Kronik İmplante EMG Elektrotları ile Başa Sabit Farelerde Ön Ayak Kas Aktivitesinin Kaydedilmesi
Summary
Bu protokol, başa sabitlenmiş davranış deneyleri sırasında kas aktivitesini kaydetmek için farelerin ön ayak kaslarına elektromiyografik (EMG) elektrotların el imalatını ve cerrahi implantasyonunu açıklar.
Abstract
Fare sistemlerinde bulunan güçlü genetik ve moleküler araçlar, sinirbilim araştırmaları, araştırmacıların, çeşitli görevleri yerine getiren kafaya sabitlenmiş farelerde motor sistem işlevini benzeri görülmemiş bir hassasiyetle sorgulamalarını sağlamıştır. Farenin küçük boyutu, kas aktivitesinin geleneksel elektromiyografik (EMG) kayıt yöntemi, kediler ve primatlar gibi daha büyük hayvanlar için tasarlandığından, motor çıktısının ölçümünü zorlaştırır. Fareler için ticari olarak temin edilebilen EMG elektrotları beklenirken, farelerde kas aktivitesini kaydetmek için mevcut altın standart yöntem, elektrot setlerini şirket içinde yapmaktır. Bu makale, bir elektrot setinin elle üretilmesi, kafa plakası implantasyonu ile aynı ameliyatta elektrotların implantasyonu, kafa plakasına bir konektörün sabitlenmesi ve ameliyat sonrası iyileşme bakımı için yerleşik prosedürlerin iyileştirilmesini açıklamaktadır. İyileşmeyi takiben, sinyal kalitesinde gözle görülür değişiklikler olmadan birkaç hafta boyunca kafa sabitleme davranışı sırasında milisaniye çözünürlüklü EMG kayıtları elde edilebilir. Bu kayıtlar, farelerde motor kontrol mekanizmalarını araştırmak için in vivo nöral kayıt ve/veya pertürbasyonun yanı sıra ön ayak kas aktivitesinin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar.
Introduction
Son yıllarda, fareler, memeli motor sistemini incelemek için çekici bir model organizma haline geldi. Yaygın deneysel yaklaşımlar, nöral aktivitenin izlenmesi ve / veya bozulmasının yanı sıra motor görevleri yerine getiren başa sabitlenmiş fareleri içerir 1,2,3,4,5. Daha büyük türlerde (kediler ve primatlar gibi) motor sistem çalışmaları, bu tür deneyler sırasında motor çıktısını doğrudan ölçmek için geleneksel olarak elektromiyografiye (EMG) dayanmaktadır 6,7,8. Bununla birlikte, farelerde kas aktivitesinin kaydedilmesi zordur çünkü kas sistemleri, büyük memeli deneylerinde kullanılan ticari olarak temin edilebilen EMG elektrotları için çok küçüktür9. Birçok araştırmacı, motor çıktısını dolaylı olarak araştırmak için video 4,10,11 ve/veya davranışsal performans 2,4,12 aracılığıyla uzuv kinematiğini izlemeyi tercih eder, ancak bu yöntemler, nöral aktivitenin ve bunun kaslar üzerindeki bozulmanın milisaniye zaman ölçeğindeki etkisini tespit edecek çözünürlükten yoksundur. Bu nedenle, EMG’nin kaydedilmesi, kasların doğrudan nöral kontrolü ile ilgilenen araştırmacılar için arzu edilir.
