Enregistrement de l’activité musculaire des membres antérieurs chez des souris fixées à la tête avec des électrodes EMG implantées de manière chronique

Toutes les expériences et procédures ont été réalisées conformément aux directives du NIH et approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Northwestern. D’autres pays et/ou institutions peuvent avoir des réglementations différentes qui nécessitent des modifications de cette procédure. Les animaux inclus dans la présente étude étaient des mâles adultes C57BL6/J (voir le tableau des matériaux) âgés de 12 à 20 semaines et pesant au moins 20 g. 1. Fabrication d’un jeu d’électrodes REMARQUE : Effectuez ces étapes sur une paillasse propre à l’aide d’un stéréomicroscope avec une plage de grossissement de 10x à 40x et propres à mains nues. Voir la figure 1 pour des schémas détaillant le dénudage des fils d’électrode (figure 1A) et l’assemblage du connecteur (figure 1B). Coupez les fils : Pour chaque paire d’électrodes, coupez deux morceaux de fil d’acier inoxydable tressé revêtu de PFA (7 brins, 0,0055″ de diamètre) (voir le tableau des matériaux). Pour les muscles du bras, coupez chaque fil de 9,5 cm de long. Pour les muscles de l’avant-bras, coupez chaque fil de 10,5 cm de long. Attachez les deux fils ensemble avec un seul nœud – cela deviendra le nœud situé juste à l’extérieur du site d’insertion (nœud proximal) lors de l’implantation. Les fils liés comprennent une paire d’électrodes.À l’aide d’une aiguille de 18 G insérée dans un morceau de carton ondulé, positionnez le nœud à 6 cm de l’extrémité d’insertion et serrez autour de l’aiguille en tirant les brins d’électrode contre le carton. L’extrémité d’insertion rétrécira à environ 5,5 cm, avec les 0,5 cm restants attachés dans le nœud. Retirez délicatement l’aiguille et tirez deux fois sur le nœud à mains nues pour le serrer davantage.REMARQUE : Le nœud ne doit pas être aussi serré que possible ; En resserrant de cette façon, vous obtiendrez un nœud proximal de la bonne taille pour ancrer les électrodes implantées dans les tissus. Pour les muscles du haut du bras, assurez-vous que les extrémités du connecteur mesurent 3,5 cm de long. Pour les muscles de l’avant-bras, assurez-vous que les extrémités du connecteur mesurent 4,5 cm de long. Dénudez 0,5 mm d’isolant sur chaque fil : 1 à 1,5 mm du nœud sur un fil et 2 à 2,5 mm du nœud sur l’autre fil. La figure 1 illustre l’endroit où dénuder chaque fil.Collez l’électrode tendue contre un morceau de carton plat avec les deux fils d’extrémité du connecteur ensemble et les fils d’extrémité d’insertion écartés. À l’aide d’un scalpel, faites des entailles dans l’isolant, en marquant les extrémités où l’isolant sera retiré. À chaque entaille, faites une série de ~6 entailles avec une lame de scalpel à chaque entaille : ~2 en haut, ~2 sur le côté et ~2 en dessous du fil.REMARQUE : Il est essentiel d’éviter de trop couper le fil lui-même. Sinon, les brins peuvent se casser. Il faut s’entraîner pour obtenir la pression appropriée pour couper complètement l’isolant avec des dommages limités au fil. Faites pivoter la paire d’électrodes de 180 degrés et répétez les 6 coupes dans chaque entaille. Effectuez des coupes supplémentaires au besoin pour séparer les 0,5 mm d’isolant du fil sous-jacent. Le nombre de coupes nécessaires ici dépendra de la pression appliquée et de la netteté de la lame du scalpel. Inclinez la lame du scalpel pour couper le long de l’isolant desserré dans le sens de la longueur et retirez-la du fil à l’aide d’une pince. Inspectez le fil exposé pour détecter tout bris et/ou isolant effiloché qui pourrait causer des dommages lors de l’insertion dans les tissus. Dénudez de 1 mm l’extrémité de chaque fil