JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
日本語

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

横隔膜運動ニューロンの変性と補償の定量的バイオマーカーとしてのラット横隔膜運動ユニット接続性結果測定の評価

Published: April 19, 2024
doi:
10.3791/66568
, , , ,
1NextGen Precision Health,University of Missouri, 2Department of Biomedical Sciences,University of Missouri, 3Department of Physical Medicine and Rehabilitation,University of Missouri, 4Department of Neurology,University of Missouri, 5Department of Medical Pharmacology and Physiology,University of Missouri, 6Dalton Cardiovascular Research Center,University of Missouri

Summary

この研究では、ラットのダイヤフラム運動ユニットの接続性を定量化するために、運動ユニットの数とサイズを推定するための in vivo 法を紹介します。これらの手法に対する段階的なアプローチについて説明します。

Abstract

人工呼吸器筋機能の喪失は、運動ニューロンの損傷と神経変性の結果です(例:.、頸髄損傷と筋萎縮性側索硬化症)。横隔膜運動ニューロンは、中枢神経系と筋肉との間の最終的なリンクであり、それぞれの運動単位(単一の運動ニューロンによって神経支配される筋線維のグループ)は、神経筋換気システムの最小の機能単位を表しています。複合筋活動電位 (CMAP)、単一運動単位電位 (SMUP)、および運動単位数推定 (MUNE) は、動物モデルの運動単位の完全性を経時的に評価できるようにする確立された電気生理学的アプローチですが、主に四肢の筋肉に適用されています。したがって、この研究の目的は、横隔膜 MUNE、運動単位サイズ (SMUP として表される)、および CMAP を定量化するために縦断的に使用できる前臨床げっ歯類研究のアプローチを説明し、運動ニューロン損失モデルでこれらのアプローチの有用性を実証することです。運動ニューロンの損傷や疾患におけるニューロンの損傷、変性、再生に関する高感度で客観的、かつ翻訳的に関連性のあるバイオマーカーは、実験的研究の発見から臨床試験までを大幅に支援し、加速させることができます。

Introduction

C3からC6筋節レベルまで伸びる横隔膜運動ニューロン(MN)は、中枢神経系(CNS)から横隔膜筋1への最終的なリンクを形成します。横隔膜運動単位 (MU) は、単一の脊髄 MN とその神経支配された横隔膜筋線維で構成され、呼吸器系の最小の機能単位を形成します。換気機能には、横隔膜MUプールの協調的な活性化によって達成される横隔膜筋の適切な収縮が必要です2,3。筋萎縮性側索硬化症(ALS)を含む多くの神経疾患は、重度の換気障害を引き起こし、最終的には死因の一因となります4。

いくつかの電気生理学的アプローチを使用して、in vivoでの運動ユニット(MU)プールの完全性を評価および監視できます。複合筋活動電位(CMAP)は、末梢神経刺激後の特定の筋肉または筋肉群のすべての筋線維の合計脱分極を反映しており、ALS 5,6および脊髄性筋萎縮症(SMA)7,8,9を含むさまざまな神経筋状態に敏感です。CMAP評価の限界は、付随的なスプラウティングが、MU損失10の存在下でもCMAPの振幅と面積の維持につながる可能性があることである。この制限を克服するために、運動ユニット番号とサイズ11 の両方を評価するために CMAP 手法に変更が加えられました。さらに、電気生理学的システムによるダイヤフラムCMAPの機能評価を調査したin vivo研究は、記載されたダイアフラムCMAP記録技術を運動単位数推定12に利用することも可能である可能性があることを示唆した。

漸進運動単位数推定(MUNE)技術は、1970年代初頭にMcComasらによって、ヒトの指伸筋に対して最初に導入されました13。インクリメンタルMUNEアプローチは、従来のCMAP記録技術の修正であり、その間に徐々に増加する刺激が送達され、単一の運動単位応答の指標として定量的な、オールオアゼロのサブマックスインクリメントが記録されました。合計された増分と平均化された増分は、単一モーター単位電位 (SMUP) のサイズの推定値を計算するために使用されました。次に、この計算されたサイズをCMAP振幅に分割して、検査対象の筋肉を神経支配するMUの数を推定しました11。MUNEは、運動単位損失の検出と監視において高い感度を示し、CMAP振幅や面積14,15などの測定値で観察可能な変化の前に運動単位機能障害を特定することができます。ALS患者では、MUNEは非常に感度が高いことが証明されており、疾患の発症、進行、および予後の著名なバイオマーカーとして機能しています16,17。

