フィブリノーゲン-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による Sipunculus nudus における活性フィブリノゲン分解剤の迅速な分離と表示
Summary
ここでは、 Sipunculus nudusのフィブリノゲン分解剤を迅速に分離して表示するためのフィブリノーゲン-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)プロトコルを紹介します。
Abstract
フィブリノーゲンを直接溶解できるフィブリノゲン溶解剤は、抗凝固治療に広く用いられてきました。一般に、新しいフィブリノジェノジェノリシス剤を同定するには、まず各成分を分離し、次にそれらのフィブリノジェノジェノリシス活性を確認する必要があります。現在、分離段階ではポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)とクロマトグラフィーが主に使用されています。一方、PAGEに基づくフィブリノーゲンプレートアッセイおよび反応生成物は、通常、それらのフィブリノジェノ溶解活性を表示するために採用されます。しかし、これら2つのステージは時空間的に分離しているため、同じゲルで活性なフィブリノゲン分解剤を分離して表示することは不可能です。フィブリノジェノジェノリシス剤の同定の分離と表示プロセスを簡素化するために、本研究では、ピーナッツワーム(Sipunculus nudus)のフィブリノゲンゲン剤を迅速に分離して表示するための新しいフィブリノーゲン-PAGE法を構築しました。この方法には、フィブリノーゲン-PAGE調製、電気泳動、再生、インキュベーション、染色、および脱色が含まれます。タンパク質のフィブリノゲン分解活性と分子量を同時に検出できます。この方法によれば、6時間以内にピーナッツワームホモジネートの複数の活性フィブリンゲン分解剤を検出することに成功しました。さらに、このフィブリノーゲン-PAGE法は、時間とコストにやさしいです。さらに、この方法は、他の生物のフィブリンゲン分解剤の研究にも使用できます。
Introduction
近年、血栓性疾患の増加が続いているため、血栓性疾患は新たな主要な世界的な健康問題となっています1。現在、抗血栓薬は、抗血小板凝集薬、抗凝固薬、血栓溶解薬の3つに分類されています。その中で、ウロキナーゼ(英国)、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)などの血栓溶解薬は、血栓2を加水分解できる唯一の臨床的に使用されている薬です。一方、新規の血栓溶解薬の同定により、より安全で効果的な血栓溶解薬が開発されています3。
しかし、新規血栓溶解剤の同定には、主に分離/精製、特性評価/チェックの段階が含まれ、時間と労力がかかります。前者は各成分を分離することであり、後者はそれらのフィブリノ(ジェノ)分解活性を示すことである4,5。これまでの研究では、アフィニティークロマトグラフィーとフィブリン(ogen)プレートアッセイ6,7,8により、ピーナッツワーム(Sipunculus nudus)から新規のフィブリノ(遺伝子)溶解酵素(sFE)を単離することに成功しましたが、これらのプロセスは非常に時間と労力がかかります。まず、ピーナッツワームのホモジネートがフィブリン(ogen)プレート法と反応生成物によってフィブリノ(遺伝子)溶解活性を有するかどうかをPAGE9に基づいて判断する必要があります。次いで、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および他の方法などの一連のクロマトグラフィーを、分離および精製10,11のために実施しなければならない。続いて、フィブリンプレートアッセイを再度実施して、分離された各成分のフィブリンゲン分解活性を確認します。最後に、活性フィブリノゲン分解剤12の分子量を決定するために、Native-PAGEおよびdodecyl sulfate(SDS)-PAGEを実行する。したがって、活性なフィブリンゲン分解剤を迅速に分離して表示することが重要です。
ピーナッツワームホモジネート中の活性フィブリノゲン溶解剤を迅速に分離して表示するために、PAGE法とフィブリノーゲンプレート法を組み合わせることにより、新しいフィブリノーゲン-PAGE法、すなわちフィブリノゲン分解剤の基質であるフィブリノーゲンをネイティブ-PAGEゲルに添加して開発した。native-PAGEの後、成分は分子量によって分離されました。一方、各活性フィブリノゲン溶解成分は染色により表示することができる。この方法により、6時間以内にピーナッツワームホモジネートの複数の活性フィブリノゲン分解剤を検出することに成功しました。さらに、このフィブリノーゲン-PAGE法は、時間とコストにやさしいです。さらに、この方法は、他の生物のフィブリンゲン分解剤の研究にも使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
sFEは、私たちのチームが以前に3,6,8,13でピーナッツワームから単離した新しいフィブリノ(遺伝子)溶解酵素です。しかし、sFEの同定プロセスには、フィブリノジェノ溶解活性の検出、タンパク質成分の分離、活性確認の段階など、時間と労力がかかりました。簡単な方法?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、厦門市科学技術局(No.3502Z20227197)、福建省科学技術局(No.2019J01070;No. 2022J01311)、および泉州科学技術計画のハイレベルタレントイノベーションと起業家精神プロジェクト(No. 2022C015R)。Fucai Wang氏(華橋大学)とLei Tong氏(華橋大学)の技術協力に感謝します。
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | |
| 30% Acrylamide/Bis-acrylamide | Biosharp | BL513B | |
| Ammonium persulfate | XiLONG SCIENTIFIC | 7727-54-0 | |
| Beaker | PYREX | 2-9425-02 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Coomas Brillant Blue Stainning solution | Beyotime | P0017F | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Fibrinogen | Solarbio | F8051 | |
| Gel loading pipette tips, Bulk | Biosharp | BS-200-GTB | |
| Homogenizer | AHS | ATS-1500 | |
| Horizontal rotation oscillator | NuoMi | NMSP-600 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | BIO-RAD | 165-8000~165-8007 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| Pipette Tip (1 mL) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | T-10XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (10µL) | Thermo Fisher Scientific | ZX98775 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Pipettor (50 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY15331 | |
| Refrigerated Centrifuge | cence | H1650R | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | V900859 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| Tris-HCl | Solarbio | T8230 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
References
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