Avaliando as medidas de resultados da conectividade da unidade motora do diafragma do rato como biomarcadores quantitativos da degeneração e compensação do neurônio motor frênico
Summary
Neste estudo, apresentamos um método in vivo para estimar o número e o tamanho da unidade motora para quantificar a conectividade da unidade motora do diafragma de ratos. Uma abordagem passo a passo para essas técnicas é descrita.
Abstract
A perda da função muscular ventilatória é uma consequência da lesão do neurônio motor e da neurodegeneração (por exemplo, lesão da medula espinhal cervical e esclerose lateral amiotrófica, respectivamente). Os neurônios motores frênicos são o elo final entre o sistema nervoso central e o músculo, e suas respectivas unidades motoras (grupos de fibras musculares inervadas por um único neurônio motor) representam a menor unidade funcional do sistema ventilatório neuromuscular. O potencial de ação muscular composto (CMAP), o potencial de unidade motora única (SMUP) e a estimativa do número de unidades motoras (MUNE) são abordagens eletrofisiológicas estabelecidas que permitem a avaliação longitudinal da integridade da unidade motora em modelos animais ao longo do tempo, mas têm sido aplicadas principalmente aos músculos dos membros. Portanto, os objetivos deste estudo são descrever uma abordagem em estudos pré-clínicos com roedores que pode ser usada longitudinalmente para quantificar o MUNE frênico, o tamanho da unidade motora (representado como SMUP) e o CMAP e, em seguida, demonstrar a utilidade dessas abordagens em um modelo de perda de neurônios motores. Biomarcadores sensíveis, objetivos e translacionalmente relevantes para lesão neuronal, degeneração e regeneração em lesões e doenças do neurônio motor podem ajudar significativamente e acelerar as descobertas de pesquisas experimentais para testes clínicos.
Introduction
Os neurônios motores frênicos (MNs), estendendo-se dos níveis de miótomo C3 a C6, formam o elo final do sistema nervoso central (SNC) ao músculo diafragma1. As unidades motoras frênicas (MUs) são compostas por um único MN espinhal e suas fibras musculares diafragmáticas inervadas formando a menor unidade funcional do sistema neuromuscular respiratório. A função ventilatória requer contração adequada do músculo diafragma obtida por meio da ativação coordenada do pool frênico deMU2,3. Muitas doenças neurológicas, incluindo a esclerose lateral amiotrófica (ELA), resultam em grave comprometimento ventilatório, contribuindo para a causa da morte4.
Várias abordagens eletrofisiológicas podem ser empregadas para avaliar e monitorar a integridade do pool de unidades motoras (MU) in vivo. O potencial de ação muscular composto (CMAP) reflete a despolarização somada de todas as fibras musculares em um músculo ou grupo muscular específico após a estimulação do nervo periférico e é sensível a uma variedade de condições neuromusculares, incluindo ELA 5,6 e atrofia muscular espinhal (AME)7,8,9. Uma limitação da avaliação do CMAP é que o brotamento colateral pode levar à manutenção da amplitude e área do CMAP, mesmo na presença de perda de MU10. Para superar essa limitação, modificações foram feitas na técnica de CMAP para avaliar o número de unidades motoras e o tamanho11. Além disso, um estudo in vivo que investigou a avaliação funcional da CMAP do diafragma por um sistema eletrofisiológico sugeriu que também pode ser viável utilizar a técnica de registro da CMAP do diafragma descrita para estimativa do número de unidades motoras12.
A técnica de estimativa do número de unidades motoras incrementais (MUNE) foi inicialmente introduzida no início da década de 1970 por McComas et al. para o músculo extensor curto dos dedos em humanos13. A abordagem incremental MUNE foi uma modificação da técnica tradicional de registro CMAP, durante a qual uma estimulação gradualmente crescente foi fornecida para registrar incrementos submáximos quantais, tudo ou nada, como índices de respostas de unidade motora única. Os incrementos somados e médios foram usados para calcular uma estimativa para o tamanho de um único potencial de unidade motora (SMUP). Esse tamanho calculado foi então dividido na amplitude do CMAP para estimar o número de MUs que inervam o músculo examinado11. O MUNE demonstra alta sensibilidade na detecção e monitoramento da perda de unidades motoras, permitindo a identificação de disfunção da unidade motora antes de alterações observáveis em medidas como amplitude ou área de CMAP14,15. Em pacientes com ELA, o MUNE provou ser excepcionalmente sensível, servindo como um biomarcador proeminente para o início, progressão e prognóstico da doença16,17.
