Registratie van spieractiviteit van de voorpoten bij muizen die op het hoofd zijn gefixeerd met chronisch geïmplanteerde EMG-elektroden

Alle experimenten en procedures werden uitgevoerd volgens de NIH-richtlijnen en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Northwestern University. Andere landen en/of instellingen kunnen andere regelgeving hebben die wijzigingen in deze procedure vereisen. De dieren die in dit onderzoek werden opgenomen, waren volwassen mannen uit C57BL6/J (zie materiaaltabel) van 12-20 weken met een minimaal lichaamsgewicht van 20 g. 1. Fabricage van elektrodesets OPMERKING: Voer deze stappen uit op een schoon werkblad met behulp van een stereomicroscoop met een vergrotingsbereik van 10x-40x en schone, blote handen. Zie afbeelding 1 voor schema’s met details over het strippen van de elektrodedraad (Figuur 1A) en de montage van de connector (Figuur 1B). Draden doorknippen: Knip voor elk elektrodepaar twee stukken PFA-gecoate gevlochten roestvrijstalen draad (7-aderigs, 0.0055″ diameter) af (zie Materiaaltabel). Knip voor de bovenarmspieren elke draad 9,5 cm lang af. Knip voor de onderarmspieren elke draad 10,5 cm lang af. Bind de twee draden aan elkaar met een enkele knoop – dit wordt de knoop die net buiten de inbrengplaats (proximale knoop) zit wanneer deze wordt geïmplanteerd. De gebonden draden bestaan uit één elektrodepaar.Gebruik een naald van 18 G die in een stuk golfkarton wordt gestoken, plaats de knoop op 6 cm van het insteekuiteinde en draai deze vast rond de naald door de elektrodestrengen tegen het karton te trekken. Het insteekuiteinde krimpt tot ongeveer 5,5 cm, terwijl de resterende 0,5 cm in de knoop wordt vastgebonden. Verwijder voorzichtig de naald en trek de knoop twee keer met blote handen strak om hem verder aan te spannen.OPMERKING: De knoop mag niet zo strak mogelijk zijn; Als u deze manier aanspant, ontstaat er een proximale knoop die de juiste maat heeft om de geïmplanteerde elektroden in het weefsel te verankeren. Zorg er voor de bovenarmspieren voor dat de uiteinden van de connector 3.5 cm lang zijn. Zorg er voor de onderarmspieren voor dat de uiteinden van de connector 4.5 cm lang zijn. Strip 0,5 mm isolatie van elke draad: 1-1,5 mm van de knoop op de ene draad en 2-2,5 mm van de knoop op de andere draad. Figuur 1 illustreert waar elke draad moet worden gestript.Plak de elektrode strak tegen een stuk plat karton met de twee einddraden van de connector aan elkaar en de insteekeinddraden uit elkaar. Maak met een scalpel inkepingen in de isolatie en markeer de uiteinden waar de isolatie zal worden verwijderd. Maak bij elke inkeping een reeks van ~6 sneden met een scalpelmesje bij elke inkeping: ~2 bovenop, ~2 aan de zijkant en ~2 onder de draad.NOTITIE: Het is van cruciaal belang om de draad zelf niet te veel door te knippen. Anders kunnen de lokken breken. Er is oefening nodig om de juiste hoeveelheid druk te bereiken om de isolatie volledig door te snijden met beperkte schade aan de draad. Draai het elektrodepaar 180 graden en herhaal de 6 sneden in elke inkeping. Plaats indien nodig extra sneden om de 0.5 mm isolatie te scheiden van de onderliggende draad. Het aantal sneden dat hier nodig is, is afhankelijk van de uitgeoefende druk en de scherpte van het scalpelmesje. Snijd het scalpelmesje onder een hoek langs de losgeraakte isolatie en verwijder het met een pincet van de draad. Inspecteer de blootliggende draad op breuk en/of gerafelde isolatie die schade kan veroorzaken tijdens het inbrengen in het weefsel. Strip 1 