Evaluación de las medidas de resultado de la conectividad de la unidad motora del diafragma de rata como biomarcadores cuantitativos de la degeneración y compensación de las neuronas motoras frénicas
Summary
En este estudio, presentamos un método in vivo para estimar el número y el tamaño de la unidad motora para cuantificar la conectividad de la unidad motora de diafragma de rata. Se describe un enfoque paso a paso de estas técnicas.
Abstract
La pérdida de la función muscular ventilatoria es una consecuencia de la lesión de la neurona motora y la neurodegeneración (por ejemplo, lesión de la médula espinal cervical y esclerosis lateral amiotrófica, respectivamente). Las neuronas motoras frénicas son el eslabón final entre el sistema nervioso central y el músculo, y sus respectivas unidades motoras (grupos de fibras musculares inervadas por una sola neurona motora) representan la unidad funcional más pequeña del sistema ventilatorio neuromuscular. El potencial de acción muscular compuesto (CMAP), el potencial de unidad motora única (SMUP) y la estimación del número de unidades motoras (MUNE) son enfoques electrofisiológicos establecidos que permiten la evaluación longitudinal de la integridad de la unidad motora en modelos animales a lo largo del tiempo, pero se han aplicado principalmente a los músculos de las extremidades. Por lo tanto, los objetivos de este estudio son describir un enfoque en estudios preclínicos con roedores que se pueda utilizar longitudinalmente para cuantificar el MUNE frénico, el tamaño de la unidad motora (representado como SMUP) y CMAP, y luego demostrar la utilidad de estos enfoques en un modelo de pérdida de neuronas motoras. Los biomarcadores sensibles, objetivos y traslacionalmente relevantes para la lesión, degeneración y regeneración neuronal en lesiones y enfermedades de las neuronas motoras pueden ayudar significativamente y acelerar los descubrimientos de la investigación experimental para las pruebas clínicas.
Introduction
Las neuronas motoras frénicas (MN), que se extienden desde los niveles de miotoma C3 hasta C6, forman el enlace final desde el sistema nervioso central (SNC) hasta el músculo del diafragma1. Las unidades motoras frénicas (UM) están compuestas por una sola MN espinal y sus fibras musculares diafragmáticas inervadas, formando la unidad funcional más pequeña del sistema neuromuscular respiratorio. La función ventilatoria requiere una contracción adecuada del músculo diafragma lograda a través de la activación coordinada de la piscina frénica MU 2,3. Muchas enfermedades neurológicas, incluida la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), provocan una insuficiencia ventilatoria grave, lo que en última instancia contribuye a la causa de la muerte4.
Se pueden emplear varios enfoques electrofisiológicos para evaluar y monitorear la integridad del grupo de la unidad motora (MU) in vivo. El potencial de acción muscular compuesto (CMAP) refleja la despolarización sumada de todas las fibras musculares en un músculo o grupo muscular específico después de la estimulación de los nervios periféricos y es sensible a una variedad de afecciones neuromusculares, incluida la ELA 5,6 y la atrofia muscular espinal (AME)7,8,9. Una limitación de la evaluación de CMAP es que la germinación de colaterales puede conducir a un mantenimiento de la amplitud y el área de CMAP incluso en presencia de pérdida de MU10. Para superar esta limitación, se han realizado modificaciones en la técnica CMAP para evaluar tanto el número de unidades motoras como el tamaño11. Además, un estudio in vivo que investigó la evaluación funcional del CMAP del diafragma mediante un sistema electrofisiológico sugirió que también puede ser factible utilizar la técnica de registro CMAP del diafragma descrita para la estimación del número de unidades motoras12.