MUNEの多数の適応が開発され、神経変性、神経損傷、および自然な老化プロセス18,19,20,21などの条件でMU機能を評価するために広く使用されています。最初の説明以来、電気生理学的応答とインクリメンタルフォース(機械的)測定の両方を利用したさまざまな適応が、人間の研究と動物モデルの両方で採用されてきました22。MUNEは、運動ニューロンと筋肉との接続性を非侵襲的に機能評価します。MUNEを縦断的に適用することで、疾患や誘発された表現型の進行を理解し、臨床および前臨床の場での治療介入の保護効果または再生効果を評価することができます。MUNE測定の再現性の有効性と、人体の大部分にわたるMUプールの技術の臨床的関連性に関係なく、努力は主にげっ歯類の筋肉の四肢筋に焦点を当ててきました10,23,24,25。

したがって、この研究の目的は、化合物筋活動電位 (CMAP)、SMUP、および横隔膜運動単位数 (MUNE) を in vivo 評価として取得するためのアプローチを説明することでした。これは、前臨床げっ歯類研究で縦断的に使用して、MUNE、運動単位サイズ (SMUP として表される)、および CMAP を定量化できます。さらに、横隔膜 MN 変性剤であるサポリンに結合したコレラ毒素 B フラグメント (CTB-SAP) の胸腔内投与後の横隔膜 MU 数の喪失を強調する代表的なデータを示します。

Protocol

すべての手順は、ミズーリ大学の動物管理および使用委員会によって確立されたガイドラインに従って承認および実施されました。実験は、11〜15週齢の成体の雄Sprague-Dawleyラットで行われました。これらのラットはペアで飼育され、12:12の明暗サイクル下に置かれ、標準的な市販のペレット食品とHCl処理水が常に利用可能でした。 1.動物の準…

Representative Results

このレポートで概説されているCMAP、SMUP、およびMUNE技術は、低侵襲電極配置を使用して横隔膜筋の神経筋機能の記録を可能にします(図1)。振幅と面積のパラメータを使用して、最大CMAPサイズを特徴付け、筋肉群の出力の全体的な尺度を提供できます(図2)。しかし、現在の方法では、CMAPとSMUPの両方のサイズを定量化するた…

Discussion

ALSなどのMN変性疾患では、換気に関与するMUを評価することが重要である28。ALS患者における呼吸器性MN変性の発生にもかかわらず、MN死の特異的な発症と進行は未だに完全には理解されていない29,30,31。この側面の重要性を認識して、遺伝的ベース(SOD1 2,32</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、ミズーリ州脊髄損傷/疾患研究プログラム(NLNおよびWDA)からの脊髄損傷/疾患研究プログラム助成金によって資金提供されました。