à l’extrémité du connecteur. Dénudez l’extrémité de chaque fil à 5 mm à l’extrémité d’insertion. Torsadez les segments du fil d’insertion ensemble et sertissez les extrémités exposées de 5 mm ensemble dans l’arbre d’un 0,5 po. Aiguille de 27 G. Des aiguilles hypodermiques typiques peuvent être utilisées après avoir retiré l’extrémité Luer Lock. Répétez les étapes 1.1 à 1.6 pour chaque paire d’électrodes. Assemblez le connecteur.Coupez l’extrémité femelle du connecteur à 12 broches (voir le tableau des matériaux) à la taille : # paires d’électrodes x 2 fentes à broches. Retirez délicatement les raccords en laiton de chaque port de connecteur (ceux-ci sont pré-fixés au connecteur à 12 broches) avec une pince. Conservez ces raccords pour l’étape suivante. Soudez chaque extrémité exposée de 1 mm de chaque fil à la surface extérieure de l’une des lames d’un raccord en laiton.ATTENTION : La soudure libère des fumées qui peuvent provoquer une irritation de la peau, des yeux et des voies respiratoires. Portez des gants (ou lavez-vous les mains par la suite), utilisez des lunettes de protection et utilisez un dispositif d’extraction des fumées locales pour limiter l’exposition.Fixez le raccord en laiton dans une pince crocodile édentée fixée à un outil à main avec la surface extérieure de l’une de ses lames vers le haut. Placez le raccord sous le microscope pour permettre un contrôle visuel élevé pendant le soudage. À l’aide d’un trombone déplié ou d’un morceau de fil de ferrail, tamponnez une petite quantité de flux compatible avec l’acier inoxydable sur la surface de la lame. Appliquez suffisamment de soudure sur la lame pour couvrir les ~1,5 mm inférieurs de la lame en laiton à l’aide d’une pointe de soudure conique étroite.REMARQUE : Trop de soudure ici interférera avec l’assemblage du connecteur, tandis que trop peu de soudure pourrait laisser une connexion inadéquate. Ayez des raccords en laiton supplémentaires disponibles pour recommencer si nécessaire. Enduire généreusement la surface de la soudure sur la lame avec du flux compatible avec l’acier inoxydable, mais évitez que le flux ne s’égoutte dans l’espace entre les deux lames. Tenez le fil d’électrode exposé de 1 mm au ras de la soudure sur la lame et chauffez la soudure avec le fer pour fusionner la connexion. Inspectez la connexion : La majorité du fil exposé doit être immergée dans la soudure et le fil doit être fermement fixé au raccord en laiton. Assurez-vous qu’aucune soudure ne s’est retrouvée entre les deux lames du raccord en laiton – cela pourrait rendre difficile l’insertion ultérieure d’un connecteur mâle. Enfin, assurez-vous que la connexion affleure la lame en laiton pour permettre au raccord d’être réinséré dans le connecteur à l’étape suivante. À l’aide d’une pince droite, réinsérez chaque raccord en laiton soudé dans le connecteur, en vous assurant que les fils de chaque paire d’électrodes sont adjacents les uns aux autres et ne sont pas emmêlés avec d’autres paires d’électrodes. Voir la figure 1B pour visualiser l’orientation d’une seule paire d’électrodes dans le connecteur.REMARQUE : L’orientation idéale de gauche à droite est : biceps (3,5 mm à l’extrémité du connecteur), triceps (3,5 mm à l’extrémité du connecteur), extenseur du carpe radial (ECR ; 4,5 mm à l’extrémité du connecteur) et long palmaire (PL ; 4,5 mm à l’extrémité du connecteur). Marquez un côté avec un marqueur ou un voile blanc pour suivre l’orientation du connecteur lors de l’implantation. Coupez un connecteur mâle à 12 broches de la même taille (# paires d’électrodes x 2) que l’extrémité femelle et connectez-le au connecteur femelle. Si les raccords sont déplacés, ils peuvent être réinsérés à l’aide d’une pince droite