mm van het uiteinde van elke draad aan het uiteinde van de connector. Strip 5 mm van het uiteinde van elke draad aan het insteekuiteinde. Draai de segmenten van de insteekdraad in elkaar en krimp de blootliggende uiteinden van 5 mm samen in de as van een 0.5 inch. 27 G naald. Typische injectienaalden kunnen worden gebruikt na het verwijderen van het luer lock-einde. Herhaal stap 1.1-1.6 voor elk elektrodepaar. Monteer de connector.Knip het vrouwelijke uiteinde van de 12-pins connector (zie Materiaaltabel) op maat: # elektrodeparen x 2-pins sleuven. Verwijder de messing fittingen van elke connectorpoort (deze zijn vooraf bevestigd aan de 12-pins connector) voorzichtig met een tang. Bewaar deze fittingen voor de volgende stap. Soldeer elk blootliggend uiteinde van 1 mm van elke draad aan het buitenoppervlak van een van de bladen van een messing fitting.LET OP: Bij solderen komen dampen vrij die huid-, oog- en ademhalingsirritatie kunnen veroorzaken. Draag handschoenen (of was daarna uw handen), gebruik oogbescherming en gebruik een plaatselijk rookafzuigapparaat om de blootstelling te beperken.Zet de messing fitting vast in een tandeloze krokodillenklem die is bevestigd aan een helpend handgereedschap met de buitenkant van een van de messen naar boven gericht. Plaats de fitting onder de microscoop om een hoge visuele controle tijdens het solderen mogelijk te maken. Gebruik een uitgevouwen paperclip of een stuk schrootdraad om een kleine hoeveelheid roestvrijstalen compatibele flux op het oppervlak van het mes te deppen. Breng voldoende soldeer aan op het mes om de onderste ~1.5 mm van het messing mes te bedekken met behulp van een smalle conische soldeerpunt.OPMERKING: Te veel soldeer hier zal de montage van de connector verstoren, terwijl te weinig soldeer een ontoereikende verbinding kan achterlaten. Zorg dat er extra messing fittingen beschikbaar zijn om indien nodig opnieuw te beginnen. Smeer het oppervlak van het soldeer op het mes royaal in met roestvrijstalen vloeimiddel, maar voorkom dat er vloeimiddel in de ruimte tussen de twee bladen druppelt. Houd de 1 mm blootliggende elektrodedraad vlak tegen het soldeer op het mes en verwarm het soldeer met het strijkijzer om de verbinding te smelten. Inspecteer de verbinding: Het grootste deel van de blootliggende draad moet worden ondergedompeld in het soldeer en de draad moet stevig aan de messing fitting worden bevestigd. Zorg ervoor dat er geen soldeer tussen de twee bladen van de messing fitting is terechtgekomen – dit kan het later moeilijk maken om een mannelijke connector te plaatsen. Zorg er ten slotte voor dat de verbinding gelijk ligt met het messing messing, zodat de fitting in de volgende stap weer in de connector kan worden gestoken. Gebruik een rechte pincet om elke gesoldeerde messing fitting terug in de connector te plaatsen en zorg ervoor dat de draden van elk elektrodepaar naast elkaar liggen en niet in de knoop raken met andere elektrodeparen. Zie afbeelding 1B om de oriëntatie van een enkel elektrodepaar in de connector te visualiseren.OPMERKING: De ideale oriëntatie van links naar rechts is: biceps (3,5 mm aan het uiteinde van de connector), triceps (3,5 mm aan het uiteinde van de connector), extensor carpi radialis (ECR; 4,5 mm aan het uiteinde van de connector) en palmaris longus (PL; 4,5 mm aan het uiteinde van de connector). Markeer één kant met een stift of white-out om de oriëntatie van de connector tijdens de implantatie bij te houden. Knip een mannelijke 12-pins connector af tot dezelfde grootte (# elektrodeparen x 2) als het vrouwelijke uiteinde en sluit deze aan op de vrouwelijke connector. Als fittingen zijn verplaatst, kunnen ze met een rechte tang opnieuw worden ingebracht nadat de mannelijke connector is geplaatst. Verwijder de lipjes die uit de messing fittingen komen met een tang. Smeer de pinsleuven in met epoxy en zorg ervoor dat al het metaal of de draad in de buurt van de connector wordt geïsoleerd van weefsel.LET OP: Epoxy kan bij langdurige blootstelling huid-, oog- en ademhalingsirritatie veroorzaken. Draag handschoenen, oogbescherming en gebruik epoxy alleen in een goed geventileerde ruimte of onder een plaatselijk rookafzuigapparaat. Laat de connector minimaal 30 minuten aan de lucht drogen. Test de weerstand van elk elektrodepaar en label naalden met kleine gekleurde krimpsegmenten voor eenvoudige identificatie tijdens de operatie.NOTITIE: De weerstand moet tussen 18-50 ohm liggen. Een lagere weerstand kan duiden op kortsluiting. Een hogere weerstand kan duiden op te veel schade aan de draadstrengen. Een hoge weerstand komt echter vaak voort uit een onvolmaakte verbinding tussen de naaldas en de draad (gemaakt in stap 1.6), wat kan worden opgelost door extra krimpen op deze kruising. Zorg ervoor dat de elektrodeset vrij is van vezels en ander vuil voordat u deze implanteert. Hiervoor kan een spuitbus worden gebruikt. Inspecteren onder de microscoop kan nuttig zijn om te verifiëren. 2. Implantatie van elektroden chirurgie OPMERKING: Dit gedeelte beschrijft een enkele chirurgische ingreep om een hoofdplaat en elektroden die in het vorige gedeelte zijn vervaardigd, te implanteren in de triceps, biceps, extensor carpi radialis (ECR) en palmaris longus (PL). Voor de laatste twee spieren is het erg moeilijk om de elektrode uitsluitend in deze individuele spieren te implanteren zonder door nabijgelegen synergistische spieren te gaan. Zie de onderstaande discussie over de kanttekeningen bij het proberen om opnames van individuele spieren te isoleren. Kopplaten worden meestal op maat ontworpen en gefabriceerd voor specifieke experimenten. In de huidige studie is gebruik gemaakt van 3D-geprinte plastic RIVETS-kopplaten19. Veel open-source kopplaatontwerpen zijn online beschikbaar via Janelia, het Allen Institute en onafhankelijke onderzoeksgroepen. De hier beschreven kopplaatprocedure is met succes toegepast met titanium en kunststof kopplaten. De chirurgische ingreep moet worden uitgevoerd op een stereotaxisch instrument (zie Materiaaltabel) met een stereomicroscoop met een vergroting van 10-40x. Steriliseer de elektroden en de kopplaat koud met 1,5% glutaaraldehyde ‘s nachts of gedurende 8 uur. Spoel kort af in steriel water en laat volledig aan de lucht drogen voordat u implanteert.LET OP: Glutaaraldehyde is schadelijk bij inslikken en kan irritatie van de ogen, huid en luchtwegen veroorzaken. Hanteer met handschoenen in een geventileerde zuurkast. Induceer anesthesie met 2-4% isofluraan in zuurstof van medische kwaliteit in een inductiekamer tot verlies van de oprichtreflex (ongeveer 3 minuten) volgens institutioneel goedgekeurde protocollen. Breng het dier over naar de beweegbare neuskegel om de anesthesie voort te zetten. Onder narcose met 2% isofluraan in zuurstof van medische kwaliteit, scheer het hoofd, de nek en de ledematen van het dier voorafgaand aan de operatie. Voer alle overige stappen in dit gedeelte uit onder narcose. Pas de dosering van isofluraan indien nodig aan om een ademhalingsfrequentie van 1 Hz en de afwezigheid van een teenknijpreflex