Bewertung der Konnektivitätsergebnisse von Ratten-Zwerchfell-Motoreinheiten als quantitative Biomarker für die Degeneration und Kompensation von phrenischen Motoneuronen
Summary
In dieser Studie stellen wir eine in vivo Methode zur Schätzung der Anzahl und Größe der motorischen Einheiten vor, um die Konnektivität der Motoreinheiten der Rattenmembran zu quantifizieren. Es wird eine Schritt-für-Schritt-Herangehensweise an diese Techniken beschrieben.
Abstract
Der Verlust der Funktion der Beatmungsmuskulatur ist eine Folge von Motoneuronenverletzungen und Neurodegeneration (z. B. zervikale Rückenmarksverletzung bzw. amyotrophe Lateralsklerose). Phrenische Motoneuronen sind das letzte Bindeglied zwischen dem Zentralnervensystem und den Muskeln, und ihre jeweiligen motorischen Einheiten (Gruppen von Muskelfasern, die von einem einzigen Motoneuron innerviert werden) stellen die kleinste funktionelle Einheit des neuromuskulären Beatmungssystems dar. Das Compound Muscle Action Potential (CMAP), das Single Motor Unit Potential (SMUP) und die Schätzung der motorischen Einheitenzahl (MUNE) sind etablierte elektrophysiologische Ansätze, die die longitudinale Beurteilung der Integrität motorischer Einheiten in Tiermodellen im Laufe der Zeit ermöglichen, aber hauptsächlich auf die Gliedmaßenmuskulatur angewendet wurden. Daher besteht das Ziel dieser Studie darin, einen Ansatz in präklinischen Nagetierstudien zu beschreiben, der longitudinal verwendet werden kann, um die phrenische MUNE, die motorische Einheitengröße (dargestellt als SMUP) und CMAP zu quantifizieren, und dann den Nutzen dieser Ansätze in einem Motoneuronenverlustmodell zu demonstrieren. Sensitive, objektive und translational relevante Biomarker für neuronale Verletzungen, Degeneration und Regeneration bei Verletzungen und Erkrankungen von Motoneuronen können experimentelle Forschungsentdeckungen bis hin zu klinischen Tests erheblich unterstützen und beschleunigen.
Introduction
Phrenische Motoneuronen (MNs), die sich von den Myotomspiegeln C3 bis C6 erstrecken, bilden das letzte Bindeglied vom Zentralnervensystem (ZNS) zum Zwerchfellmuskel1. Phrenische motorische Einheiten (MUs) bestehen aus einer einzigen spinalen MN und ihren innervierten Zwerchfellmuskelfasern, die die kleinste funktionelle Einheit des respiratorischen neuromuskulären Systems bilden. Die Beatmungsfunktion erfordert eine adäquate Kontraktion des Zwerchfellmuskels, die durch eine koordinierte Aktivierung des phrenischen MU-Pools erreicht wird 2,3. Viele neurologische Erkrankungen, einschließlich der amyotrophen Lateralsklerose (ALS), führen zu schweren Beeinträchtigungen der Beatmung und tragen letztlich zur Todesursache bei4.
Es können verschiedene elektrophysiologische Ansätze eingesetzt werden, um die Integrität des Pools der motorischen Einheit (MU) in vivo zu bewerten und zu überwachen. Das Compound Muscle Action Potential (CMAP) spiegelt die summierte Depolarisation aller Muskelfasern in einem bestimmten Muskel oder einer bestimmten Muskelgruppe nach peripherer Nervenstimulation wider und reagiert empfindlich auf eine Reihe von neuromuskulären Erkrankungen, einschließlich ALS 5,6 und spinaler Muskelatrophie (SMA)7,8,9. Eine Einschränkung der CMAP-Bewertung besteht darin, dass das Keimen von Sicherheiten dazu führen kann, dass die CMAP-Amplitude und -Fläche auch bei MU-Verlust10 erhalten bleibt. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden Änderungen an der CMAP-Technik vorgenommen, um sowohl die Anzahl der Motoreinheiten als auch die Größe11 zu bewerten. Darüber hinaus deutete eine In-vivo-Studie, in der die funktionelle Bewertung von Membran-CMAP durch ein elektrophysiologisches System untersucht wurde, darauf hin, dass es auch machbar sein könnte, die beschriebene Membran-CMAP-Aufzeichnungstechnik für die Schätzung der motorischen Einheitenzahlzu verwenden 12.
Die MUNE-Technik (Incremental Motor Unit Number Estimation) wurde ursprünglich in den frühen 1970er Jahren von McComas et al. für den Musculus extensor digitorum brevis beim Menschen eingeführt13. Der inkrementelle MUNE-Ansatz war eine Modifikation der traditionellen CMAP-Aufzeichnungstechnik, bei der eine allmählich zunehmende Stimulation durchgeführt wurde, um quantenhafte, alles-oder-nichts-submaximale Inkremente als Indizes der Reaktionen einzelner motorischer Einheiten aufzuzeichnen. Die summierten und gemittelten Inkremente wurden verwendet, um eine Schätzung für die Größe eines Potentials für eine einzelne motorische Einheit (SMUP) zu berechnen. Diese berechnete Größe wurde dann in die CMAP-Amplitude dividiert, um die Anzahl der MUs zu schätzen, die den zu untersuchenden Muskel innervieren11. MUNE zeigt eine hohe Sensitivität bei der Erkennung und Überwachung von Verlusten motorischer Einheiten, was die Identifizierung von Funktionsstörungen motorischer Einheiten vor beobachtbaren Änderungen von Messungen wie CMAP-Amplitude oder Fläche14,15 ermöglicht. Bei ALS-Patienten hat sich MUNE als außergewöhnlich sensitiv erwiesen und dient als wichtiger Biomarker für den Beginn, das Fortschreiten und die Prognose der Erkrankung16,17.
