רישום פעילות שרירי הפורלימב בעכברים עם ראש קבוע עם אלקטרודות EMG מושתלות כרוניות
Summary
פרוטוקול זה מתאר ייצור ידני והשתלה כירורגית של אלקטרודות אלקטרומיוגרפיות (EMG) בשרירי הגפיים הקדמיות של עכברים כדי לרשום את פעילות השרירים במהלך ניסויי התנהגות קבועים בראש.
Abstract
כלים גנטיים ומולקולריים רבי עוצמה הזמינים במחקר מדעי המוח של מערכות עכברים אפשרו לחוקרים לחקור את תפקוד המערכת המוטורית בדיוק חסר תקדים בעכברים עם ראש קבוע המבצעים מגוון משימות. גודלו הקטן של העכבר מקשה על מדידת התפוקה המוטורית, שכן השיטה המסורתית של רישום אלקטרומיוגרפי (EMG) של פעילות השרירים תוכננה עבור בעלי חיים גדולים יותר כמו חתולים ופרימטים. בהמתנה לאלקטרודות EMG זמינות מסחרית עבור עכברים, השיטה הנוכחית הסטנדרטית לרישום פעילות שרירים בעכברים היא ליצור ערכות אלקטרודות בתוך החברה. מאמר זה מתאר חידוד של נהלים מבוססים לייצור ידני של סט אלקטרודות, השתלת אלקטרודות באותו ניתוח כמו השתלת לוחית ראש, קיבוע מחבר על לוחית הראש וטיפול התאוששות לאחר הניתוח. לאחר ההתאוששות, ניתן לקבל הקלטות EMG ברזולוציה של אלפיות השנייה במהלך התנהגות קבועה של ראש במשך מספר שבועות ללא שינויים ניכרים באיכות האות. רישומים אלה מאפשרים מדידה מדויקת של פעילות שרירי הגפיים הקדמיות לצד רישום עצבי in vivo ו/או הפרעה כדי לבחון מנגנוני שליטה מוטורית בעכברים.
Introduction
בעשורים האחרונים הפכו עכברים לאורגניזם מודל אטרקטיבי לחקר המערכת המוטורית של יונקים. גישות ניסיוניות נפוצות כוללות עכברים קבועי ראש המבצעים משימות מוטוריות לצד ניטור ו / או הפרעה של פעילות עצבית 1,2,3,4,5. מחקרי מערכות מוטוריות במינים גדולים יותר (כגון חתולים ופרימטים) הסתמכו באופן מסורתי על אלקטרומיוגרפיה (EMG) כדי למדוד את תפוקת המנוע ישירות במהלך ניסויים כאלה 6,7,8. עם זאת, רישום פעילות השרירים בעכברים מאתגר מכיוון שהשרירים שלהם קטנים מדי עבור אלקטרודות EMG זמינות מסחרית המשמשות בניסויים ביונקים גדולים9. חוקרים רבים בוחרים לעקוב אחר קינמטיקה של הגפיים באמצעות וידאו 4,10,11 ו / או ביצועים התנהגותיים 2,4,12 כדי לחקור את התפוקה המוטורית בעקיפין, אך שיטות אלה חסרות את הרזולוציה כדי לזהות את ההשפעה בקנה מידה של אלפית השנייה של פעילות עצבית והפרעה שלה על השרירים. לפיכך, רישום EMG רצוי לחוקרים המעוניינים בשליטה עצבית ישירה על השרירים.
