Séparation et affichage rapides d’agents fibrinogénolytiques actifs chez Sipunculus nudus par électrophorèse sur gel fibrinogène-polyacrylamide
Summary
Ici, nous présentons un protocole d’électrophorèse sur gel fibrinogène-polyacrylamide (PAGE) pour séparer et afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques de Sipunculus nudus.
Abstract
Les agents fibrinogénolytiques capables de dissoudre directement le fibrinogène ont été largement utilisés dans le traitement anticoagulant. Généralement, l’identification de nouveaux agents fibrinogénolytiques nécessite d’abord la séparation de chaque composant, puis la vérification de leurs activités fibrinogénolytiques. Actuellement, l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) et la chromatographie sont principalement utilisées dans l’étape de séparation. Pendant ce temps, le dosage sur plaque de fibrinogène et les produits de réaction PAGE sont généralement adoptés pour montrer leurs activités fibrinogénolytiques. Cependant, en raison de la séparation spatio-temporelle de ces deux étapes, il est impossible de séparer et d’afficher les agents fibrinogénolytiques actifs avec le même gel. Pour simplifier les processus de séparation et d’affichage de l’identification des agents fibrinogénolytiques, nous avons construit une nouvelle méthode fibrinogène-PAGE pour séparer et afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques des vers d’arachide (Sipunculus nudus) dans cette étude. Cette méthode comprend la préparation de fibrinogène-PAGE, l’électrophorèse, la renaturation, l’incubation, la coloration et la décoloration. L’activité fibrinogénolytique et le poids moléculaire de la protéine peuvent être détectés simultanément. Selon cette méthode, nous avons réussi à détecter plus d’un agent fibrinogénolytique actif de l’homogénate de ver de l’arachide en 6 heures. De plus, cette méthode fibrinogen-PAGE est rapide et économique. De plus, cette méthode pourrait être utilisée pour étudier les agents fibrinogénolytiques des autres organismes.
Introduction
Ces dernières années, en raison de l’augmentation continue des maladies thrombotiques, les maladies thrombotiques sont devenues un nouveau problème majeur de santé mondiale1. À l’heure actuelle, les médicaments antithrombotiques sont classés en trois groupes : les médicaments anti-agrégation plaquettaire, les anticoagulants et les médicaments thrombolytiques. Parmi eux, les médicaments thrombolytiques, tels que l’urokinase (Royaume-Uni), l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), etc., sont les seuls médicaments utilisés en clinique qui peuvent hydrolyser le thrombus2. Parallèlement, des médicaments thrombolytiques plus sûrs et plus efficaces sont mis au point grâce à l’identification de nouveaux agents thrombolytiques3.
Cependant, l’identification de nouveaux agents thrombolytiques prend du temps et demande beaucoup de main-d’œuvre, ce qui implique principalement les étapes de séparation/purification et de caractérisation/vérification. La première consiste à séparer chaque composant, et la seconde à afficher leurs activités fibrino(géno)lytiques 4,5. Dans des études précédentes, malgré le fait que nous ayons réussi à isoler une nouvelle enzyme fibrino(géno)lytique (sFE) du ver de l’arachide (Sipunculus nudus) par chromatographie d’affinité et dosage de la plaque de fibrine (ogène) 6,7,8, ces processus prennent beaucoup de temps et de main-d’œuvre. Tout d’abord, il est nécessaire de déterminer si les homogénats de ver d’arachide ont une activité fibrino(géno)lytique par la méthode sur plaque de fibrine(ogène) et les produits de réaction basés sur la PAGE9. Ensuite, une série de chromatographies, telles que la chromatographie d’échange d’ions, la chromatographie de filtration sur gel, la chromatographie d’affinité et d’autres méthodes, doivent être effectuées pour la séparation et la purification10,11. Par la suite, le dosage de la plaque de fibrine est effectué à nouveau pour vérifier l’activité fibrinogénolytique de chaque composant séparé. Enfin, la PAGE native et le dodécylsulfate de sodium (SDS) sont réalisés pour déterminer le poids moléculaire des agents fibrinogénolytiques actifs12. Par conséquent, il est essentiel de séparer et d’afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques actifs.
Pour séparer et afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques actifs dans les homogénats de vers d’arachide, une nouvelle méthode fibrinogène-PAGE a été développée en combinant les méthodes PAGE et sur plaque de fibrinogène, c’est-à-dire que les substrats des agents fibrinolytiques fibrinolytiques ont été ajoutés au gel natif-PAGE. Après native-PAGE, les composants ont été séparés en fonction de leur poids moléculaire. Pendant ce temps, chaque composant fibrinogénolytique actif peut être mis en évidence par coloration. Grâce à cette méthode, nous avons réussi à détecter plus d’un agent fibrinogénolytique actif de l’homogénat du ver de l’arachide en 6 heures. De plus, cette méthode fibrinogen-PAGE est rapide et économique. De plus, cette méthode pourrait être utilisée pour étudier les agents fibrinogénolytiques des autres organismes.
Protocol
Representative Results
Discussion
sFE est une nouvelle enzyme fibrino(géno)lytique isolée à partir de vers d’arachide par notre équipe précédemment 3,6,8,13. Cependant, les processus d’identification de la sFE prenaient du temps et de la main-d’œuvre, impliquant la détection de l’activité fibrinogénolytique, la séparation des composants protéiques et les étapes de confirmat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le Bureau des sciences et de la technologie de la ville de Xiamen (n° 3502Z20227197), le Bureau des sciences et de la technologie de la province du Fujian (n° 2019J01070 ; n° 2022J01311), et le projet d’innovation et d’entrepreneuriat de haut niveau des talents du plan scientifique et technologique de Quanzhou (n° 2022C015R). Nous remercions Fucai Wang (Université de Huaqiao) et Lei Tong (Université de Huaqiao) pour leur assistance technique.
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | |
| 30% Acrylamide/Bis-acrylamide | Biosharp | BL513B | |
| Ammonium persulfate | XiLONG SCIENTIFIC | 7727-54-0 | |
| Beaker | PYREX | 2-9425-02 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Coomas Brillant Blue Stainning solution | Beyotime | P0017F | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Fibrinogen | Solarbio | F8051 | |
| Gel loading pipette tips, Bulk | Biosharp | BS-200-GTB | |
| Homogenizer | AHS | ATS-1500 | |
| Horizontal rotation oscillator | NuoMi | NMSP-600 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | BIO-RAD | 165-8000~165-8007 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| Pipette Tip (1 mL) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | T-10XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (10µL) | Thermo Fisher Scientific | ZX98775 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Pipettor (50 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY15331 | |
| Refrigerated Centrifuge | cence | H1650R | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | V900859 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| Tris-HCl | Solarbio | T8230 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
References
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