Registrazione dell'attività muscolare degli arti anteriori in topi fissati alla testa con elettrodi EMG impiantati cronicamente
Summary
Questo protocollo descrive la fabbricazione manuale e l’impianto chirurgico di elettrodi elettromiografici (EMG) nei muscoli degli arti anteriori dei topi per registrare l’attività muscolare durante gli esperimenti di comportamento fissato alla testa.
Abstract
I potenti strumenti genetici e molecolari disponibili nella ricerca neuroscientifica sui sistemi murini hanno permesso ai ricercatori di interrogare la funzione del sistema motorio con una precisione senza precedenti in topi con testa fissa che eseguono una varietà di compiti. Le piccole dimensioni del topo rendono difficile la misurazione della potenza motoria, poiché il metodo tradizionale di registrazione elettromiografica (EMG) dell’attività muscolare è stato progettato per animali più grandi come gatti e primati. In attesa della disponibilità in commercio di elettrodi EMG per topi, l’attuale metodo gold standard per la registrazione dell’attività muscolare nei topi consiste nel realizzare internamente set di elettrodi. Questo articolo descrive un perfezionamento delle procedure consolidate per la fabbricazione manuale di un set di elettrodi, l’impianto di elettrodi nello stesso intervento chirurgico dell’impianto della piastra di testa, il fissaggio di un connettore sulla piastra di testa e l’assistenza di recupero post-operatoria. Dopo il recupero, è possibile ottenere registrazioni EMG con risoluzione al millisecondo durante il comportamento di correzione della testa per diverse settimane senza cambiamenti evidenti nella qualità del segnale. Queste registrazioni consentono una misurazione precisa dell’attività muscolare degli arti anteriori insieme alla registrazione neurale in vivo e/o alla perturbazione per sondare i meccanismi di controllo motorio nei topi.
Introduction
Negli ultimi decenni, i topi sono diventati un attraente organismo modello per lo studio del sistema motorio dei mammiferi. Gli approcci sperimentali comuni coinvolgono topi con testa fissa che eseguono compiti motori insieme al monitoraggio e/o alla perturbazione dell’attività neurale 1,2,3,4,5. Gli studi sul sistema motorio in specie più grandi (come gatti e primati) si sono tradizionalmente basati sull’elettromiografia (EMG) per misurare direttamente la potenza motoria durante tali esperimenti 6,7,8. Tuttavia, la registrazione dell’attività muscolare nei topi è difficile perché la loro muscolatura è troppo piccola per gli elettrodi EMG disponibili in commercio utilizzati negli esperimenti sui grandi mammiferi9. Molti ricercatori scelgono di tracciare la cinematica degli arti attraverso i video 4,10,11 e/o le prestazioni comportamentali 2,4,12 per sondare indirettamente l’output motorio, ma questi metodi non hanno la risoluzione per rilevare l’influenza su scala temporale dei millisecondi dell’attività neurale e della sua perturbazione sui muscoli. Pertanto, la registrazione dell’EMG è auspicabile per i ricercatori interessati al controllo neurale diretto dei muscoli.
L’EMG comporta la misurazione della tensione tra due punti, tipicamente separati da una breve distanza approssimativamente parallela alle fibre del muscolo da registrare. Gli elettrodi EMG sono disponibili in varietà di superficie (o “cerotto”) e intramuscolari (o “ago”). Gli elettrodi di superficie vengono posizionati sulla pelle o sovrapposti al tessuto muscolare e fissati con adesivo o sutura. Pertanto, gli elettrodi di superficie sono meno invasivi degli elettrodi intramuscolari e sono più popolari tra gli esseri umani, i gatti e i primati grazie alla loro relativa facilità d’uso. Gli elettrodi di superficie sono stati utilizzati con successo anche con ratti e topi13,14; Tuttavia, devono essere fabbricati a mano e impiantati chirurgicamente sotto la pelle a causa della tendenza dei roditori a cercare di rimuovere oggetti estranei durante la toelettatura. Gli elettrodi EMG intramuscolari, d’altra parte, vengono impiantati chirurgicamente all’interno del tessuto muscolare. Poiché sono inghiottiti dal tessuto muscolare, forniscono un’elevata risoluzione spaziale e rimangono fissi in posizione a tempo indeterminato. Pertanto, gli elettrodi EMG intramuscolari impiantati sono ideali su elettrodi di superficie per esperimenti a lungo termine con roditori. Per registrare in modo affidabile l’EMG intramuscolare nei topi, i ricercatori hanno sviluppato un metodo per fabbricare e impiantare a mano elettrodi EMG in muscoli piccoli come quelli dell’avambraccio di un topo adulto. Questi elettrodi consentono la registrazione muscolare cronica durante il comportamento motorio nei roditori per diverse settimane.