une fois le connecteur mâle installé. Retirez les languettes émanant des raccords en laiton à l’aide d’une pince. Enduire les fentes des broches d’époxy, en vous assurant que tout le métal ou le fil près du connecteur sera isolé du tissu.ATTENTION : L’époxy peut provoquer une irritation de la peau, des yeux et des voies respiratoires en cas d’exposition prolongée. Portez des gants, des lunettes de protection et n’utilisez de l’époxy que dans un endroit bien ventilé ou sous un dispositif d’extraction des fumées locales. Laissez le connecteur sécher à l’air libre pendant au moins 30 min. Testez la résistance de chaque paire d’électrodes et étiquetez les aiguilles avec de petits segments colorés de thermorétractable pour une identification facile pendant l’opération.REMARQUE : La résistance doit être comprise entre 18 et 50 ohms. Une résistance plus faible peut indiquer une position courte. Une résistance plus élevée peut indiquer que les brins de fil sont trop endommagés. Cependant, une résistance élevée provient souvent d’une connexion imparfaite entre la tige de l’aiguille et le fil (réalisée à l’étape 1.6), qui peut être résolue par un sertissage supplémentaire à cette jonction. Assurez-vous que le jeu d’électrodes est exempt de fibres et d’autres débris avant l’implantation. Un pulvérisateur peut être utilisé pour cela. L’inspection au microscope peut être utile pour vérifier. 2. Chirurgie d’implantation d’électrodes REMARQUE : Cette section décrit une seule intervention chirurgicale pour implanter une plaque frontale et des électrodes fabriquées dans la section précédente dans les triceps, les biceps, l’extenseur radial du carpe (ECR) et le long palmaire (PL). Pour ces deux derniers muscles, il est très difficile d’implanter l’électrode exclusivement dans ces muscles individuels sans passer par les muscles synergistes voisins. Voir la discussion ci-dessous concernant les mises en garde concernant la tentative d’isoler des enregistrements de muscles individuels. Les plaques de tête sont généralement conçues et fabriquées sur mesure pour des expériences spécifiques. La présente étude a utilisé des plaques de tête RIVETS en plastique imprimées en3D 19. De nombreux modèles de plaques de tête open source sont disponibles en ligne via Janelia, l’Institut Allen et des groupes de recherche indépendants. La procédure de plaque de tête décrite ici a été utilisée avec succès avec des plaques de tête en titane et en plastique. L’intervention chirurgicale doit être réalisée sur un instrument stéréotaxique (voir Tableau des matériaux) avec un stéréomicroscope allant de 10 à 40x grossissement. Stérilisez à froid les électrodes et la plaque frontale avec du glutaraldéhyde à 1,5 % pendant la nuit ou pendant 8 h. Rincer brièvement à l’eau stérile et laisser sécher complètement à l’air libre avant l’implantation.ATTENTION : Le glutaraldéhyde est nocif en cas d’ingestion et peut provoquer une irritation des yeux, de la peau et des voies respiratoires. Poignée avec des gants dans une hotte ventilée. Induire une anesthésie avec de l’isoflurane à 2-4 % dans de l’oxygène de qualité médicale dans une chambre d’induction jusqu’à la perte du réflexe de redressement (environ 3 min) selon les protocoles approuvés par l’établissement. Transférez l’animal dans le cône nasal mobile pour continuer à recevoir l’anesthésie. Sous anesthésie avec 2 % d’isoflurane dans de l’oxygène de qualité médicale, rasez la tête, le cou et les membres de l’animal avant la chirurgie. Effectuez toutes les étapes restantes de cette section sous anesthésie. Ajustez la dose d’isoflurane au besoin pour maintenir une fréquence respiratoire de 1 Hz et l’absence de réflexe de pincement des orteils. Appliquez du lubrifiant