EMG כרוך במדידת המתח בין שתי נקודות, המופרדות בדרך כלל על ידי מרחק קצר בערך במקביל לסיבי השריר המוקלטים. אלקטרודות EMG מגיעות בזנים פני שטח (או “טלאי”) ותוך שריריים (או “מחט”). אלקטרודות פני השטח ממוקמות על גבי העור או מונחות על רקמת השריר ומאובטחות באמצעות דבק או תפירה. ככאלה, אלקטרודות פני השטח פחות פולשניות מאלקטרודות תוך שריריות והן פופולריות ביותר בקרב בני אדם, חתולים ופרימטים בשל קלות השימוש היחסית שלהן. אלקטרודות פני השטח שימשו בהצלחה גם עם חולדות ועכברים13,14; עם זאת, הם חייבים להיות מפוברקים ביד ומושתל בניתוח מתחת לעור בשל הנטייה של מכרסמים לנסות להסיר חפצים זרים בזמן הטיפוח. אלקטרודות EMG תוך שריריות, לעומת זאת, מושתלות בניתוח בתוך רקמת השריר. מכיוון שהם נבלעים ברקמת שריר, הם מספקים רזולוציה מרחבית גבוהה ונשארים קבועים במקומם ללא הגבלת זמן. לפיכך, אלקטרודות EMG תוך שריריות מושתלות אידיאליות על פני השטח לניסויים ארוכי טווח באמצעות מכרסמים. כדי לתעד EMG תוך שרירי באופן אמין בעכברים, חוקרים פיתחו שיטה לייצור ידני והשתלת אלקטרודות EMG בשרירים קטנים כמו אלה שבאמה של עכבר בוגר. אלקטרודות אלו מאפשרות רישום שרירים כרוני במהלך התנהגות מוטורית במכרסמים במשך מספר שבועות.
הפרוטוקול המתואר כאן הוא תוצאה של שכלול בן עשור של שיטות מבוססות 15,16,17,18, אשר הניב הליך לייצור ידני, השתלה והקלטה מאלקטרודות EMG חוטיות שהושתלו באופן כרוני בזוגות שרירים מכופפים/מרחיבים של המרפק ושורש כף היד בעכברים מתנהגים. החלק הראשון מתאר ייצור ידני של סט אלקטרודות עם ארבעה זוגות אלקטרודות ומחבר בן 8 פינים לממשק שלב הראש. החלק הבא מפרט את ההשתלה הכירורגית של האלקטרודות תוך שרירית בשרירי הזרוע העליונה והתחתונה באותו ניתוח כמו השתלת לוחית ראש. לבסוף, נדונות הקלטות מייצגות של עכברים המבצעים מגוון התנהגויות. בסך הכל, שיטה זו היא דרך חסכונית וניתנת להתאמה אישית לכלול מדידות פעילות שרירים בניסויי התנהגות קבועים בראש, שהיא אידיאלית עבור מעבדות עם ניסיון כלשהו בייצור אלקטרודות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מאפשר רישום פעילות שרירים יציבה מעכברים קבועי ראש המבצעים מגוון התנהגויות במשך מספר שבועות. לאחרונה נעשה שימוש בשיטה זו כדי לבחון שליטה עצבית בשרירי הגפיים במהלך התנהגויות כגון תנועת הליכון 18,20, משימת משיכת ג’ויסטיק18 ומשימת כיווץ משותף21. בעוד שהפרוטוקול המתואר כאן הוא ספציפי לשרירי מרפק עכבר ושורש כף היד, ניתן לשנות אותו בקלות כדי להקליט משרירים שונים או ממספר שונה של שרירים על ידי שינוי האורך ו / או המספר הכולל של זוגות אלקטרודות. השיטה המתוארת כאן הותאמה מאלו ששימשו בעבר לרישום פעילות שרירי הגפיים הקדמיות והאחוריות בעכברים ללא ריסון ראש 15,16,17.
ייצור אלקטרודות דורש תרגול משמעותי כדי לשלוט. תרגול יומי במשך 1-2 שעות מומלץ בזמן הלמידה. הפשטת האלקטרודות היא השלב המאתגר ביותר בשל רמת הכוח המדויקת הנדרשת כדי לחתוך את הבידוד מבלי לפגוע בחוט התחתון. רמת כוח זו תלויה בחדות הלהב, ולכן החלפה תכופה של להב האזמל יכולה לסייע בהבטחת יכולת השחזור במהלך הלמידה. הלחמה של החוטים ללהבי הפליז של המחבר יכולה גם להיות קשה מכיוון שנירוסטה אינה מלחימה בקלות. מריחת כמות נדיבה של שטף תואם נירוסטה מסייעת לקדם את החיבור.
