säugetieren entwickelt. Gängige experimentelle Ansätze beinhalten kopffixierte Mäuse, die motorische Aufgaben ausführen und gleichzeitigdie neuronale Aktivität überwachen und/oder stören 1,2,3,4,5. Studien zum motorischen System an größeren Spezies (wie Katzen und Primaten) haben sich traditionell auf die Elektromyographie (EMG) gestützt, um die motorische Leistung direkt während solcher Experimente zu messen 6,7,8. Die Aufzeichnung der Muskelaktivität bei Mäusen ist jedoch eine Herausforderung, da ihre Muskulatur zu klein für kommerziell erhältliche EMG-Elektroden ist, die in Experimenten mit großen Säugetieren verwendet werden9. Viele Forscher entscheiden sich dafür, die Kinematik der Gliedmaßen durch Video 4,10,11 und/oder Verhaltensleistung 2,4,12 zu verfolgen, um die motorische Leistung indirekt zu untersuchen, aber diesen Methoden fehlt die Auflösung, um den Einfluss der neuronalen Aktivität und deren Störung auf die Muskeln auf der Millisekunden-Zeitskala zu erfassen. Daher ist die Aufzeichnung von EMG für Forscher wünschenswert, die an der direkten neuronalen Steuerung von Muskeln interessiert sind.
Bei der EMG wird die Spannung zwischen zwei Punkten gemessen, die in der Regel durch einen kurzen Abstand getrennt sind, der ungefähr parallel zu den Fasern des aufgezeichneten Muskels verläuft. EMG-Elektroden gibt es in Oberflächen- (oder “Patch”) und intramuskulären (oder “Nadel”-) Varianten. Oberflächenelektroden werden auf der Haut platziert oder über das Muskelgewebe gelegt und mit Klebstoff oder Nähten gesichert. Daher sind Oberflächenelektroden weniger invasiv als intramuskuläre Elektroden und aufgrund ihrer relativen Benutzerfreundlichkeit bei Menschen, Katzen und Primaten am beliebtesten. Oberflächenelektroden wurden auch erfolgreich bei Ratten und Mäusen eingesetzt 13,14; Sie müssen jedoch von Hand hergestellt und chirurgisch unter die Haut implantiert werden, da Nagetiere dazu neigen, während der Fellpflege zu versuchen, Fremdkörper zu entfernen. Intramuskuläre EMG-Elektroden hingegen werden chirurgisch in das Muskelgewebe implantiert. Da sie von Muskelgewebe umhüllt sind, bieten sie eine hohe räumliche Auflösung und bleiben auf unbestimmte Zeit in ihrer Position fixiert. Daher eignen sich implantierte intramuskuläre EMG-Elektroden ideal über Oberflächenelektroden für Langzeitexperimente mit Nagetieren. Um das intramuskuläre EMG bei Mäusen zuverlässig aufzuzeichnen, haben Forscher eine Methode entwickelt, mit der EMG-Elektroden von Hand hergestellt und in Muskeln implantiert werden können, die so klein sind wie die im Unterarm einer erwachsenen Maus. Diese Elektroden ermöglichen eine chronische Muskelaufzeichnung während des motorischen Verhaltens bei Nagetieren über mehrere Wochen.
Das hier beschriebene Protokoll ist das Ergebnis einer jahrzehntelangen Verfeinerung der etablierten Methoden 15,16,17,18, die ein Verfahren zur manuellen Herstellung, Implantation und Aufzeichnung von Draht-EMG-Elektroden hervorgebracht hat, die chronisch in Beuge-/Streckmuskelpaaren des Ellbogens und des Handgelenks bei sich verhaltenden Mäusen implantiert wurden. Der erste Abschnitt beschreibt die manuelle Herstellung eines Elektrodensatzes mit vier Elektrodenpaaren und einem 8-poligen Stecker für die Kopftischschnittstelle. Der nächste Abschnitt beschreibt die chirurgische Implantation der Elektroden intramuskulär in die Ober- und Unterarmmuskulatur in der gleichen Operation wie die Kopfplattenimplantation. Abschließend werden repräsentative Aufzeichnungen von Mäusen diskutiert, die eine Vielzahl von Verhaltensweisen ausführen. Insgesamt ist diese Methode eine kostengünstige und anpassbare Möglichkeit, Muskelaktivitätsmessungen in kopffeste Verhaltensexperimente einzubeziehen, die ideal für Labore mit etwas Erfahrung in der Elektrodenherstellung ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ermöglicht stabile Muskelaktivitätsaufzeichnungen von Mäusen mit festem Kopf, die über mehrere Wochen hinweg eine Vielzahl von Verhaltensweisen ausführen. In jüngster Zeit wurde diese Methode eingesetzt, um die neuronale Kontrolle der Gliedmaßenmuskulatur während Verhaltensweisen wie der Fortbewegung auf dem Laufband18,20, einer Joystick-Zugaufgabe18 und einer Co-Kontraktionsaufgabe21 zu untersuchen. Während das hier beschriebene Protokoll spezifisch für Ellenbogen- und Handgelenksmuskeln von Mäusen ist, kann es leicht modifiziert werden, um von verschiedenen Muskeln oder einer unterschiedlichen Anzahl von Muskeln aufzuzeichnen, indem die Länge und/oder die Gesamtzahl der Elektrodenpaare geändert wird. Die hier beschriebene Methode wurde von den zuvor verwendeten Methoden zur Aufzeichnung der Muskelaktivität der Vorder- und Hintergliedmaßen bei Mäusen ohne Kopfstütze angepasst 15,16,17.