La técnica de estimación incremental del número de unidades motoras (MUNE) fue introducida inicialmente a principios de la década de 1970 por McComas et al. para el músculo extensor corto de los dedos en humanos13. El enfoque MUNE incremental fue una modificación de la técnica tradicional de registro CMAP durante la cual se administró una estimulación gradualmente creciente para registrar incrementos submáximos cuánticos, de todo o nada, como índices de respuestas de una sola unidad motora. Los incrementos sumados y promediados se utilizaron para calcular una estimación del tamaño de un potencial de unidad de motor (SMUP). Este tamaño calculado se dividió en la amplitud del CMAP para estimar el número de MU que inervaban el músculo examinado11. MUNE demuestra una alta sensibilidad en la detección y monitorización de la pérdida de unidad motora, lo que permite la identificación de la disfunción de la unidad motora antes de cambios observables en medidas como la amplitud del CMAP o el área14,15. En los pacientes con ELA, MUNE ha demostrado ser excepcionalmente sensible, sirviendo como un biomarcador destacado para el inicio, la progresión y el pronóstico de la enfermedad16,17.
Se han desarrollado y utilizado ampliamente numerosas adaptaciones de MUNE para evaluar la función de MU en condiciones como la neurodegeneración, la lesión neuronal y el proceso natural de envejecimiento 18,19,20,21. Desde la descripción inicial, se han empleado diversas adaptaciones que utilizan tanto respuestas electrofisiológicas como mediciones de fuerza incremental (mecánicas) tanto en estudios humanos como en modelos animales22. MUNE proporciona una evaluación funcional no invasiva de la conectividad de las neuronas motoras con el músculo. La aplicación longitudinal de MUNE permite comprender la progresión de la enfermedad o del fenotipo inducido y evaluar los efectos protectores o regenerativos de las intervenciones terapéuticas, tanto en el ámbito clínico como en el preclínico. Independientemente de la efectividad de las medidas de MUNE para la reproducibilidad y la relevancia clínica de la técnica para las piscinas de MU en la mayor parte del cuerpo humano, los esfuerzos se han centrado en gran medida en los músculos de las extremidades en los músculos de los roedores 10,23,24,25.
Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron describir un enfoque para la obtención del potencial de acción muscular compuesto (CMAP), el SMUP y el número de unidades motoras frénicas (MUNE) como evaluaciones in vivo que se pueden utilizar longitudinalmente en estudios preclínicos con roedores para cuantificar el MUNE, el tamaño de la unidad motora (representado como SMUP) y el CMAP. Además, presentamos datos representativos que destacan la pérdida del número de MU del diafragma tras la administración intrapleural de un agente degenerativo frénico MN, el fragmento B de la toxina del cólera conjugado con saporina (CTB-SAP).
Protocol
Representative Results
Discussion
En las enfermedades degenerativas de la EM, como la ELA, es crucial evaluar las UM implicadas en la ventilación28. A pesar de la ocurrencia de degeneración respiratoria por MN en pacientes con ELA, el inicio específico y la progresión de la muerte por MN siguen siendo incompletamente comprendidos 29,30,31. Reconociendo la importancia de este aspecto, se han empleado v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una subvención del Programa de Investigación de Lesiones/Enfermedades de la Médula Espinal del Programa de Investigación de Lesiones/Enfermedades de la Médula Espinal de Missouri (NLN y WDA).