Materials

2 mL Glass Syringe Kent Scientific Corporation SOMNO-2ML
50 mL, Model 705 RN syringe Hamilton Company 7637-01 Utilized to conduct intrapleural injection
Autoclavable 26 G needles (26S RN 9.52 mm 40°) Hamilton Company 7804-04 Utilized to conduct intrapleural injection
Cholera toxin B-subunit (CTB) MilliporeSigma C9903 Utilized for intrapleural injection to label surviving motor neurons
Cholera toxin B-subunit conjugated to saporin (CTB-SAP) Advanced Targeting Systems IT-14 Utilized for intrapleural injection to cause motor neuron death
Detachable Cable Technomed 202845-0000 to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine
Disposable 2" x 2" disc electrode with leads Cadwell 302290-000 ground electrode
disposable monopolar needles 28 G Technomed 202270-000 cathode and anode stimulating electrodes- recording electrodes
EMG needle cable (Amp/stim switch box) Cadwell 190266-200 to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator
Helping Hands alligator clip with iron base Radio Shack 64-079 Maintaining recording electrode placement 
Isoflurane (250 mL bottle) Piramal Healthcare
monoject curved tip irrigating syringe Covidien 81412012 utilized for application of electrode gel
PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic Warming Kent Scientific Corporation PS-RT Includes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe
Pro trimmer Pet Grooming Kit Oster 078577-010-003 clippers for hair removal
Saporin (SAP) Advanced Targeting Systems PR-01 Utilized for intrapleural injection (control agent when injected by itself)
Sierra Summit EMG system Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA portable electrodiagnostic system
SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System Kent Scientific Corporation SOMNO Includes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter
Sprague-Dawley rat Envigo colony 208a, Indianapolis, IN
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment  Puralube 26870 applied during anesthesia to avoid corneal injury
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mantilla, C. B., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
  2. Nichols, N. L., Satriotomo, I., Harrigan, D. J., Mitchell, G. S. Acute intermittent hypoxia induced phrenic long-term facilitation despite increased sod1 expression in a rat model of als. Exp Neurol. 273, 138-150 (2015).
  3. Nichols, N. L., Craig, T. A., Tanner, M. A. Phrenic long-term facilitation following intrapleural ctb-sap-induced respiratory motor neuron death. Respir Physiol Neurobiol. 256, 43-49 (2018).
  4. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  5. Boërio, D., Kalmar, B., Greensmith, L., Bostock, H. Excitability properties of mouse motor axons in the mutant sod1g93a model of amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 41 (6), 774-784 (2010).
  6. Shibuya, K., et al. Motor cortical function determines prognosis in sporadic als. Neurology. 87 (5), 513-520 (2016).
  7. Lewelt, A., et al. Compound muscle action potential and motor function in children with spinal muscular atrophy. Muscle Nerve. 42 (5), 703-708 (2010).
  8. Mcgovern, V. L., et al. Smn expression is required in motor neurons to rescue electrophysiological deficits in the smnδ7 mouse model of sma. Hum Mol Genet. 24 (19), 5524-5541 (2015).
  9. Arnold, W. D., et al. Electrophysiological biomarkers in spinal muscular atrophy: Preclinical proof of concept. Ann Clin Transl Neurol. 1 (1), 34-44 (2014).
  10. Harrigan, M. E., et al. Assessing rat forelimb and hindlimb motor unit connectivity as objective and robust biomarkers of spinal motor neuron function. Sci Rep. 9 (1), 16699 (2019).
  11. Arnold, W. D., et al. Electrophysiological motor unit number estimation (mune) measuring compound muscle action potential (cmap) in mouse hindlimb muscles. J. Vis. Exp: JoVE. (103), e52899 (2015).
  12. Martin, M., Li, K., Wright, M. C., Lepore, A. C. Functional and morphological assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons. J. Vis. Exp: JoVE. (99), e52605 (2015).
  13. Mccomas, A., Fawcett, P. R. W., Campbell, M., Sica, R. Electrophysiological estimation of the number of motor units within a human muscle. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 34 (2), 121-131 (1971).
  14. Felice, K. J. A longitudinal study comparing thenar motor unit number estimates to other quantitative tests in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 20 (2), 179-185 (1997).
  15. Vucic, S., Rutkove, S. B. Neurophysiological biomarkers in amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 31 (5), 640-647 (2018).
  16. Carleton, S., Brown, W. Changes in motor unit populations in motor neurone disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 42 (1), 42-51 (1979).