EMG, tipik olarak kaydedilen kasın liflerine kabaca paralel kısa bir mesafe ile ayrılan iki nokta arasındaki voltajın ölçülmesini içerir. EMG elektrotları yüzey (veya “yama”) ve kas içi (veya “iğne”) çeşitlerinde gelir. Yüzey elektrotları cildin üzerine yerleştirilir veya kas dokusu üzerine yerleştirilir ve yapıştırıcı veya dikiş ile sabitlenir. Bu nedenle, yüzey elektrotları kas içi elektrotlardan daha az invazivdir ve göreceli kullanım kolaylıkları nedeniyle insanlar, kediler ve primatlar arasında en popüler olanıdır. Yüzey elektrotları ayrıca sıçanlar ve fareler ile başarılı bir şekilde kullanılmıştır13,14; Bununla birlikte, kemirgenlerin tımar sırasında yabancı cisimleri çıkarmaya çalışma eğilimi nedeniyle elde üretilmeli ve cerrahi olarak cilt altına implante edilmelidir. Kas içi EMG elektrotları ise kas dokusu içine cerrahi olarak implante edilir. Kas dokusu tarafından yutuldukları için, yüksek uzamsal çözünürlük sağlarlar ve süresiz olarak pozisyonda sabit kalırlar. Bu nedenle, implante edilmiş kas içi EMG elektrotları, kemirgenlerin kullanıldığı uzun süreli deneyler için yüzey elektrotları üzerinde idealdir. Farelerde kas içi EMG’yi güvenilir bir şekilde kaydetmek için araştırmacılar, EMG elektrotlarını yetişkin bir farenin ön kolundaki kadar küçük kaslara elle imal etmek ve implante etmek için bir yöntem geliştirdiler. Bu elektrotlar, birkaç hafta boyunca kemirgenlerde motor davranış sırasında kronik kas kaydını mümkün kılar.
Burada açıklanan protokol, davranan farelerde dirsek ve el bileğinin fleksör/ekstansör kas çiftlerine kronik olarak implante edilen tel EMG elektrotlarından elle imalat, implante etme ve kaydetme prosedürü sağlayan yerleşik yöntemlerin15,16,17,18 on yıllık bir iyileştirmesinin sonucudur. İlk bölüm, dört elektrot çifti ve kafa aşaması arayüzü için 8 pimli bir konektör içeren bir elektrot setinin el imalatını açıklar. Bir sonraki bölüm, kafa plakası implantasyonu ile aynı ameliyatta elektrotların kas içine kas içine cerrahi implantasyonunu detaylandırmaktadır. Son olarak, çeşitli davranışlar sergileyen farelerden elde edilen temsili kayıtlar tartışılmaktadır. Genel olarak, bu yöntem, bazı elektrot üretim deneyimine sahip laboratuvarlar için ideal olan, başa sabit davranış deneylerine kas aktivitesi ölçümlerini dahil etmenin uygun maliyetli ve özelleştirilebilir bir yoludur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, birkaç hafta boyunca çeşitli davranışlar sergileyen başa sabitlenmiş farelerden stabil kas aktivitesi kayıtları sağlar. Son zamanlarda, bu yöntem, koşu bandı hareketi 18,20, bir joystick çekme görevi18 ve bir birlikte kasılma görevi21 gibi davranışlar sırasında uzuv kas sisteminin sinirsel kontrolünü incelemek için kullanılmaktadır. Burada açıklanan protokol fare dirsek ve bilek kaslarına özgü olsa da, elektrot çiftlerinin uzunluğunu ve/veya toplam sayısını değiştirerek farklı kaslardan veya farklı sayıda kastan kayıt yapmak için kolayca değiştirilebilir. Burada tarif edilen yöntem, baş desteği olmayan farelerde ön ayak ve arka bacak kas aktivitesini kaydetmek için daha önce kullanılanlardan uyarlanmıştır 15,16,17.
Elektrot imalatı, ustalaşmak için önemli bir pratik gerektirir. Öğrenirken 1-2 saat günlük pratik yapılması önerilir. Elektrotların sıyrılması, alttaki tele zarar vermeden yalıtımı kesmek için gereken kesin kuvvet seviyesi nedeniyle en zorlu adımdır. Bu kuvvet seviyesi bıçağın keskinliğine bağlıdır, bu nedenle neşter bıçağını sık sık değiştirmek, öğrenme sırasında tekrarlanabilirliğin sağlanmasına yardımcı olabilir. Kabloları konektörün pirinç bıçaklarına lehimlemek de zor olabilir, çünkü paslanmaz çelik kolayca lehimlenmez. Bol miktarda paslanmaz çelik uyumlu akı uygulamak, bağlantının desteklenmesine yardımcı olur.