te behouden. Breng oogsmeermiddel aan en breng tijdens de operatie elke 1 uur opnieuw aan. Injecteerbare pijnstillers (zoals carprofen, 5 mg/kg) en antibiotica (zoals enrofloxacine, 10 mg/kg) subcutaan toedienen (zie Materiaaltabel) aan het begin van de operatie. Implanteer de hoofdplaat met behulp van de volgende stappen of een alternatieve, door de instelling goedgekeurde methode.Zet de kop van het dier vast in de oorkappen op het stereotaxische instrument en zorg voor anesthesie (2% isofluraan) via de neuskegel die aan het stereotaxische instrument is bevestigd. Voeg een steriel laken toe om asepsis te behouden. Reinig het hoofd en de nek met povidon-jodium prep pads en steriele alcohol prep pads.Breng indien nodig opnieuw oogsmeermiddel aan. Injecteer lidocaïne (4 mg/kg) (zie Materiaaltabel) subcutaan op de plaats van de incisie. Zorg voor voldoende anesthesie-inductie door een teenknijp uit te voeren. Als de oprichtende reflex afwezig is, maak dan een incisie langs de middellijn van de kop van het dier van de staartrand van de ogen tot de staartrand van de oren. Klem de huid uit met tissueclips: twee aan de rostrale rand aan elke kant net achter de ogen en twee aan de staartrand net achter de oren. Reinig het schedeloppervlak door voorzichtig met een scalpelmesje te schrapen om opgedroogde fascia te verwijderen. Breng een dunne laag tandcement (zie Materiaaltabel) aan op het oppervlak van de schedel en laat het 5 minuten drogen. Plaats de kopplaat op de schedel van het dier. Hoe en waar de kopplaat wordt geïmplanteerd, verschilt per kopplaat en onderzoeksvraag. Gebruik tandheelkundig cement om de hoofdplaat aan de schedel te bevestigen. Zorg ervoor dat de schedel volledig bedekt is. Laat tandheelkundig cement 10 minuten drogen. Breng het dier over naar een beweegbare plastic neuskegel om anesthesie te bieden voor de rest van de operatie; Dit maakt het mogelijk om het dier tijdens de operatie regelmatig te herpositioneren om toegang te krijgen tot verschillende spieren met behoud van anesthesie. Verleng de incisie aan de achterkant van de nek (gemaakt tijdens de implantatie van de hoofdplaat) zodat deze 1 cm caudaal tot aan de oren komt. Gebruik een stompe botschraper om de huid onder de incisie in de nek te scheiden van het onderliggende weefsel om een pad vrij te maken van de incisie in de nek naar de voorpoot, waar elektroden worden geïmplanteerd. Bevestig de EMG-connector tijdelijk aan de kopplaat met behulp van een klein stukje tape om deze op zijn plaats te houden tijdens de implantatie van de elektrode. Reinig de voorpoot van het dier met povidonjodium-prep-pads en steriele alcoholprep-pads. Maak de incisie in de triceps.Leg het dier op zijn zij met de triceps naar boven gericht. Injecteer lidocaïne (4 mg/kg) op de geplande plaats van de incisie. Dit verlicht lokale pijn en houdt de spieren vochtig tijdens de implantatie.OPMERKING: Spieren moeten tijdens de operatie vochtig blijven, maar niet druipnat. Breng indien nodig steriele zoutoplossing plaatselijk aan als de spieren of de huid droog lijken. Snijd 7 mm over de triceps evenwijdig aan het bot. Scheid de huid rond de incisie van het onderliggende weefsel met de stompe botschraper. Werk de schraper onder de huid en terug naar de incisie in de nek om een pad vrij te maken voor de elektroden. Knip alle fascia weg die de spier verbergt. Zorg ervoor dat het pad van de nek naar de triceps groot genoeg is door een gesloten schaar door de incisie in de triceps te steken en het nekgat naar buiten te duwen, waarbij