Frenik Motor Nöron Dejenerasyonu ve Kompanzasyonunun Kantitatif Biyobelirteçleri Olarak Sıçan Diyafram Motor Ünitesi Bağlantı Sonuç Ölçütlerinin Değerlendirilmesi
Summary
Bu çalışmada, sıçan diyaframlı motor ünitesi bağlantısını ölçmek için motor ünite sayısını ve boyutunu tahmin etmek için in vivo bir yöntem sunuyoruz. Bu tekniklere adım adım bir yaklaşım açıklanmaktadır.
Abstract
Ventilasyon kas fonksiyonunun kaybı, motor nöron hasarı ve nörodejenerasyonun bir sonucudur (ör., sırasıyla, servikal omurilik yaralanması ve amyotrofik lateral skleroz). Frenik motor nöronlar, merkezi sinir sistemi ile kas arasındaki son bağlantıdır ve ilgili motor birimleri (tek bir motor nöron tarafından innerve edilen kas lifi grupları), nöromüsküler ventilasyon sisteminin en küçük fonksiyonel birimini temsil eder. Bileşik kas aksiyon potansiyeli (CMAP), tek motor ünite potansiyeli (SMUP) ve motor ünite sayısı tahmini (MUNE), hayvan modellerinde zaman içinde motor ünite bütünlüğünün uzunlamasına değerlendirilmesini sağlayan yerleşik elektrofizyolojik yaklaşımlardır, ancak çoğunlukla ekstremite kaslarına uygulanmıştır. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, preklinik kemirgen çalışmalarında, frenik MUNE, motor ünite boyutu (SMUP olarak temsil edilir) ve CMAP’yi ölçmek için uzunlamasına kullanılabilecek bir yaklaşımı tanımlamak ve daha sonra bu yaklaşımların bir motor nöron kaybı modelinde faydasını göstermektir. Motor nöron hasarı ve hastalıklarında nöronal hasar, dejenerasyon ve rejenerasyon için hassas, objektif ve translasyonel olarak ilgili biyobelirteçler, deneysel araştırma keşiflerine klinik testlere önemli ölçüde yardımcı olabilir ve hızlandırabilir.
Introduction
C3’ten C6 miyotom seviyelerine kadar uzanan frenik motor nöronlar (MN’ler), merkezi sinir sisteminden (MSS) diyafram kasına1 son bağlantıyı oluşturur. Frenik motor üniteler (MU), solunumsal nöromusküler sistemin en küçük fonksiyonel ünitesini oluşturan tek bir spinal MN ve onun innerve diyafram kas liflerinden oluşur. Ventilasyon fonksiyonu, frenik MU havuzunun koordineli aktivasyonu ile elde edilen diyafram kasının yeterli kasılmasını gerektirir 2,3. Amyotrofik lateral skleroz (ALS) dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalık, ciddi ventilasyon bozukluğuna neden olur ve sonuçta ölüm nedenine katkıda bulunur4.
Motor ünitesi (MU) havuzunun bütünlüğünü in vivo olarak değerlendirmek ve izlemek için çeşitli elektrofizyolojik yaklaşımlar kullanılabilir. Bileşik kas aksiyon potansiyeli (CMAP), periferik sinir stimülasyonundan sonra belirli bir kas veya kas grubundaki tüm kas liflerinin toplam depolarizasyonunu yansıtır ve ALS 5,6 ve spinal müsküler atrofi (SMA) dahil olmak üzere bir dizi nöromüsküler duruma duyarlıdır7,8,9. CMAP değerlendirmesinin bir sınırlaması, teminat filizlenmesinin, MU kaybı10 varlığında bile CMAP genliğinin ve alanının korunmasına yol açabilmesidir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, hem motor ünite numarasını hem de11 boyutunu değerlendirmek için CMAP tekniğinde değişiklikler yapılmıştır. Ek olarak, diyafram CMAP’nin bir elektrofizyolojik sistem tarafından fonksiyonel değerlendirmesini araştıran bir in vivo çalışma, motor ünite numarası tahmini12 için açıklanan diyafram CMAP kayıt tekniğinin kullanılmasının da mümkün olabileceğini düşündürmektedir.