İmplantasyon ameliyatı sırasındaki ana zorluk, implante edilen teli veya proksimal düğümü bozmadan distal düğümü bağlamaktır. Proksimal düğüm, yerleştirme bölgesinde kas içine kaymaya direnecek kadar büyük olmalıdır – bu nedenle, elektrot seti imalatının 2. adımında düğümü çok sıkı bağlamaktan kaçının. İmplantasyondan sonra proksimal düğüm göç ederse, dikkatli bir şekilde yeniden konumlandırmak için karbon fiber uçlu forseps kullanın. Tüm elektrodun içinden çekilmesini önlemek için forseps ile tel üzerinde sıkı bir tutuş sağlarken distal düğümü yavaşça sıkın. Bu adım, implante edilen elektrotların uzun ömürlü olmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir: elektrot üzerine yerleştirilen çok fazla gerilim, hayvan hareket ettiğinde kırılmasına neden olabilirken, gevşek bir elektrot iyileşme sırasında kayabilir ve doku iyileştikçe ilişkili kasla temasını kaybedebilir.
Hayvanlar ameliyattan oldukça iyi bir şekilde iyileşir, ancak dikkat edilmesi gereken potansiyel komplikasyonlar vardır. İlk olarak, fareler şans verilirse dikişlerini ve elektrotlarını çiğneyeceklerdir. Elizabeth tasması bunu engellerken aynı zamanda hayvanın kendi kendini tımar etmesini de engeller. Bazı fareler gözlerinin etrafında mukus benzeri bir birikim geliştirir. Ara sıra erkek fareler, özellikle yaşlı olanlar, hayvan için üzücü olabilecek üretra tıkanıklıkları yaşarlar. Dikişleri incelemeden önce hayvanın her gün 20 dakika kendini temizlemesine izin vermek, hayvana bu sorunları önlemek için yeterli zaman vermelidir.
Bu yöntemin dikkat edilmesi gereken önemli sınırlamaları vardır. İlk olarak, bu özel elektrotlar genellikle tek motor ünitesi aktivitesini çözemez. Ayrıca, elektrik sinyalinin yalnızca belirli bir kastan (yani pazı) yayılması garanti edilmez, çünkü yakındaki sinerjist kaslardaki aktiviteden karışmayı dışlamak zordur. Bu nedenle, yayınlarda, araştırmacılar genellikle sinerji gruplarına (yani dirsek fleksörü) göre kaydedilen kaslara atıfta bulunurlar. Her bir elektrotun konumunu doğrulamak için her deneyden sonra ölüm sonrası diseksiyonlar yapılması önerilir, çünkü iyileşme sırasında dokuda kayabilirler.