het iets opent na het verlaten van het gat. Breng de triceps-elektrode naar de triceps-incisie: Steek de punt van de grote naaldschroevendraaier door de triceps-incisie en uit de incisie in de nek. Klem de schroevendraaier in de lengte om de elektrodenaald en trek door tot aan de incisie in de triceps. Triceps inbrengen: Volg stap 3 “elektroden in de spieren inbrengen”. Maak de incisie in de distale arm.Leg het dier op zijn rug. Plak de arm langs de zijkant van het dier met de handpalm naar beneden. Injecteer lidocaïne (4 mg/kg) op de geplande plaats van de incisie. Maak een incisie van 1 cm boven de biceps en ECR vanaf de onderkant van de deltaspier tot halverwege de onderarm, evenwijdig aan het bot. Het distale uiteinde van de incisie moet ~2 mm boven het uiteinde van de onderarmspieren zijn. Verwijder de fascia om de bicepsspier bloot te leggen. Maak een pad vrij van de incisie in de distale arm terug naar de incisie in de triceps boven (proximaal naar) het grote bloedvat dat onder de huid van de bovenarm loopt. Rijg de biceps-elektrode onder de huid door de incisie in de nek naar de incisie in de triceps en vervolgens van de incisie in de triceps naar de incisie in de distale arm. Biceps inbrengen: Volg stap 3 “elektroden in de spieren inbrengen”.Plak de arm van het dier opnieuw vast in dezelfde positie, maar met de handpalm naar beneden. Breng zo dicht mogelijk bij het proximale uiteinde van de blootgestelde biceps in. Om ten minste 3 mm van de elektrode in het spierweefsel onder te dompelen, moet u ervoor zorgen dat deze iets diagonaal ten opzichte van de spiervezels wordt ingebracht, afhankelijk van de grootte van de muis. Maak een pad vrij van de incisie in de triceps naar de inbrengplaats van de distale arm onder (distaal van) het grote bloedvat dat onder de huid van de bovenarm loopt, waardoor een ander pad ontstaat dan dat van de biceps-elektrode. ECR-invoeging: Volg stap 3 “elektroden in de spieren inbrengen”.Invoegen in het meest proximale deel van ECR. Ga naar buiten in de vouw tussen ECR en zijn antagonist en leg de knoop in deze vouw. Maak een pad vrij van de triceps-insertie naar de PL-insertieplaats onder de elleboog. PL inbrengen: Volg stap 3 “elektroden inbrengen in spieren”.Leg het dier op zijn rug en plak zijn arm over zijn kop met de handpalm naar boven. Plaats net distaal van de elleboog. Verlaat voldoende proximaal van de polspezen, zodat de knoop op de uitgangsplaats op de spier ligt en niet op de polspezen. Leg het dier op zijn zij en hecht de incisie in de triceps met behulp van 6-0 zijden hechtingen. Verplaats het dier op zijn rug en hecht de incisie in de distale arm met behulp van 6-0 zijden hechtingen. Bevestig de connector aan de achterkant van de kopplaat met tandheelkundig cement. Hecht de incisie in de nek met behulp van 6-0 zijden hechtingen. Breng actuele antibiotische crème aan op incisieplaatsen om ontstekingen te verminderen. Bevestig een Elizabethaanse halsband (zie Materiaaltabel) om het dier om te voorkomen dat het de hechtingen tijdens het herstel stoort. 