pour les yeux et réappliquez toutes les 1 h tout au long de la chirurgie. Administrer des analgésiques injectables (comme le carprofène, 5 mg/kg) et des antibiotiques par voie sous-cutanée (comme l’enrofloxacine, 10 mg/kg) (voir le tableau des matériaux) au début de la chirurgie. Implantez la plaque frontale en suivant les étapes suivantes ou une autre méthode approuvée par l’établissement.Fixez la tête de l’animal dans les barres d’oreille de l’instrument stéréotaxique et administrez une anesthésie (isoflurane à 2 %) par le cône nasal fixé à l’instrument stéréotaxique. Ajoutez un champ stérile pour maintenir l’asepsie. Nettoyez la tête et le cou avec des tampons de préparation à la povidone iodée et des tampons de préparation à l’alcool stériles.Réappliquez du lubrifiant pour les yeux si nécessaire. Injecter de la lidocaïne (4 mg/kg) (voir le tableau des matériaux) par voie sous-cutanée au site d’incision. Assurez-vous d’une induction anesthésique adéquate en effectuant un pincement des orteils. Si le réflexe de redressement est absent, faites une incision le long de la ligne médiane de la tête de l’animal, du bord caudal des yeux au bord caudal des oreilles. Clampez la peau à l’aide de pinces à tissu : deux sur le bord rostral de chaque côté juste derrière les yeux et deux sur le bord caudal juste derrière les oreilles. Nettoyez la surface du crâne en grattant doucement avec une lame de scalpel pour enlever le fascia séché. Appliquez une fine couche de ciment dentaire (voir Tableau des matériaux) à la surface du crâne et laissez-la sécher pendant 5 min. Positionnez la plaque frontale sur le crâne de l’animal. La manière et l’endroit où la plaque frontale est implantée varient selon la plaque frontale et la question de recherche. Utilisez du ciment dentaire pour faire adhérer la plaque de tête au crâne. Assurez-vous que le crâne est entièrement couvert. Laisser sécher le ciment dentaire pendant 10 min. Transférez l’animal dans un cône nasal mobile en plastique pour fournir une anesthésie pour le reste de la chirurgie ; Cela permettra de repositionner l’animal régulièrement pendant la chirurgie pour accéder aux différents muscles tout en maintenant l’anesthésie. Prolongez l’incision à l’arrière du cou (pratiquée lors de l’implantation de la plaque frontale) de manière à ce qu’elle atteigne 1 cm caudal jusqu’aux oreilles. À l’aide d’un grattoir à os émoussé, séparez la peau sous l’incision du cou du tissu sous-jacent pour dégager un chemin de l’incision du cou au membre antérieur, où des électrodes seront implantées. Fixez temporairement le connecteur EMG à la plaque frontale à l’aide d’un petit morceau de ruban adhésif pour le maintenir en place pendant l’implantation de l’électrode. Nettoyez les membres antérieurs de l’animal avec des tampons de préparation à la povidone iodé et des tampons de préparation à l’alcool stériles. Faites l’incision du triceps.Positionnez l’animal sur le côté, les triceps vers le haut. Injecter de la lidocaïne (4 mg/kg) au site d’incision prévu. Cela soulagera la douleur locale et gardera les muscles humides pendant l’implantation.REMARQUE : Les muscles doivent rester humides mais pas dégoulinants tout au long de la chirurgie. Appliquez localement une solution saline stérile au besoin si les muscles ou la peau semblent secs. Coupez 7 mm sur le triceps parallèlement à l’os. Séparez la peau entourant l’incision du tissu sous-jacent avec le grattoir à os émoussé. Passez le grattoir sous la peau et revenez à l’incision du cou pour dégager un chemin pour les électrodes. Coupez tout fascia qui obscurcit le muscle. Assurez-vous que le chemin du cou au triceps est suffisamment large en insérant des ciseaux fermés à travers l’incision du