האתגר העיקרי במהלך ניתוח ההשתלה הוא קשירת הקשר הדיסטלי מבלי להפריע לחוט המושתל או לקשר הפרוקסימלי. הקשר הפרוקסימלי חייב להיות גדול מספיק כדי להתנגד להחלקה לתוך שריר באתר ההחדרה – ולכן, הימנע מקשירת הקשר חזק מדי בשלב 2 של ייצור מערך האלקטרודות. אם הקשר הפרוקסימלי נודד לאחר ההשתלה, השתמש במלקחיים עם קצוות סיבי פחמן כדי למקם אותו מחדש בזהירות. הדקו את הקשר הדיסטלי באיטיות תוך שמירה על אחיזה איתנה בחוט בעזרת מלקחיים כדי למנוע משיכת האלקטרודה כולה. שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח את תוחלת החיים של אלקטרודות מושתלות: מתח רב מדי המופעל על האלקטרודה יכול לגרום לה להישבר כאשר החיה זזה, בעוד אלקטרודה רופפת יכולה להשתנות במהלך ההתאוששות ולאבד מגע עם השריר הקשור אליה כאשר הרקמה מחלימה.
בעלי חיים מתאוששים בצורה מרשימה מהניתוח, אם כי ישנם סיבוכים פוטנציאליים שיש לשים לב אליהם. ראשית, עכברים ילעסו את התפרים והאלקטרודות שלהם אם תינתן להם ההזדמנות. בעוד שהקולר האליזבתני מונע זאת, הוא גם מונע מהחיה לטפח את עצמה. חלק מהעכברים מפתחים הצטברות דמוית ריר סביב עיניהם. עכברים זכרים מזדמנים, במיוחד מבוגרים, חווים חסימות בשופכה שעלולות לגרום למצוקה לחיה. מתן אפשרות לבעל החיים לטפח את עצמו במשך 20 דקות בכל יום לפני בדיקת התפרים אמור לתת לבעל החיים מספיק זמן כדי למנוע בעיות אלה.
ישנן מגבלות חשובות של שיטה זו לציין. ראשית, אלקטרודות מותאמות אישית אלה בדרך כלל אינן יכולות לפתור פעילות של יחידה מוטורית יחידה. יתר על כן, לא מובטח שהאות החשמלי ינבע אך ורק משריר מסוים (כלומר, שרירי הזרוע), שכן קשה לשלול דיבור צולב מפעילות בשרירים סינרגטיים סמוכים. לכן, בפרסומים, החוקרים מתייחסים בדרך כלל לשרירים המתועדים על ידי קבוצת הסינרגיה שלהם (כלומר, כופפי המרפק). מומלץ לבצע דיסקציות לאחר המוות לאחר כל ניסוי כדי לאמת את המיקום של כל אלקטרודה, שכן הם יכולים לזוז ברקמה במהלך ההתאוששות.
חוקרים המעוניינים בפעילות יחידה מוטורית יחידה אחת צריכים לשקול לנסות אלקטרודות EMG שפותחו לאחרונה על ידי המרכז למחקר ביו-הנדסי מוטורי מתקדם (CAMBER) באוניברסיטת אמורי. אלקטרודות אלה עדיין בפיתוח, אך CAMBER תספק את עיצוב האלקטרודות העדכני ביותר. החיסרון העיקרי של אלקטרודות אלה הוא אריכות ימים: האלקטרודות המיוצרות ביד המתוארות בפרוטוקול זה מאפשרות בדרך כלל הקלטות במשך מספר שבועות, בעוד שאלקטרודות CAMBER פועלות בצורה הטובה ביותר לניסויים קצרי טווח. חוקרים הבוחרים שיטת רישום EMG יכולים ליצור קשר ישירות עם CAMBER כדי לקבוע אם האלקטרודות שלהם יתאימו לניסוי נתון.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לד”ר קלייר וורינר על תרומתה לפיתוח שיטה זו. מארק אגריוס וסג’ישנו סביה סייעו בהכנת דמויות. מחקר זה נתמך על ידי פרס Searle Scholar, מלגת מחקר סלואן, שיתוף פעולה של סימונס על פרס טייס המוח העולמי, פרס מענק מחקר Whitehall, הקונסורציום הביו-רפואי של שיקגו בתמיכת קרנות סירל בקרן הקהילה של שיקגו, מענק NIH DP2 NS120847 (A.M.), ומענק NIH 2T32MH067564 (A.K).