Materials
| 2 mL Glass Syringe | Kent Scientific Corporation | SOMNO-2ML | |
| 50 mL, Model 705 RN syringe | Hamilton Company | 7637-01 | Utilized to conduct intrapleural injection |
| Autoclavable 26 G needles (26S RN 9.52 mm 40°) | Hamilton Company | 7804-04 | Utilized to conduct intrapleural injection |
| Cholera toxin B-subunit (CTB) | MilliporeSigma | C9903 | Utilized for intrapleural injection to label surviving motor neurons |
| Cholera toxin B-subunit conjugated to saporin (CTB-SAP) | Advanced Targeting Systems | IT-14 | Utilized for intrapleural injection to cause motor neuron death |
| Detachable Cable | Technomed | 202845-0000 | to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine |
| Disposable 2" x 2" disc electrode with leads | Cadwell | 302290-000 | ground electrode |
| disposable monopolar needles 28 G | Technomed | 202270-000 | cathode and anode stimulating electrodes- recording electrodes |
| EMG needle cable (Amp/stim switch box) | Cadwell | 190266-200 | to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator |
| Helping Hands alligator clip with iron base | Radio Shack | 64-079 | Maintaining recording electrode placement |
| Isoflurane (250 mL bottle) | Piramal Healthcare | ||
| monoject curved tip irrigating syringe | Covidien | 81412012 | utilized for application of electrode gel |
| PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic Warming | Kent Scientific Corporation | PS-RT | Includes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe |
| Pro trimmer Pet Grooming Kit | Oster | 078577-010-003 | clippers for hair removal |
| Saporin (SAP) | Advanced Targeting Systems | PR-01 | Utilized for intrapleural injection (control agent when injected by itself) |
| Sierra Summit EMG system | Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA | portable electrodiagnostic system | |
| SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SOMNO | Includes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter |
| Sprague-Dawley rat | Envigo colony 208a, Indianapolis, IN | ||
| Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment | Puralube | 26870 | applied during anesthesia to avoid corneal injury |
References
- Mantilla, C. B., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nichols, N. L., Satriotomo, I., Harrigan, D. J., Mitchell, G. S. Acute intermittent hypoxia induced phrenic long-term facilitation despite increased sod1 expression in a rat model of als. Exp Neurol. 273, 138-150 (2015).
- Nichols, N. L., Craig, T. A., Tanner, M. A. Phrenic long-term facilitation following intrapleural ctb-sap-induced respiratory motor neuron death. Respir Physiol Neurobiol. 256, 43-49 (2018).
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Boërio, D., Kalmar, B., Greensmith, L., Bostock, H. Excitability properties of mouse motor axons in the mutant sod1g93a model of amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 41 (6), 774-784 (2010).
- Shibuya, K., et al. Motor cortical function determines prognosis in sporadic als. Neurology. 87 (5), 513-520 (2016).
- Lewelt, A., et al. Compound muscle action potential and motor function in children with spinal muscular atrophy. Muscle Nerve. 42 (5), 703-708 (2010).
- Mcgovern, V. L., et al. Smn expression is required in motor neurons to rescue electrophysiological deficits in the smnδ7 mouse model of sma. Hum Mol Genet. 24 (19), 5524-5541 (2015).
- Arnold, W. D., et al. Electrophysiological biomarkers in spinal muscular atrophy: Preclinical proof of concept. Ann Clin Transl Neurol. 1 (1), 34-44 (2014).
- Harrigan, M. E., et al. Assessing rat forelimb and hindlimb motor unit connectivity as objective and robust biomarkers of spinal motor neuron function. Sci Rep. 9 (1), 16699 (2019).
- Arnold, W. D., et al. Electrophysiological motor unit number estimation (mune) measuring compound muscle action potential (cmap) in mouse hindlimb muscles. J. Vis. Exp: JoVE. (103), e52899 (2015).
- Martin, M., Li, K., Wright, M. C., Lepore, A. C. Functional and morphological assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons. J. Vis. Exp: JoVE. (99), e52605 (2015).
- Mccomas, A., Fawcett, P. R. W., Campbell, M., Sica, R. Electrophysiological estimation of the number of motor units within a human muscle. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 34 (2), 121-131 (1971).
- Felice, K. J. A longitudinal study comparing thenar motor unit number estimates to other quantitative tests in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 20 (2), 179-185 (1997).
- Vucic, S., Rutkove, S. B. Neurophysiological biomarkers in amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 31 (5), 640-647 (2018).
- Carleton, S., Brown, W. Changes in motor unit populations in motor neurone disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 42 (1), 42-51 (1979).
- Yuen, E. C., Olney, R. K. Longitudinal study of fiber density and motor unit number estimate in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Neurology. 49 (2), 573-578 (1997).
- Gooch, C. L., et al. Motor unit number estimation: A technology and literature review. Muscle Nerve. 50 (6), 884-893 (2014).