Artımlı motor birim sayısı tahmini (MUNE) tekniği ilk olarak 1970’lerin başında McComas ve ark. insanlarda ekstansör digitorum brevis kası için13. Artımlı MUNE yaklaşımı, tek motor ünite tepkilerinin indeksleri olarak nicel, ya hep ya hiç submaksimal artışları kaydetmek için kademeli olarak artan bir stimülasyonun sağlandığı geleneksel CMAP kayıt tekniğinin bir modifikasyonuydu. Toplanan ve ortalaması alınan artışlar, tek bir motor birim potansiyelinin (SMUP) boyutu için bir tahmin hesaplamak için kullanıldı. Hesaplanan bu boyut daha sonra incelenen kası innerve eden MU’ların sayısını tahmin etmek için CMAP genliğine bölündü11. MUNE, motor ünite kaybını tespit etmede ve izlemede yüksek hassasiyet gösterir ve CMAP genliği veya alan14,15 gibi ölçümlerde gözlemlenebilir değişikliklerden önce motor ünite disfonksiyonunun tanımlanmasına olanak tanır. ALS hastalarında, MUNE’nin son derece hassas olduğu kanıtlanmıştır ve hastalık başlangıcı, ilerlemesi ve prognozu için önemli bir biyobelirteç olarak hizmet etmektedir 16,17.
Nörodejenerasyon, nöral yaralanma ve doğal yaşlanma süreci gibi durumlarda MU fonksiyonunu değerlendirmek için çok sayıda MUNE adaptasyonu geliştirilmiş ve yaygın olarak kullanılmıştır 18,19,20,21. İlk tanımlamadan bu yana, hem insan çalışmalarında hem de hayvan modellerinde hem elektrofizyolojik tepkileri hem de artımlı kuvvet (mekanik) ölçümlerini kullanan çeşitli uyarlamalar kullanılmıştır22. MUNE, kas ile motor nöron bağlantısının non-invaziv fonksiyonel bir değerlendirmesini sağlar. Uzunlamasına MUNE uygulamak, hem klinik hem de klinik öncesi ortamlarda hastalık veya indüklenmiş fenotip ilerlemesinin anlaşılmasını ve terapötik müdahalelerin koruyucu veya rejeneratif etkilerinin değerlendirilmesini sağlar. MUNE ölçümlerinin etkinliğinden bağımsız olarak, tekrarlanabilirlik ve tekniğin insan vücudunun çoğu boyunca MU havuzları için klinik önemi ne olursa olsun, çabalar büyük ölçüde kemirgen kaslarındaki uzuv kaslarına odaklanmıştır 10,23,24,25.
Bu nedenle, bu çalışmanın amaçları, MUNE, motor ünite boyutu (SMUP olarak temsil edilir) ve CMAP’yi ölçmek için klinik öncesi kemirgen çalışmalarında uzunlamasına kullanılabilecek in vivo değerlendirmeler olarak bileşik kas aksiyon potansiyeli (CMAP), SMUP ve frenik motor ünite numarası (MUNE) elde etmeye yönelik bir yaklaşımı tanımlamaktı. Ayrıca, frenik bir MN dejeneratif ajan olan saporine konjuge kolera toksin B fragmanının (CTB-SAP) intraplevral uygulamasını takiben diyafram MU sayısı kaybını vurgulayan temsili veriler sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
ALS gibi MN dejeneratif hastalıklarda, ventilasyonda yer alan MU’ların değerlendirilmesi çok önemlidir28. ALS hastalarında respiratuar MN dejenerasyonu ortaya çıkmasına rağmen, MN ölümünün spesifik başlangıcı ve ilerlemesi tam olarak anlaşılamamıştır 29,30,31. Bu yönün önemini kabul ederek, hem genetik temelli (örneğin, SOD1</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Missouri Omurilik Yaralanması/Hastalığı Araştırma Programı’ndan (NLN ve WDA) Omurilik Yaralanması/Hastalığı Araştırma Programı Hibesi ile finanse edilmiştir.