Die Herstellung von Elektroden erfordert viel Übung, um sie zu beherrschen. Tägliches Üben von 1-2 Stunden während des Lernens wird empfohlen. Das Abisolieren der Elektroden ist aufgrund des präzisen Kraftaufwands, der erforderlich ist, um die Isolierung zu durchtrennen, ohne den darunter liegenden Draht zu beschädigen, der anspruchsvollste Schritt. Diese Kraft hängt von der Schärfe der Klinge ab, so dass ein häufiger Austausch der Skalpellklinge dazu beitragen kann, die Reproduzierbarkeit während des Lernens zu gewährleisten. Auch das Löten der Drähte an die Messingklingen des Steckverbinders kann schwierig sein, da sich Edelstahl nicht ohne weiteres lötet. Das Auftragen einer großzügigen Menge an edelstahlverträglichem Flussmittel hilft, die Verbindung zu fördern.
Die größte Herausforderung bei der Implantation besteht darin, den distalen Knoten zu binden, ohne den implantierten Draht oder den proximalen Knoten zu stören. Der proximale Knoten muss groß genug sein, um an der Einstichstelle nicht in den Muskel zu rutschen – vermeiden Sie daher, dass der Knoten in Schritt 2 der Herstellung des Elektrodensets zu fest gebunden wird. Wenn der proximale Knoten nach der Implantation wandert, verwenden Sie eine Pinzette mit Kohlefaserspitze, um ihn vorsichtig neu zu positionieren. Ziehen Sie den distalen Knoten langsam fest, während Sie den Draht mit einer Pinzette fest greifen, um zu vermeiden, dass die gesamte Elektrode durchgezogen wird. Dieser Schritt ist entscheidend, um die Langlebigkeit der implantierten Elektroden zu gewährleisten: Zu viel Spannung auf die Elektrode kann dazu führen, dass sie bricht, wenn sich das Tier bewegt, während sich eine lose Elektrode während der Genesung verschieben und den Kontakt zum zugehörigen Muskel verlieren kann, wenn das Gewebe heilt.
Die Tiere erholen sich bemerkenswert gut von der Operation, obwohl es mögliche Komplikationen zu beachten gibt. Zuerst kauen Mäuse an ihren Nähten und Elektroden, wenn sie die Gelegenheit dazu haben. Das elisabethanische Halsband verhindert dies, verhindert aber auch, dass sich das Tier selbst putzt. Einige Mäuse entwickeln eine schleimartige Ansammlung um ihre Augen. Gelegentlich kommt es bei männlichen Mäusen, insbesondere bei älteren, zu Harnröhrenblockaden, die für das Tier belastend sein können. Wenn Sie das Tier jeden Tag 20 Minuten lang putzen lassen, bevor es die Nähte inspiziert, sollte das Tier genügend Zeit haben, diese Probleme zu vermeiden.
Es gibt wichtige Einschränkungen dieser Methode zu beachten. Erstens können diese kundenspezifischen Elektroden im Allgemeinen die Aktivität einer einzelnen motorischen Einheit nicht auflösen. Darüber hinaus ist nicht garantiert, dass das elektrische Signal ausschließlich von einem bestimmten Muskel (d. h. dem Bizeps) ausgeht, da es schwierig ist, eine Übersprache von der Aktivität in nahe gelegenen synergistischen Muskeln auszuschließen. Daher beziehen sich Forscher in Veröffentlichungen häufig auf die erfassten Muskeln nach ihrer Synergiegruppe (d. h. Ellenbogenbeuger). Es wird empfohlen, nach jedem Experiment postmortale Dissektionen durchzuführen, um die Position jeder Elektrode zu überprüfen, da sie sich während der Genesung im Gewebe verschieben können.