triceps et en poussant le trou du cou, en s’ouvrant légèrement après la sortie du trou. Amenez l’électrode du triceps à l’incision du triceps : Insérez la pointe du grand tournevis à l’aiguille à travers l’incision du triceps et hors de l’incision du cou. Fixez le tourne-aiguille autour de l’aiguille de l’électrode dans le sens de la longueur et tirez jusqu’à l’incision du triceps. Insertion de triceps : Suivez l’étape 3 « insertion d’électrodes dans les muscles ». Faites l’incision distale du bras.Positionnez l’animal sur le dos. Collez le bras le long du côté de l’animal avec sa paume vers le bas. Injecter de la lidocaïne (4 mg/kg) au site d’incision prévu. Faites une incision de 1 cm au-dessus du biceps et de l’ECR du bas du deltoïde jusqu’au milieu de l’avant-bras, parallèlement à l’os. L’extrémité distale de l’incision doit être à ~2 mm au-dessus de l’extrémité des muscles de l’avant-bras. Dégagez le fascia pour exposer le muscle biceps. Dégagez un chemin entre l’incision distale du bras et l’incision du triceps au-dessus (proximal de) le gros vaisseau sanguin qui court sous la peau du haut du bras. Enfilez l’électrode du biceps sous la peau à travers l’incision du cou jusqu’à l’incision du triceps, puis de l’incision du triceps à l’incision distale du bras. Insertion du biceps : Suivez l’étape 3 « Insertion d’électrodes dans les muscles ».Recollez le bras de l’animal dans la même position, mais avec la paume vers le bas. Insérez le plus près possible de l’extrémité proximale du biceps exposé. Pour immerger au moins 3 mm de l’électrode dans le tissu musculaire, assurez-vous de l’insérer légèrement en diagonale par rapport aux fibres musculaires en fonction de la taille de la souris. Dégagez un chemin entre l’incision du triceps et le site d’insertion du bras distal en dessous (distal) du gros vaisseau sanguin qui passe sous la peau du bras, créant ainsi un chemin distinct de celui de l’électrode du biceps. Insertion ECR : Suivez l’étape 3 « Insertion d’électrodes dans les muscles ».Insérer dans la partie la plus proximale de l’ECR. Sortez dans le pli entre ECR et son antagoniste et faites le nœud dans ce pli. Dégagez un chemin entre l’insertion du triceps et le site d’insertion du PL sous le coude. Insertion PL : Suivre l’étape 3 « insertion d’électrodes dans les muscles ».Placez l’animal sur le dos et collez son bras sur sa tête avec la paume vers le haut. Insérez juste distal par rapport au coude. Sortie suffisamment proximale aux tendons du poignet pour que le nœud au site de sortie repose sur le muscle et non sur les tendons du poignet. Repositionnez l’animal sur le côté et suturez l’incision du triceps à l’aide de sutures en soie 6-0. Repositionnez l’animal sur le dos et suturez l’incision distale du bras à l’aide de sutures en soie 6-0. Fixez le connecteur à l’arrière de la plaque frontale à l’aide de ciment dentaire. Suturez l’incision du cou à l’aide de sutures en soie 6-0. Appliquez une crème antibiotique topique sur les sites d’incision pour réduire l’inflammation. Fixez un collier élisabéthain (voir le tableau des matériaux) sur l’animal pour éviter qu’il ne perturbe les sutures pendant la convalescence. 