Materials
| 2 mL Glass Syringe | Kent Scientific Corporation | SOMNO-2ML | |
| 50 mL, Model 705 RN syringe | Hamilton Company | 7637-01 | Utilized to conduct intrapleural injection |
| Autoclavable 26 G needles (26S RN 9.52 mm 40°) | Hamilton Company | 7804-04 | Utilized to conduct intrapleural injection |
| Cholera toxin B-subunit (CTB) | MilliporeSigma | C9903 | Utilized for intrapleural injection to label surviving motor neurons |
| Cholera toxin B-subunit conjugated to saporin (CTB-SAP) | Advanced Targeting Systems | IT-14 | Utilized for intrapleural injection to cause motor neuron death |
| Detachable Cable | Technomed | 202845-0000 | to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine |
| Disposable 2" x 2" disc electrode with leads | Cadwell | 302290-000 | ground electrode |
| disposable monopolar needles 28 G | Technomed | 202270-000 | cathode and anode stimulating electrodes- recording electrodes |
| EMG needle cable (Amp/stim switch box) | Cadwell | 190266-200 | to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator |
| Helping Hands alligator clip with iron base | Radio Shack | 64-079 | Maintaining recording electrode placement |
| Isoflurane (250 mL bottle) | Piramal Healthcare | ||
| monoject curved tip irrigating syringe | Covidien | 81412012 | utilized for application of electrode gel |
| PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic Warming | Kent Scientific Corporation | PS-RT | Includes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe |
| Pro trimmer Pet Grooming Kit | Oster | 078577-010-003 | clippers for hair removal |
| Saporin (SAP) | Advanced Targeting Systems | PR-01 | Utilized for intrapleural injection (control agent when injected by itself) |
| Sierra Summit EMG system | Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA | portable electrodiagnostic system | |
| SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SOMNO | Includes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter |
| Sprague-Dawley rat | Envigo colony 208a, Indianapolis, IN | ||
| Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment | Puralube | 26870 | applied during anesthesia to avoid corneal injury |
References
- Mantilla, C. B., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nichols, N. L., Satriotomo, I., Harrigan, D. J., Mitchell, G. S. Acute intermittent hypoxia induced phrenic long-term facilitation despite increased sod1 expression in a rat model of als. Exp Neurol. 273, 138-150 (2015).
- Nichols, N. L., Craig, T. A., Tanner, M. A. Phrenic long-term facilitation following intrapleural ctb-sap-induced respiratory motor neuron death. Respir Physiol Neurobiol. 256, 43-49 (2018).
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Boërio, D., Kalmar, B., Greensmith, L., Bostock, H. Excitability properties of mouse motor axons in the mutant sod1g93a model of amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 41 (6), 774-784 (2010).
- Shibuya, K., et al. Motor cortical function determines prognosis in sporadic als. Neurology. 87 (5), 513-520 (2016).
- Lewelt, A., et al. Compound muscle action potential and motor function in children with spinal muscular atrophy. Muscle Nerve. 42 (5), 703-708 (2010).
- Mcgovern, V. L., et al. Smn expression is required in motor neurons to rescue electrophysiological deficits in the smnδ7 mouse model of sma. Hum Mol Genet. 24 (19), 5524-5541 (2015).
- Arnold, W. D., et al. Electrophysiological biomarkers in spinal muscular atrophy: Preclinical proof of concept. Ann Clin Transl Neurol. 1 (1), 34-44 (2014).
- Harrigan, M. E., et al. Assessing rat forelimb and hindlimb motor unit connectivity as objective and robust biomarkers of spinal motor neuron function. Sci Rep. 9 (1), 16699 (2019).
- Arnold, W. D., et al. Electrophysiological motor unit number estimation (mune) measuring compound muscle action potential (cmap) in mouse hindlimb muscles. J. Vis. Exp: JoVE. (103), e52899 (2015).
- Martin, M., Li, K., Wright, M. C., Lepore, A. C. Functional and morphological assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons. J. Vis. Exp: JoVE. (99), e52605 (2015).
- Mccomas, A., Fawcett, P. R. W., Campbell, M., Sica, R. Electrophysiological estimation of the number of motor units within a human muscle. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 34 (2), 121-131 (1971).
- Felice, K. J. A longitudinal study comparing thenar motor unit number estimates to other quantitative tests in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 20 (2), 179-185 (1997).
- Vucic, S., Rutkove, S. B. Neurophysiological biomarkers in amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 31 (5), 640-647 (2018).
- Carleton, S., Brown, W. Changes in motor unit populations in motor neurone disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 42 (1), 42-51 (1979).