Numerosas adaptações do MUNE foram desenvolvidas e amplamente utilizadas para avaliar a função do MU em condições como neurodegeneração, lesão neural e o processo natural de envelhecimento 18,19,20,21. Desde a descrição inicial, várias adaptações utilizando respostas eletrofisiológicas e medições de força incremental (mecânica) foram empregadas em estudos em humanos e modelos animais22. O MUNE fornece uma avaliação funcional não invasiva da conectividade do neurônio motor com o músculo. A aplicação longitudinal do MUNE permite a compreensão da progressão da doença ou do fenótipo induzido e a avaliação dos efeitos protetores ou regenerativos das intervenções terapêuticas, tanto em ambientes clínicos quanto pré-clínicos. Independentemente da eficácia da reprodutibilidade das medidas do MUNE e da relevância clínica da técnica para pools de MU na maior parte do corpo humano, os esforços têm se concentrado principalmente nos músculos dos membros nos músculos de roedores 10,23,24,25.
Portanto, os objetivos deste estudo foram descrever uma abordagem para obter potencial de ação muscular composto (CMAP), SMUP e número de unidades motoras frênicas (MUNE) como avaliações in vivo que podem ser usadas longitudinalmente em estudos pré-clínicos com roedores para quantificar o MUNE, tamanho da unidade motora (representada como SMUP) e CMAP. Além disso, apresentamos dados representativos que destacam a perda do número de MU do diafragma após a administração intrapleural de um agente degenerativo frênico do NM, fragmento B da toxina da cólera conjugado à saporina (CTB-SAP).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nas doenças degenerativas do NM, como a ELA, é crucial avaliar as MUs envolvidas na ventilação28. Apesar da ocorrência de degeneração respiratória do NM em pacientes com ELA, o início específico e a progressão da morte por NM permanecem incompletamente compreendidos 29,30,31. Reconhecendo a importância desse aspecto, vários modelos, tanto de base genética (p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma bolsa do Programa de Pesquisa de Lesões/Doenças da Medula Espinhal do Programa de Pesquisa de Lesões/Doenças da Medula Espinhal do Missouri (NLN e WDA).
Materials
| 2 mL Glass Syringe | Kent Scientific Corporation | SOMNO-2ML | |
| 50 mL, Model 705 RN syringe | Hamilton Company | 7637-01 | Utilized to conduct intrapleural injection |
| Autoclavable 26 G needles (26S RN 9.52 mm 40°) | Hamilton Company | 7804-04 | Utilized to conduct intrapleural injection |
| Cholera toxin B-subunit (CTB) | MilliporeSigma | C9903 | Utilized for intrapleural injection to label surviving motor neurons |
| Cholera toxin B-subunit conjugated to saporin (CTB-SAP) | Advanced Targeting Systems | IT-14 | Utilized for intrapleural injection to cause motor neuron death |
| Detachable Cable | Technomed | 202845-0000 | to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine |
| Disposable 2" x 2" disc electrode with leads | Cadwell | 302290-000 | ground electrode |
| disposable monopolar needles 28 G | Technomed | 202270-000 | cathode and anode stimulating electrodes- recording electrodes |
| EMG needle cable (Amp/stim switch box) | Cadwell | 190266-200 | to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator |
| Helping Hands alligator clip with iron base | Radio Shack | 64-079 | Maintaining recording electrode placement |
| Isoflurane (250 mL bottle) | Piramal Healthcare | ||
| monoject curved tip irrigating syringe | Covidien | 81412012 | utilized for application of electrode gel |
| PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic Warming | Kent Scientific Corporation | PS-RT | Includes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe |
| Pro trimmer Pet Grooming Kit | Oster | 078577-010-003 | clippers for hair removal |
| Saporin (SAP) | Advanced Targeting Systems | PR-01 | Utilized for intrapleural injection (control agent when injected by itself) |
| Sierra Summit EMG system | Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA | portable electrodiagnostic system | |
| SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SOMNO | Includes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter |
| Sprague-Dawley rat | Envigo colony 208a, Indianapolis, IN | ||
| Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment | Puralube | 26870 | applied during anesthesia to avoid corneal injury |
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