- Henderson, R. D., Ridall, P. G., Hutchinson, N. M., Pettitt, A. N., Mccombe, P. A. Bayesian statistical mune method. Muscle Nerve. 36 (2), 206-213 (2007).
- Shefner, J., et al. Multipoint incremental motor unit number estimation as an outcome measure in als. Neurology. 77 (3), 235-241 (2011).
- Stein, R. B., Yang, J. F. Methods for estimating the number of motor units in human muscles. Ann Neurol. 28 (4), 487-495 (1990).
- Shefner, J. M. Motor unit number estimation in human neurological diseases and animal models. Clin Neurophysiol. 112 (6), 955-964 (2001).
- Ahad, M., Rutkove, S. Correlation between muscle electrical impedance data and standard neurophysiologic parameters after experimental neurogenic injury. Physiol Meas. 31 (11), 1437 (2010).
- Kasselman, L. J., Shefner, J. M., Rutkove, S. B. Motor unit number estimation in the rat tail using a modified multipoint stimulation technique. Muscle Nerve. 40 (1), 115-121 (2009).
- Ngo, S., et al. The relationship between bayesian motor unit number estimation and histological measurements of motor neurons in wild-type and sod1g93a mice. Clin Neurophysiol. 123 (10), 2080-2091 (2012).
- Feasby, T., Brown, W. Variation of motor unit size in the human extensor digitorum brevis and thenar muscles. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 37 (8), 916-926 (1974).
- Nichols, N. L., Vinit, S., Bauernschmidt, L., Mitchell, G. S. Respiratory function after selective respiratory motor neuron death from intrapleural ctb-saporin injections. Exp Neurol. 267, 18-29 (2015).
- Nichols, N. L., et al. Ventilatory control in als. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 429-437 (2013).
- Cifra, A., Nani, F., Nistri, A. Respiratory motoneurons and pathological conditions: Lessons from hypoglossal motoneurons challenged by excitotoxic or oxidative stress. Respir Physiol Neurobiol. 179 (1), 89-96 (2011).
- Kobayashi, Z., et al. Fals with gly72ser mutation in sod1 gene: Report of a family including the first autopsy case. J Neurol Sci. 300 (1), 9-13 (2011).
- Su, M., Wakabayashi, K., Tanno, Y., Inuzuka, T., Takahashi, H. An autopsy case of amyotrophic lateral sclerosis with concomitant alzheimer’s and incidental lewy body diseases. No to shinkei= Brain and nerve. 48 (10), 931-936 (1996).
- Lladó, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the sod1 g93a transgenic rat model of als. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Borkowski, L. F., Smith, C. L., Keilholz, A. N., Nichols, N. L. Divergent receptor utilization is necessary for phrenic long-term facilitation over the course of motor neuron loss following ctb-sap intrapleural injections. J Neurophysiol. 126 (3), 709-722 (2021).
- Nicolopoulos-Stournaras, S., Iles, J. F. Motor neuron columns in the lumbar spinal cord of the rat. J Comp Neurol. 217 (1), 75-85 (1983).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting motor end plates for delivery of adenoviruses: An approach to maximize uptake and transduction of spinal cord motor neurons. Sci Rep. 6 (1), 33058 (2016).
- Mchanwell, S., Biscoe, T. The localization of motoneurons supplying the hindlimb muscles of the mouse. Phil. Trans. R. , 477-508 (1981).
- Nair, J., et al. Histological identification of phrenic afferent projections to the spinal cord. Respir Physiol Neurobiol. 236, 57-68 (2017).
- Courtine, G., et al. Can experiments in nonhuman primates expedite the translation of treatments for spinal cord injury in humans. Nat Med. 13 (5), 561-566 (2007).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Sci Transl Med. 7 (302), 134 (2015).
- Arnold, R., et al. Nerve excitability in the rat forelimb: A technique to improve translational utility. J Neurosci Methods. 275, 19-24 (2017).
- Boriek, A., Rodarte, J., Reid, M. Shape and tension distribution of the passive rat diaphragm. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 280, R33-R41 (2001).
.