Materials
| #11 Scalpel Blades | World Precision Instruments | 504170 | For EMG electrode fabrication |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | For EMG electrode fabrication |
| 1 mL Sub-Q Syringe (100 pack) | Becton Dickinson | 309597 | For administering injectable drugs |
| 12-pin connector | Newark | 33AC2371 | 12-pin connector with brass fittings; for EMG electrode fabrication |
| 18 G Needles | Exel International | 26419 | For EMG electrode fabrication |
| 27 G Needles | Exel International | 26426 | For EMG electrode fabrication |
| 3 M Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-0 | For taping animal's limbs out during surgery |
| 6-0 silk sutures | Henry Schein | 101-2636 | These sutures work well with delicate skin around the wrists |
| C&B Metabond Complete Kit | Pearson Dental | P16-0126 | Dental cement to affix connector to headplate |
| C57BL6/J Mice | Jackson Laboratories | #000664 | Wild type mice |
| Carbofib 5-CF Tweezers (2) | Aven tools | 18762 | Carbon fiber tipped forceps, used to manipulate delicate parts of electrode (stripped or inserted sections) |
| Carprodyl (Carprofen) 50 mg/mL Injection | Ceva Animal Health, LLC | G43010B | Injectable analgesic for pain management during and after surgery |
| Castroviejo Micro Needle Holder | Fine science tools | 12060-01 | For suturing |
| Castroviejo Needle Holder (large) | Fine science tools | 12565-14 | For inserting needle into muscle |
| Delicate Bone Scraper | Fine science tools | 10075-16 | To separate skin from underlying tissue |
| Dietgel 76A Dietary Supplement | Clear H2O | 72-07-5022 | For post-operative care |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine science tools | 11251-35 | To remove fascia overlying muscle |
| Elizabethan collar for mouse | Kent Scientific Corporation | EC201V-10 | For post-operative care |
| Enrofloxacin 2.27% | Covetrus | #074743 | Injectable antibiotic for use during and after surgery |
| Epoxy gel | Devcon | 14265 | For EMG electrode fabrication |
| Hopkins Bulldog Clamp (4) | Stoelting | 10-000-481 | Tissue clamps for headplate implantation |
| Isoflurane Solution | Covetrus | 11695067771 | Inhalable anesthesia |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable – 2% | Covetrus | #002468 | Topical analgesic for pain management during surgery |
| Medical Grade Oxygen | Airgas | OX USP200 | For administering isoflurane during surgery |
| MetriCide 1 Gallon | Metrex | 10-1400 | Glutaraldehyde solution for cold-sterilization of headplate and electrodes |
| MetriTest Strips 1.5% | Metrex | 10-303 | Test strips for monitoring glutaraldehyde solution (recommended) |
| Model 900LS Small Animal Stereotaxic Instrument | Kopf Instruments | 900LS | Stereotax with lazy susan feature that allows platform rotation during surgery |
| PFA-coated 0.0055" braided stainless steel wire | A-M systems | 793200 | For EMG electrode fabrication |
| Povidone-iodine prep pads | Dynarex | 1108 | For cleaning skin |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 37327 | Eye ointment for surgery |
| Sterile alcohol prep pads | Dynarex | 1113 | For cleaning skin |
| Straight fine #5 forceps | Fine science tools | 11295-10 | For curling wire after insertion |
| Straight fine scissors | Fine science tools | 14060-11 | For cutting wire |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 91500-09 | For making incisions, trimming fat and fascia, and suturing |
| Technik Tweezers 7B-SA (2) | Aven tools | 18074USA | Curved blunt forceps, for general use during surgery |
| Triple Antibiotic Ointment | Walgreens | 975863 | Topical antibiotic for surgery |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | Contains all necessary equipment for anesthesia induction and scavenging including vaporizer, induction chamber, moveable plastic nose cone, and tubing |
References
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large scale neural activity with cellular resolution in awake mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Guo, Z. V., et al. Flow of cortical activity underlying a tactile decision in mice. Neuron. 81 (1), 179-194 (2014).