- Yuen, E. C., Olney, R. K. Longitudinal study of fiber density and motor unit number estimate in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Neurology. 49 (2), 573-578 (1997).
- Gooch, C. L., et al. Motor unit number estimation: A technology and literature review. Muscle Nerve. 50 (6), 884-893 (2014).
- Henderson, R. D., Ridall, P. G., Hutchinson, N. M., Pettitt, A. N., Mccombe, P. A. Bayesian statistical mune method. Muscle Nerve. 36 (2), 206-213 (2007).
- Shefner, J., et al. Multipoint incremental motor unit number estimation as an outcome measure in als. Neurology. 77 (3), 235-241 (2011).
- Stein, R. B., Yang, J. F. Methods for estimating the number of motor units in human muscles. Ann Neurol. 28 (4), 487-495 (1990).
- Shefner, J. M. Motor unit number estimation in human neurological diseases and animal models. Clin Neurophysiol. 112 (6), 955-964 (2001).
- Ahad, M., Rutkove, S. Correlation between muscle electrical impedance data and standard neurophysiologic parameters after experimental neurogenic injury. Physiol Meas. 31 (11), 1437 (2010).
- Kasselman, L. J., Shefner, J. M., Rutkove, S. B. Motor unit number estimation in the rat tail using a modified multipoint stimulation technique. Muscle Nerve. 40 (1), 115-121 (2009).
- Ngo, S., et al. The relationship between bayesian motor unit number estimation and histological measurements of motor neurons in wild-type and sod1g93a mice. Clin Neurophysiol. 123 (10), 2080-2091 (2012).
- Feasby, T., Brown, W. Variation of motor unit size in the human extensor digitorum brevis and thenar muscles. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 37 (8), 916-926 (1974).
- Nichols, N. L., Vinit, S., Bauernschmidt, L., Mitchell, G. S. Respiratory function after selective respiratory motor neuron death from intrapleural ctb-saporin injections. Exp Neurol. 267, 18-29 (2015).
- Nichols, N. L., et al. Ventilatory control in als. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 429-437 (2013).
- Cifra, A., Nani, F., Nistri, A. Respiratory motoneurons and pathological conditions: Lessons from hypoglossal motoneurons challenged by excitotoxic or oxidative stress. Respir Physiol Neurobiol. 179 (1), 89-96 (2011).
- Kobayashi, Z., et al. Fals with gly72ser mutation in sod1 gene: Report of a family including the first autopsy case. J Neurol Sci. 300 (1), 9-13 (2011).
- Su, M., Wakabayashi, K., Tanno, Y., Inuzuka, T., Takahashi, H. An autopsy case of amyotrophic lateral sclerosis with concomitant alzheimer’s and incidental lewy body diseases. No to shinkei= Brain and nerve. 48 (10), 931-936 (1996).
- Lladó, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the sod1 g93a transgenic rat model of als. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Borkowski, L. F., Smith, C. L., Keilholz, A. N., Nichols, N. L. Divergent receptor utilization is necessary for phrenic long-term facilitation over the course of motor neuron loss following ctb-sap intrapleural injections. J Neurophysiol. 126 (3), 709-722 (2021).
- Nicolopoulos-Stournaras, S., Iles, J. F. Motor neuron columns in the lumbar spinal cord of the rat. J Comp Neurol. 217 (1), 75-85 (1983).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting motor end plates for delivery of adenoviruses: An approach to maximize uptake and transduction of spinal cord motor neurons. Sci Rep. 6 (1), 33058 (2016).
- Mchanwell, S., Biscoe, T. The localization of motoneurons supplying the hindlimb muscles of the mouse. Phil. Trans. R. , 477-508 (1981).
- Nair, J., et al. Histological identification of phrenic afferent projections to the spinal cord. Respir Physiol Neurobiol. 236, 57-68 (2017).
- Courtine, G., et al. Can experiments in nonhuman primates expedite the translation of treatments for spinal cord injury in humans. Nat Med. 13 (5), 561-566 (2007).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Sci Transl Med. 7 (302), 134 (2015).
- Arnold, R., et al. Nerve excitability in the rat forelimb: A technique to improve translational utility. J Neurosci Methods. 275, 19-24 (2017).
- Boriek, A., Rodarte, J., Reid, M. Shape and tension distribution of the passive rat diaphragm. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 280, R33-R41 (2001).
.