  17. Yuen, E. C., Olney, R. K. Longitudinal study of fiber density and motor unit number estimate in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Neurology. 49 (2), 573-578 (1997).
  18. Gooch, C. L., et al. Motor unit number estimation: A technology and literature review. Muscle Nerve. 50 (6), 884-893 (2014).
  19. Henderson, R. D., Ridall, P. G., Hutchinson, N. M., Pettitt, A. N., Mccombe, P. A. Bayesian statistical mune method. Muscle Nerve. 36 (2), 206-213 (2007).
  20. Shefner, J., et al. Multipoint incremental motor unit number estimation as an outcome measure in als. Neurology. 77 (3), 235-241 (2011).
  21. Stein, R. B., Yang, J. F. Methods for estimating the number of motor units in human muscles. Ann Neurol. 28 (4), 487-495 (1990).
  22. Shefner, J. M. Motor unit number estimation in human neurological diseases and animal models. Clin Neurophysiol. 112 (6), 955-964 (2001).
  23. Ahad, M., Rutkove, S. Correlation between muscle electrical impedance data and standard neurophysiologic parameters after experimental neurogenic injury. Physiol Meas. 31 (11), 1437 (2010).
  24. Kasselman, L. J., Shefner, J. M., Rutkove, S. B. Motor unit number estimation in the rat tail using a modified multipoint stimulation technique. Muscle Nerve. 40 (1), 115-121 (2009).
  25. Ngo, S., et al. The relationship between bayesian motor unit number estimation and histological measurements of motor neurons in wild-type and sod1g93a mice. Clin Neurophysiol. 123 (10), 2080-2091 (2012).
  26. Feasby, T., Brown, W. Variation of motor unit size in the human extensor digitorum brevis and thenar muscles. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 37 (8), 916-926 (1974).
  27. Nichols, N. L., Vinit, S., Bauernschmidt, L., Mitchell, G. S. Respiratory function after selective respiratory motor neuron death from intrapleural ctb-saporin injections. Exp Neurol. 267, 18-29 (2015).
  28. Nichols, N. L., et al. Ventilatory control in als. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 429-437 (2013).
  29. Cifra, A., Nani, F., Nistri, A. Respiratory motoneurons and pathological conditions: Lessons from hypoglossal motoneurons challenged by excitotoxic or oxidative stress. Respir Physiol Neurobiol. 179 (1), 89-96 (2011).
  30. Kobayashi, Z., et al. Fals with gly72ser mutation in sod1 gene: Report of a family including the first autopsy case. J Neurol Sci. 300 (1), 9-13 (2011).
  31. Su, M., Wakabayashi, K., Tanno, Y., Inuzuka, T., Takahashi, H. An autopsy case of amyotrophic lateral sclerosis with concomitant alzheimer’s and incidental lewy body diseases. No to shinkei= Brain and nerve. 48 (10), 931-936 (1996).
  32. Lladó, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the sod1 g93a transgenic rat model of als. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
  33. Borkowski, L. F., Smith, C. L., Keilholz, A. N., Nichols, N. L. Divergent receptor utilization is necessary for phrenic long-term facilitation over the course of motor neuron loss following ctb-sap intrapleural injections. J Neurophysiol. 126 (3), 709-722 (2021).
  34. Nicolopoulos-Stournaras, S., Iles, J. F. Motor neuron columns in the lumbar spinal cord of the rat. J Comp Neurol. 217 (1), 75-85 (1983).
  35. Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting motor end plates for delivery of adenoviruses: An approach to maximize uptake and transduction of spinal cord motor neurons. Sci Rep. 6 (1), 33058 (2016).
  36. Mchanwell, S., Biscoe, T. The localization of motoneurons supplying the hindlimb muscles of the mouse. Phil. Trans. R. , 477-508 (1981).
  37. Nair, J., et al. Histological identification of phrenic afferent projections to the spinal cord. Respir Physiol Neurobiol. 236, 57-68 (2017).
  38. Courtine, G., et al. Can experiments in nonhuman primates expedite the translation of treatments for spinal cord injury in humans. Nat Med. 13 (5), 561-566 (2007).
  39. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Sci Transl Med. 7 (302), 134 (2015).
  40. Arnold, R., et al. Nerve excitability in the rat forelimb: A technique to improve translational utility. J Neurosci Methods. 275, 19-24 (2017).
  41. Boriek, A., Rodarte, J., Reid, M. Shape and tension distribution of the passive rat diaphragm. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 280, R33-R41 (2001).

Tags

DiaphragmMotor UnitPhrenic Motor NeuronCMAPSMUPMUNENeuromuscularVentilatory SystemBiomarkersNeurodegenerationMotor Neuron InjuryAmyotrophic Lateral SclerosisSpinal Cord Injury
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ketabforoush, A., Wang, M., Smith, C. L., Arnold, W. D., Nichols, N. L. Assessing Rat Diaphragm Motor Unit Connectivity Outcome Measures as Quantitative Biomarkers of Phrenic Motor Neuron Degeneration and Compensation. J. Vis. Exp. (206), e66568, doi:10.3791/66568 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image