- Guo, J. Z., et al. Cortex commands the performance of skilled movement. eLife. 4, e10774 (2015).
- Morandell, K., Huber, D. The role of forelimb motor cortex areas in goal directed action in mice. Sci Rep. 7 (1), 15759 (2017).
- Galiñanes, G. L., Bonardi, C., Huber, D. Directional reaching for water as a cortex-dependent behavioral framework for mice. Cell Rep. 22 (10), 2767-2783 (2018).
- Evarts, E. V., Tanji, J. Reflex and intended responses in motor cortex pyramidal tract neurons of monkey. J Neurophysiol. 39 (5), 1069-1080 (1976).
- Hounsgaard, J., Hultborn, H., Jespersen, B., Kiehn, O. Bistability of alpha-motoneurones in the decerebrate cat and in the acute spinal cat after intravenous 5-hydroxytryptophan. J Physiol. 405, 345-367 (1988).
- Murphy, P. R., Hammond, G. R. The role of cutaneous afferents in the control of gamma-motoneurones during locomotion in the decerebrate cat. J Physiol. 434, 529-547 (1991).
- Manuel, M., Chardon, M., Tysseling, V., Heckman, C. J. Scaling of motor output, from mouse to humans. Physiol Bethesda Md. 34 (1), 5-13 (2019).
- Sauerbrei, B. A., et al. Cortical pattern generation during dexterous movement is input-driven. Nature. 577 (7790), 386-391 (2020).
- Barrett, J. M., Raineri Tapies, M. G., Shepherd, G. M. G. Manual dexterity of mice during food-handling involves the thumb and a set of fast basic movements. PLoS One. 15 (1), e0226774 (2020).
- Serradj, N., et al. Task-specific modulation of corticospinal neuron activity during motor learning in mice. Nat Commun. 14, 2708 (2023).
- Scholle, H. C., et al. Spatiotemporal surface EMG characteristics from rat triceps brachii muscle during treadmill locomotion indicate selective recruitment of functionally distinct muscle regions. Exp Brain Res. 138 (1), 26-36 (2001).
- Scholle, H. C., et al. Kinematic and electromyographic tools for characterizing movement disorders in mice. Mov Disord off J Mov Disord Soc. 25 (3), 265-274 (2010).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. J Neurosci Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Akay, T., Acharya, H. J., Fouad, K., Pearson, K. G. Behavioral and electromyographic characterization of mice lacking EphA4 receptors. J Neurophysiol. 96 (2), 642-651 (2006).
- Akay, T., Tourtellotte, W. G., Arber, S., Jessell, T. M. Degradation of mouse locomotor pattern in the absence of proprioceptive sensory feedback. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (47), 16877-16882 (2014).
- Miri, A., et al. Behaviorally selective engagement of short-latency effector pathways by motor cortex. Neuron. 95 (3), 683-696 (2017).
- Osborne, J., Dudman, J. RIVETS: A mechanical system for in vivo and in vitro electrophysiology and imaging. PloS One. 9 (2), e89007 (2014).
- Santuz, A., Laflamme, O. D., Akay, T. The brain integrates proprioceptive information to ensure robust locomotion. J Physiol. 600 (24), 5267-5294 (2022).
- Warriner, C. L., Fageiry, S., Saxena, S., Costa, R. M., Miri, A. Motor cortical influence relies on task-specific activity covariation. Cell Rep. 40, 111427 (2022).