Zahlreiche Anpassungen von MUNE wurden entwickelt und häufig verwendet, um die MU-Funktion bei Erkrankungen wie Neurodegeneration, neuronalen Verletzungen und dem natürlichen Alterungsprozess zu beurteilen 18,19,20,21. Seit der Erstbeschreibung wurden verschiedene Anpassungen, die sowohl elektrophysiologische Reaktionen als auch Messungen der inkrementellen Kraft (mechanisch) nutzen, sowohl in Humanstudien als auch in Tiermodellen eingesetzt22. MUNE bietet eine nicht-invasive funktionelle Bewertung der Konnektivität von Motoneuronen mit dem Muskel. Die longitudinale Anwendung von MUNE ermöglicht das Verständnis des Fortschreitens von Krankheiten oder induzierten Phänotypen und die Bewertung von protektiven oder regenerativen Effekten therapeutischer Interventionen, sowohl im klinischen als auch im präklinischen Umfeld. Unabhängig von der Wirksamkeit der MUNE-Messungen der Reproduzierbarkeit und der klinischen Relevanz der Technik für MU-Pools im größten Teil des menschlichen Körpers haben sich die Bemühungen weitgehend auf die Gliedmaßenmuskulatur in Nagetiermuskeln konzentriert 10,23,24,25.
Daher bestand das Ziel dieser Studie darin, einen Ansatz zur Gewinnung des zusammengesetzten Muskelaktionspotentials (CMAP), des SMUP und der phrenischen motorischen Einheitenzahl (MUNE) als In-vivo-Bewertungen zu beschreiben, die in präklinischen Nagetierstudien longitudinal verwendet werden können, um die MUNE, die Größe der motorischen Einheit (dargestellt als SMUP) und CMAP zu quantifizieren. Darüber hinaus präsentieren wir repräsentative Daten, die den Verlust der Zwerchfell-MU-Nummer nach intrapleuraler Verabreichung eines phrenischen MN-Degeneratikums, des an Saporin konjugierten B-Fragments des Choleratoxins (CTB-SAP), hervorheben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei MN-degenerativen Erkrankungen wie ALS ist es entscheidend, die an der Beatmung beteiligten MUs zu beurteilen28. Trotz des Auftretens von respiratorischer MN-Degeneration bei ALS-Patienten sind der spezifische Beginn und das Fortschreiten des MN-Todes nach wie vor unvollständig verstanden 29,30,31. In Anerkennung der Bedeutung dieses Aspekts wurden verschiedene Modell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Forschungsprogramms für Rückenmarksverletzungen und -krankheiten des Missouri Spinal Cord Injury/Disease Research Program (NLN und WDA) finanziert.
Materials
| 2 mL Glass Syringe | Kent Scientific Corporation | SOMNO-2ML | |
| 50 mL, Model 705 RN syringe | Hamilton Company | 7637-01 | Utilized to conduct intrapleural injection |
| Autoclavable 26 G needles (26S RN 9.52 mm 40°) | Hamilton Company | 7804-04 | Utilized to conduct intrapleural injection |
| Cholera toxin B-subunit (CTB) | MilliporeSigma | C9903 | Utilized for intrapleural injection to label surviving motor neurons |
| Cholera toxin B-subunit conjugated to saporin (CTB-SAP) | Advanced Targeting Systems | IT-14 | Utilized for intrapleural injection to cause motor neuron death |
| Detachable Cable | Technomed | 202845-0000 | to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine |
| Disposable 2" x 2" disc electrode with leads | Cadwell | 302290-000 | ground electrode |
| disposable monopolar needles 28 G | Technomed | 202270-000 | cathode and anode stimulating electrodes- recording electrodes |
| EMG needle cable (Amp/stim switch box) | Cadwell | 190266-200 | to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator |
| Helping Hands alligator clip with iron base | Radio Shack | 64-079 | Maintaining recording electrode placement |
| Isoflurane (250 mL bottle) | Piramal Healthcare | ||
| monoject curved tip irrigating syringe | Covidien | 81412012 | utilized for application of electrode gel |
| PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic Warming | Kent Scientific Corporation | PS-RT | Includes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe |
| Pro trimmer Pet Grooming Kit | Oster | 078577-010-003 | clippers for hair removal |
| Saporin (SAP) | Advanced Targeting Systems | PR-01 | Utilized for intrapleural injection (control agent when injected by itself) |
| Sierra Summit EMG system | Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA | portable electrodiagnostic system | |
| SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SOMNO | Includes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter |
| Sprague-Dawley rat | Envigo colony 208a, Indianapolis, IN | ||
| Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment | Puralube | 26870 | applied during anesthesia to avoid corneal injury |
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