Il protocollo qui descritto è il risultato di un perfezionamento decennale dei metodi consolidati 15,16,17,18, che ha prodotto una procedura per la fabbricazione, l’impianto e la registrazione a mano da elettrodi EMG a filo impiantati cronicamente in coppie muscolari flessori/estensori del gomito e del polso in topi comportamentali. La prima sezione descrive la fabbricazione manuale di un set di elettrodi con quattro coppie di elettrodi e un connettore a 8 pin per l’interfaccia dello stadio principale. La sezione successiva descrive in dettaglio l’impianto chirurgico degli elettrodi per via intramuscolare nei muscoli della parte superiore e inferiore del braccio nello stesso intervento chirurgico dell’impianto della placca. Infine, vengono discusse registrazioni rappresentative di topi che eseguono una varietà di comportamenti. Nel complesso, questo metodo è un modo economico e personalizzabile per includere le misurazioni dell’attività muscolare in esperimenti di comportamento fissato alla testa, ideale per i laboratori con una certa esperienza nella fabbricazione di elettrodi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo consente registrazioni stabili dell’attività muscolare da topi fissati alla testa che eseguono una varietà di comportamenti per diverse settimane. Recentemente, questo metodo è stato impiegato per esaminare il controllo neurale della muscolatura degli arti durante comportamenti come la locomozione su tapis roulant18,20, un’attività di trazione del joystick18 e un’attività di co-contrazione21. Sebbene il protocollo qui descritto sia specifico per i muscoli del gomito e del polso del topo, è facilmente modificabile per registrare da muscoli diversi o da un numero diverso di muscoli modificando la lunghezza e/o il numero totale di coppie di elettrodi. Il metodo qui descritto è stato adattato da quelli utilizzati in precedenza per registrare l’attività muscolare degli arti anteriori e posteriori nei topi senza poggiatesta 15,16,17.
La fabbricazione di elettrodi richiede una notevole pratica per essere padroneggiata. Si consiglia una pratica quotidiana per 1-2 ore durante l’apprendimento. La spelatura degli elettrodi è la fase più impegnativa a causa del preciso livello di forza richiesto per tagliare l’isolamento senza danneggiare il filo sottostante. Questo livello di forza dipende dall’affilatura della lama, quindi la sostituzione frequente della lama del bisturi può aiutare a garantire la riproducibilità durante l’apprendimento. Anche la saldatura dei fili alle lame di ottone del connettore può essere difficile perché l’acciaio inossidabile non salda facilmente. L’applicazione di una quantità generosa di disossidante compatibile con l’acciaio inossidabile aiuta a promuovere la connessione.
La sfida principale durante l’intervento di implantologia è legare il nodo distale senza disturbare il filo impiantato o il nodo prossimale. Il nodo prossimale deve essere abbastanza grande da resistere allo scivolamento nel muscolo nel sito di inserimento, quindi evitare di legare il nodo troppo stretto nella fase 2 della fabbricazione del set di elettrodi. Se il nodo prossimale migra dopo l’impianto, utilizzare una pinza con punta in fibra di carbonio per riposizionarlo con cura. Stringere lentamente il nodo distale mantenendo una presa salda sul filo con una pinza per evitare di tirare l’intero elettrodo. Questo passaggio è fondamentale per garantire la longevità degli elettrodi impiantati: troppa tensione applicata all’elettrodo può causarne la rottura quando l’animale si muove, mentre un elettrodo allentato può spostarsi durante il recupero e perdere il contatto con il muscolo associato durante la guarigione del tessuto.
Gli animali si riprendono molto bene dall’intervento chirurgico, anche se ci sono potenziali complicazioni da notare. In primo luogo, i topi masticano le suture e gli elettrodi se ne hanno la possibilità. Mentre il collare elisabettiano lo impedisce, impedisce anche all’animale di pulirsi da solo. Alcuni topi sviluppano un accumulo di muco intorno agli occhi. Occasionalmente i topi maschi, in particolare quelli più anziani, sperimentano ostruzioni dell’uretra che possono essere angoscianti per l’animale. Lasciare che l’animale si pulisca da solo per 20 minuti al giorno prima di ispezionare i punti di sutura dovrebbe dare all’animale abbastanza tempo per prevenire questi problemi.
Ci sono importanti limitazioni di questo metodo da notare. In primo luogo, questi elettrodi personalizzati generalmente non sono in grado di risolvere l’attività di una singola unità motore. Inoltre, non è garantito che il segnale elettrico provenga esclusivamente da un muscolo specifico (ad esempio, i bicipiti), poiché è difficile escludere la diafonia dall’attività nei muscoli sinergici vicini. Pertanto, nelle pubblicazioni, i ricercatori si riferiscono comunemente ai muscoli registrati in base al loro gruppo di sinergia (ad esempio, flessore del gomito). Si consiglia di eseguire dissezioni post-mortem dopo ogni esperimento per verificare la posizione di ciascun elettrodo, poiché potrebbero spostarsi nel tessuto durante il recupero.