3. Insertion d’électrodes dans les muscles Courbez légèrement l’aiguille (27 G, étape 1) en la pliant.Tenez l’aiguille avec le tourne-aiguille (voir le tableau des matériaux) et pressez-la contre la poignée d’une paire de pinces pour ajouter une courbure de 5 à 10 degrés. Ajoutez trois plis au total à différentes positions sur la longueur de l’aiguille. Visualisez où entrer et sortir du muscle. Enlevez la graisse et le fascia qui obstruent le site d’entrée et de sortie en coupant ou en tirant avec des pinces fines. Essayez d’éviter les lésions vasculaires pour limiter les saignements. Visez 3 à 5 mm de fil immergé parallèle aux fibres musculaires. Cela garantira que les tronçons exposés du fil d’électrode sont immergés dans le muscle. À l’aide du tourne-aiguille, insérez l’aiguille dans l’extrémité proximale du muscle tout en appliquant une contre-pression avec une pince incurvée émoussée dans votre autre main. Poussez l’aiguille à travers le muscle jusqu’au site de sortie. Une fois que l’aiguille sort du muscle, saisissez la pointe avec une pince émoussée et tirez l’aiguille à travers. Continuez à tirer jusqu’à ce que le nœud proximal se trouve au sommet du site d’insertion. Faites le nœud distal.À l’aide d’une pince, faites un nœud lâche distal au site de sortie. Serrez le nœud jusqu’à ce qu’il forme une boucle de 1 cm. Poussez la boucle avec une pince et positionnez-la sur le site de sortie. Visualisez l’endroit où le nœud distal doit être fermé avant d’être complètement serré, à environ 0,5 mm distal du site de sortie. Saisissez doucement la boucle avec la pince fine et pliée à cette position et tirez la boucle sur votre pince.REMARQUE : Ne serrez pas le nœud distal immédiatement sur le site de sortie dans cette étape, sinon le muscle sera serré lorsque le nœud est complètement serré à l’étape suivante. Retirez la pince fine du nœud et terminez de serrer le nœud en poussant le nœud vers le site de sortie avec la pince fine pliée et en tirant l’extrémité de l’aiguille avec les doigts. Assurez-vous que les nœuds proximaux et distaux sont correctement positionnés à l’extérieur des sites d’insertion et de sortie, respectivement, pour ancrer l’électrode insérée en place. Saisissez le nœud de sortie avec une pince droite et fine et enroulez fermement le fil distal autour de la pince pour plier le fil autour du nœud et vers le muscle/loin de la peau. Coupez le fil à 0,5 mm distal du nœud distal, en laissant un petit nœud enroulé autour du nœud.L’étape précédente permet de s’assurer que l’extrémité coupée du nœud ne pénètre pas dans la peau de l’animal, ce qui peut provoquer une irritation. 4. Soins postopératoires Immédiatement après la chirurgie, effectuez les étapes suivantes.Abritez l’animal individuellement afin que ses compagnons de cage ne dérangent pas ses sutures. Placez l’animal dans une cage propre avec une litière basse. Retirez tout matériau de nidification et d’enrichissement qui pourrait interférer avec la mobilité de l’animal lorsqu’il porte le collier élisabéthain. Donnez à l’animal de l’eau et de la nourriture humide à laquelle il peut accéder pendant qu’il porte le collier. Effectuez les étapes suivantes 24 h et 48 h après l’opération.Retirez le collier élisabéthain pour permettre à l’animal de se toiletter pendant 20 min. Induire une anesthésie avec de l’isoflurane, comme mentionné à l’étape 2.2 et à l’étape 2.3. Administrer des analgésiques et des antibiotiques injectables. Inspectez les sites d’incision pour détecter des sutures manquantes, des plaies ouvertes et des signes d’infection ou d’irritation. Remplacez les sutures et appliquez plus d’antibiotiques topiques si nécessaire. Remplacez la nourriture humide toutes les 48 h jusqu’à ce que le collier élisabéthain soit retiré. Effectuez les étapes suivantes 6 jours après l’opération.Vérifiez que les plaies sont complètement cicatrisées. Si les plaies sont fermées, retirez les sutures. Si les plaies sont ouvertes, attendez deux jours de plus pour retirer les sutures. Retirez le collier élisabéthain lorsque les sutures sont retirées. Remettez la souris dans une nouvelle cage propre avec une litière complète et un enrichissement.REMARQUE : Les animaux peuvent procéder à l’expérimentation ou à la privation d’eau 7 jours après la chirurgie.