Tek motor ünite aktivitesi ile ilgilenen araştırmacılar, Emory Üniversitesi’ndeki İleri Motor Biyomühendislik Araştırma Merkezi (CAMBER) tarafından yeni geliştirilen EMG elektrotlarını denemeyi düşünmelidir. Bu elektrotlar hala geliştirilmektedir, ancak CAMBER en son elektrot tasarımını sağlayacaktır. Bu elektrotların ana dezavantajı uzun ömürlülüktür: bu protokolde açıklanan el yapımı elektrotlar genellikle birkaç hafta boyunca kayıtlara izin verirken, CAMBER elektrotları kısa süreli deneyler için en iyi sonucu verir. Bir EMG kayıt yöntemi seçen araştırmacılar, elektrotlarının belirli bir deney için uygun olup olmayacağını belirlemek için doğrudan CAMBER ile iletişime geçebilirler.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu yöntemin geliştirilmesine katkıda bulunduğu için Dr. Claire Warriner’e teşekkür eder. Mark Agrios ve Sajishnu Savya figürlerin hazırlanmasına yardımcı oldular. Bu araştırma, Searle Scholar Ödülü, Sloan Araştırma Bursu, Küresel Beyin Pilotu Ödülü Simons İşbirliği, Whitehall Araştırma Hibe Ödülü, Chicago Community Trust’taki Searle Fonları’nın desteğiyle Chicago Biyomedikal Konsorsiyumu, NIH hibesi DP2 NS120847 () ve NIH hibesi 2T32MH067564 (AK) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| #11 Scalpel Blades | World Precision Instruments | 504170 | For EMG electrode fabrication |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | For EMG electrode fabrication |
| 1 mL Sub-Q Syringe (100 pack) | Becton Dickinson | 309597 | For administering injectable drugs |
| 12-pin connector | Newark | 33AC2371 | 12-pin connector with brass fittings; for EMG electrode fabrication |
| 18 G Needles | Exel International | 26419 | For EMG electrode fabrication |
| 27 G Needles | Exel International | 26426 | For EMG electrode fabrication |
| 3 M Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-0 | For taping animal's limbs out during surgery |
| 6-0 silk sutures | Henry Schein | 101-2636 | These sutures work well with delicate skin around the wrists |
| C&B Metabond Complete Kit | Pearson Dental | P16-0126 | Dental cement to affix connector to headplate |
| C57BL6/J Mice | Jackson Laboratories | #000664 | Wild type mice |
| Carbofib 5-CF Tweezers (2) | Aven tools | 18762 | Carbon fiber tipped forceps, used to manipulate delicate parts of electrode (stripped or inserted sections) |
| Carprodyl (Carprofen) 50 mg/mL Injection | Ceva Animal Health, LLC | G43010B | Injectable analgesic for pain management during and after surgery |
| Castroviejo Micro Needle Holder | Fine science tools | 12060-01 | For suturing |
| Castroviejo Needle Holder (large) | Fine science tools | 12565-14 | For inserting needle into muscle |
| Delicate Bone Scraper | Fine science tools | 10075-16 | To separate skin from underlying tissue |
| Dietgel 76A Dietary Supplement | Clear H2O | 72-07-5022 | For post-operative care |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine science tools | 11251-35 | To remove fascia overlying muscle |
| Elizabethan collar for mouse | Kent Scientific Corporation | EC201V-10 | For post-operative care |
| Enrofloxacin 2.27% | Covetrus | #074743 | Injectable antibiotic for use during and after surgery |
| Epoxy gel | Devcon | 14265 | For EMG electrode fabrication |
| Hopkins Bulldog Clamp (4) | Stoelting | 10-000-481 | Tissue clamps for headplate implantation |
| Isoflurane Solution | Covetrus | 11695067771 | Inhalable anesthesia |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable – 2% | Covetrus | #002468 | Topical analgesic for pain management during surgery |
| Medical Grade Oxygen | Airgas | OX USP200 | For administering isoflurane during surgery |
| MetriCide 1 Gallon | Metrex | 10-1400 | Glutaraldehyde solution for cold-sterilization of headplate and electrodes |
| MetriTest Strips 1.5% | Metrex | 10-303 | Test strips for monitoring glutaraldehyde solution (recommended) |
| Model 900LS Small Animal Stereotaxic Instrument | Kopf Instruments | 900LS | Stereotax with lazy susan feature that allows platform rotation during surgery |
| PFA-coated 0.0055" braided stainless steel wire | A-M systems | 793200 | For EMG electrode fabrication |
| Povidone-iodine prep pads | Dynarex | 1108 | For cleaning skin |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 37327 | Eye ointment for surgery |
| Sterile alcohol prep pads | Dynarex | 1113 | For cleaning skin |
| Straight fine #5 forceps | Fine science tools | 11295-10 | For curling wire after insertion |
| Straight fine scissors | Fine science tools | 14060-11 | For cutting wire |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 91500-09 | For making incisions, trimming fat and fascia, and suturing |
| Technik Tweezers 7B-SA (2) | Aven tools | 18074USA | Curved blunt forceps, for general use during surgery |
| Triple Antibiotic Ointment | Walgreens | 975863 | Topical antibiotic for surgery |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | Contains all necessary equipment for anesthesia induction and scavenging including vaporizer, induction chamber, moveable plastic nose cone, and tubing |
References
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large scale neural activity with cellular resolution in awake mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Guo, Z. V., et al. Flow of cortical activity underlying a tactile decision in mice. Neuron. 81 (1), 179-194 (2014).