3. Elektroden in de spieren inbrengen Buig de naald (27 G, stap 1) lichtjes door te buigen.Houd de naald vast met de schroevendraaier (zie Tabel met materialen) en druk deze tegen het handvat van een pincet om een buiging van 5-10 graden toe te voegen. Voeg in totaal drie bochten op verschillende posities langs de lengte van de naald toe. Visualiseer waar je de spier kunt binnenkomen en verlaten. Verwijder al het vet en de fascia die de in- en uitgang verdoezelen door met een fijne tang te snijden of te trekken. Probeer vasculaire schade te voorkomen om het bloeden te beperken. Streef naar 3-5 mm ondergedompelde draad die evenwijdig loopt aan de spiervezels. Dit zorgt ervoor dat de blootgestelde stukken elektrodedraad in de spier worden ondergedompeld. Gebruik de schroevendraaier om de naald in het proximale uiteinde van de spier te steken terwijl u tegendruk uitoefent met een stompe gebogen pincet in uw andere hand. Duw de naald door de spier naar de uitgangsplaats. Zodra de naald de spier verlaat, pakt u de punt met een stompe tang vast en trekt u de naald erdoorheen. Blijf trekken totdat de proximale knoop bovenop de inbrengplaats zit. Maak de distale knoop.Bind met een tang een losse knoop distaal van de uitgangsplaats. Span de knoop aan tot een lus van 1 cm. Duw de lus met een tang en plaats deze over de uitgang. Visualiseer waar de distale knoop moet worden gesloten voordat deze volledig wordt vastgedraaid, ongeveer 0.5 mm distaal van de uitgangsplaats. Pak de lus voorzichtig vast met de fijn gebogen pincet in deze positie en trek de lus strak over je pincet.OPMERKING: Span de distale knoop in deze stap niet direct over de uitgangsplaats aan, anders wordt de spier samengedrukt wanneer de knoop in de volgende stap volledig is aangetrokken. Verwijder de fijne pincet uit de knoop en voltooi het aanspannen van de knoop door de knoop met de fijngebogen pincet naar de uitgang te duwen en met de vingers aan het naalduiteinde te trekken. Zorg ervoor dat zowel de proximale als de distale knopen goed buiten de inbreng- en uitgangsplaatsen zijn geplaatst om de ingebrachte elektrode op zijn plaats te verankeren. Pak de uitgangsknoop vast met een rechte, fijne tang en krul de distale draad strak rond de tang om de draad rond de knoop en naar de spier/weg van de huid te buigen. Knip de draad 0,5 mm distaal van de distale knoop af en laat een klein knobbeltje rond de knoop gekruld.De vorige stap zorgt ervoor dat het afgeknipte uiteinde van de knobbel niet in de huid van het dier prikt, wat irritatie kan veroorzaken. 4. Postoperatieve zorg Voer direct na de operatie de volgende stappen uit.Huisvest het dier alleen, zodat zijn kooigenoten zijn hechtingen niet verstoren. Plaats het dier in een schone kooi met lage bodembedekking. Verwijder alle nestjes en verrijkingsmateriaal dat de mobiliteit van het dier zou kunnen belemmeren tijdens het dragen van de Elizabethaanse halsband. Geef het dier water en natvoer waar het bij kan tijdens het dragen van de halsband. Voer de volgende stappen 24 uur en 48 uur na de operatie uit.Verwijder de Elizabethaanse halsband zodat het dier zichzelf 20 minuten kan verzorgen. Induceer anesthesie met isofluraan, zoals vermeld in stap 2.2 en stap 2.3. Injecteerbare pijnstillers en antibiotica toedienen. Inspecteer incisieplaatsen op ontbrekende hechtingen, open wonden en tekenen van infectie of irritatie. Vervang de hechtingen en breng indien nodig meer actuele antibiotica aan. Vervang natvoer elke 48 uur totdat de Elizabethaanse halsband is verwijderd. Voer de volgende stappen 6 dagen na de operatie uit.Controleer wonden voor volledige genezing. Als de wonden gesloten zijn, verwijder dan de hechtingen. Als de wonden open zijn, wacht dan nog twee dagen om de hechtingen te verwijderen. Verwijder de Elizabethaanse kraag wanneer de hechtingen zijn verwijderd. Zet de muis terug in een nieuwe, schone kooi met volledige bodembedekking en verrijking.OPMERKING: Dieren kunnen 7 dagen na de operatie overgaan tot experimenten of wateronthouding.