Forscher, die sich für die Aktivität einzelner motorischer Einheiten interessieren, sollten in Erwägung ziehen, neu entwickelte EMG-Elektroden des Center for Advanced Motor Bioengineering Research (CAMBER) an der Emory University auszuprobieren. Diese Elektroden befinden sich noch in der Entwicklung, aber CAMBER wird das neueste Elektrodendesign liefern. Der Hauptnachteil dieser Elektroden ist die Langlebigkeit: Die in diesem Protokoll beschriebenen handgefertigten Elektroden ermöglichen in der Regel Aufzeichnungen über mehrere Wochen, während CAMBER-Elektroden am besten für kurzfristige Experimente geeignet sind. Forscher, die sich für eine EMG-Aufzeichnungsmethode entscheiden, können sich direkt an CAMBER wenden, um festzustellen, ob ihre Elektroden für ein bestimmtes Experiment geeignet sind.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Claire Warriner für ihren Beitrag zur Entwicklung dieser Methode. Mark Agrios und Sajishnu Savya halfen bei der Erstellung der Zahlen. Diese Forschung wurde durch einen Searle Scholar Award, ein Sloan Research Fellowship, eine Simons Collaboration on the Global Brain Pilot Award, einen Whitehall Research Grant Award, das Chicago Biomedical Consortium mit Unterstützung der Searle Funds at The Chicago Community Trust, das NIH Grant DP2 NS120847 (A.M.) und das NIH Grant 2T32MH067564 (A.K.) unterstützt.
Materials
| #11 Scalpel Blades | World Precision Instruments | 504170 | For EMG electrode fabrication |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | For EMG electrode fabrication |
| 1 mL Sub-Q Syringe (100 pack) | Becton Dickinson | 309597 | For administering injectable drugs |
| 12-pin connector | Newark | 33AC2371 | 12-pin connector with brass fittings; for EMG electrode fabrication |
| 18 G Needles | Exel International | 26419 | For EMG electrode fabrication |
| 27 G Needles | Exel International | 26426 | For EMG electrode fabrication |
| 3 M Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-0 | For taping animal's limbs out during surgery |
| 6-0 silk sutures | Henry Schein | 101-2636 | These sutures work well with delicate skin around the wrists |
| C&B Metabond Complete Kit | Pearson Dental | P16-0126 | Dental cement to affix connector to headplate |
| C57BL6/J Mice | Jackson Laboratories | #000664 | Wild type mice |
| Carbofib 5-CF Tweezers (2) | Aven tools | 18762 | Carbon fiber tipped forceps, used to manipulate delicate parts of electrode (stripped or inserted sections) |
| Carprodyl (Carprofen) 50 mg/mL Injection | Ceva Animal Health, LLC | G43010B | Injectable analgesic for pain management during and after surgery |
| Castroviejo Micro Needle Holder | Fine science tools | 12060-01 | For suturing |
| Castroviejo Needle Holder (large) | Fine science tools | 12565-14 | For inserting needle into muscle |
| Delicate Bone Scraper | Fine science tools | 10075-16 | To separate skin from underlying tissue |
| Dietgel 76A Dietary Supplement | Clear H2O | 72-07-5022 | For post-operative care |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine science tools | 11251-35 | To remove fascia overlying muscle |
| Elizabethan collar for mouse | Kent Scientific Corporation | EC201V-10 | For post-operative care |
| Enrofloxacin 2.27% | Covetrus | #074743 | Injectable antibiotic for use during and after surgery |
| Epoxy gel | Devcon | 14265 | For EMG electrode fabrication |
| Hopkins Bulldog Clamp (4) | Stoelting | 10-000-481 | Tissue clamps for headplate implantation |
| Isoflurane Solution | Covetrus | 11695067771 | Inhalable anesthesia |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable – 2% | Covetrus | #002468 | Topical analgesic for pain management during surgery |
| Medical Grade Oxygen | Airgas | OX USP200 | For administering isoflurane during surgery |
| MetriCide 1 Gallon | Metrex | 10-1400 | Glutaraldehyde solution for cold-sterilization of headplate and electrodes |
| MetriTest Strips 1.5% | Metrex | 10-303 | Test strips for monitoring glutaraldehyde solution (recommended) |
| Model 900LS Small Animal Stereotaxic Instrument | Kopf Instruments | 900LS | Stereotax with lazy susan feature that allows platform rotation during surgery |
| PFA-coated 0.0055" braided stainless steel wire | A-M systems | 793200 | For EMG electrode fabrication |
| Povidone-iodine prep pads | Dynarex | 1108 | For cleaning skin |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 37327 | Eye ointment for surgery |
| Sterile alcohol prep pads | Dynarex | 1113 | For cleaning skin |
| Straight fine #5 forceps | Fine science tools | 11295-10 | For curling wire after insertion |
| Straight fine scissors | Fine science tools | 14060-11 | For cutting wire |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 91500-09 | For making incisions, trimming fat and fascia, and suturing |
| Technik Tweezers 7B-SA (2) | Aven tools | 18074USA | Curved blunt forceps, for general use during surgery |
| Triple Antibiotic Ointment | Walgreens | 975863 | Topical antibiotic for surgery |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | Contains all necessary equipment for anesthesia induction and scavenging including vaporizer, induction chamber, moveable plastic nose cone, and tubing |
References
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