- Guo, J. Z., et al. Cortex commands the performance of skilled movement. eLife. 4, e10774 (2015).
- Morandell, K., Huber, D. The role of forelimb motor cortex areas in goal directed action in mice. Sci Rep. 7 (1), 15759 (2017).
- Galiñanes, G. L., Bonardi, C., Huber, D. Directional reaching for water as a cortex-dependent behavioral framework for mice. Cell Rep. 22 (10), 2767-2783 (2018).
- Evarts, E. V., Tanji, J. Reflex and intended responses in motor cortex pyramidal tract neurons of monkey. J Neurophysiol. 39 (5), 1069-1080 (1976).
- Hounsgaard, J., Hultborn, H., Jespersen, B., Kiehn, O. Bistability of alpha-motoneurones in the decerebrate cat and in the acute spinal cat after intravenous 5-hydroxytryptophan. J Physiol. 405, 345-367 (1988).
- Murphy, P. R., Hammond, G. R. The role of cutaneous afferents in the control of gamma-motoneurones during locomotion in the decerebrate cat. J Physiol. 434, 529-547 (1991).
- Manuel, M., Chardon, M., Tysseling, V., Heckman, C. J. Scaling of motor output, from mouse to humans. Physiol Bethesda Md. 34 (1), 5-13 (2019).
- Sauerbrei, B. A., et al. Cortical pattern generation during dexterous movement is input-driven. Nature. 577 (7790), 386-391 (2020).
- Barrett, J. M., Raineri Tapies, M. G., Shepherd, G. M. G. Manual dexterity of mice during food-handling involves the thumb and a set of fast basic movements. PLoS One. 15 (1), e0226774 (2020).
- Serradj, N., et al. Task-specific modulation of corticospinal neuron activity during motor learning in mice. Nat Commun. 14, 2708 (2023).
- Scholle, H. C., et al. Spatiotemporal surface EMG characteristics from rat triceps brachii muscle during treadmill locomotion indicate selective recruitment of functionally distinct muscle regions. Exp Brain Res. 138 (1), 26-36 (2001).
- Scholle, H. C., et al. Kinematic and electromyographic tools for characterizing movement disorders in mice. Mov Disord off J Mov Disord Soc. 25 (3), 265-274 (2010).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. J Neurosci Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Akay, T., Acharya, H. J., Fouad, K., Pearson, K. G. Behavioral and electromyographic characterization of mice lacking EphA4 receptors. J Neurophysiol. 96 (2), 642-651 (2006).
- Akay, T., Tourtellotte, W. G., Arber, S., Jessell, T. M. Degradation of mouse locomotor pattern in the absence of proprioceptive sensory feedback. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (47), 16877-16882 (2014).
- Miri, A., et al. Behaviorally selective engagement of short-latency effector pathways by motor cortex. Neuron. 95 (3), 683-696 (2017).
- Osborne, J., Dudman, J. RIVETS: A mechanical system for in vivo and in vitro electrophysiology and imaging. PloS One. 9 (2), e89007 (2014).
- Santuz, A., Laflamme, O. D., Akay, T. The brain integrates proprioceptive information to ensure robust locomotion. J Physiol. 600 (24), 5267-5294 (2022).
- Warriner, C. L., Fageiry, S., Saxena, S., Costa, R. M., Miri, A. Motor cortical influence relies on task-specific activity covariation. Cell Rep. 40, 111427 (2022).