I ricercatori interessati all’attività di una singola unità motoria dovrebbero prendere in considerazione la possibilità di provare elettrodi EMG di nuova concezione sviluppati dal Center for Advanced Motor Bioengineering Research (CAMBER) della Emory University. Questi elettrodi sono ancora in fase di sviluppo, ma CAMBER fornirà l’ultimo design di elettrodi. Lo svantaggio principale di questi elettrodi è la longevità: gli elettrodi fabbricati a mano descritti in questo protocollo consentono generalmente registrazioni per diverse settimane, mentre gli elettrodi CAMBER funzionano meglio per esperimenti a breve termine. I ricercatori che scelgono un metodo di registrazione EMG possono contattare direttamente CAMBER per determinare se i loro elettrodi saranno adatti per un determinato esperimento.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Claire Warriner per aver contribuito allo sviluppo di questo metodo. Mark Agrios e Sajishnu Savya hanno assistito alla preparazione delle figure. Questa ricerca è stata supportata da un Searle Scholar Award, una Sloan Research Fellowship, una Simons Collaboration on the Global Brain Pilot Award, un Whitehall Research Grant Award, The Chicago Biomedical Consortium con il supporto dei Searle Funds presso il Chicago Community Trust, NIH grant DP2 NS120847 (A.M.) e NIH grant 2T32MH067564 (A.K.).
Materials
| #11 Scalpel Blades | World Precision Instruments | 504170 | For EMG electrode fabrication |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | For EMG electrode fabrication |
| 1 mL Sub-Q Syringe (100 pack) | Becton Dickinson | 309597 | For administering injectable drugs |
| 12-pin connector | Newark | 33AC2371 | 12-pin connector with brass fittings; for EMG electrode fabrication |
| 18 G Needles | Exel International | 26419 | For EMG electrode fabrication |
| 27 G Needles | Exel International | 26426 | For EMG electrode fabrication |
| 3 M Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-0 | For taping animal's limbs out during surgery |
| 6-0 silk sutures | Henry Schein | 101-2636 | These sutures work well with delicate skin around the wrists |
| C&B Metabond Complete Kit | Pearson Dental | P16-0126 | Dental cement to affix connector to headplate |
| C57BL6/J Mice | Jackson Laboratories | #000664 | Wild type mice |
| Carbofib 5-CF Tweezers (2) | Aven tools | 18762 | Carbon fiber tipped forceps, used to manipulate delicate parts of electrode (stripped or inserted sections) |
| Carprodyl (Carprofen) 50 mg/mL Injection | Ceva Animal Health, LLC | G43010B | Injectable analgesic for pain management during and after surgery |
| Castroviejo Micro Needle Holder | Fine science tools | 12060-01 | For suturing |
| Castroviejo Needle Holder (large) | Fine science tools | 12565-14 | For inserting needle into muscle |
| Delicate Bone Scraper | Fine science tools | 10075-16 | To separate skin from underlying tissue |
| Dietgel 76A Dietary Supplement | Clear H2O | 72-07-5022 | For post-operative care |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine science tools | 11251-35 | To remove fascia overlying muscle |
| Elizabethan collar for mouse | Kent Scientific Corporation | EC201V-10 | For post-operative care |
| Enrofloxacin 2.27% | Covetrus | #074743 | Injectable antibiotic for use during and after surgery |
| Epoxy gel | Devcon | 14265 | For EMG electrode fabrication |
| Hopkins Bulldog Clamp (4) | Stoelting | 10-000-481 | Tissue clamps for headplate implantation |
| Isoflurane Solution | Covetrus | 11695067771 | Inhalable anesthesia |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable – 2% | Covetrus | #002468 | Topical analgesic for pain management during surgery |
| Medical Grade Oxygen | Airgas | OX USP200 | For administering isoflurane during surgery |
| MetriCide 1 Gallon | Metrex | 10-1400 | Glutaraldehyde solution for cold-sterilization of headplate and electrodes |
| MetriTest Strips 1.5% | Metrex | 10-303 | Test strips for monitoring glutaraldehyde solution (recommended) |
| Model 900LS Small Animal Stereotaxic Instrument | Kopf Instruments | 900LS | Stereotax with lazy susan feature that allows platform rotation during surgery |
| PFA-coated 0.0055" braided stainless steel wire | A-M systems | 793200 | For EMG electrode fabrication |
| Povidone-iodine prep pads | Dynarex | 1108 | For cleaning skin |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 37327 | Eye ointment for surgery |
| Sterile alcohol prep pads | Dynarex | 1113 | For cleaning skin |
| Straight fine #5 forceps | Fine science tools | 11295-10 | For curling wire after insertion |
| Straight fine scissors | Fine science tools | 14060-11 | For cutting wire |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 91500-09 | For making incisions, trimming fat and fascia, and suturing |
| Technik Tweezers 7B-SA (2) | Aven tools | 18074USA | Curved blunt forceps, for general use during surgery |
| Triple Antibiotic Ointment | Walgreens | 975863 | Topical antibiotic for surgery |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | Contains all necessary equipment for anesthesia induction and scavenging including vaporizer, induction chamber, moveable plastic nose cone, and tubing |
References
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