الفصل السريع وعرض العوامل المحللة للفيبرين النشطة في Sipunculus nudus من خلال هلام الفيبرينوجين بولي أكريلاميد الكهربائي
Summary
هنا ، نقدم بروتوكول الرحلان الكهربائي لهلام الفيبرينوجين بولي أكريلاميد (PAGE) لفصل وعرض العوامل المحللة للفيبرين ل Sipunculus nudus بسرعة.
Abstract
تم استخدام عوامل تحلل الفيبرينوجين التي يمكنها إذابة الفيبرينوجين مباشرة على نطاق واسع في العلاج المضاد للتخثر. بشكل عام ، يتطلب تحديد عوامل تحلل الفيبرين الجديدة فصل كل مكون أولا ثم التحقق من أنشطته المحللة للفيبرين. حاليا ، يتم استخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد (PAGE) والكروماتوغرافيا في الغالب في مرحلة الفصل. وفي الوقت نفسه ، عادة ما يتم اعتماد مقايسة لوحة الفيبرينوجين ومنتجات التفاعل القائمة على PAGE لعرض أنشطتها في تحلل الفيبرينوجين. ومع ذلك ، بسبب الفصل الزماني المكاني لهاتين المرحلتين ، من المستحيل فصل وعرض عوامل تحلل الفيبرين النشطة بنفس الجل. لتبسيط عمليات الفصل والعرض لتحديد عامل تحلل الفيبرين ، قمنا ببناء طريقة جديدة ل fibrinogen-PAGE لفصل وعرض العوامل المحللة للفيبرينوجين لديدان الفول السوداني (Sipunculus nudus) في هذه الدراسة. تتضمن هذه الطريقة تحضير الفيبرينوجين-PAGE ، والرحلان الكهربائي ، وإعادة التجديد ، والحضانة ، والتلوين ، وإزالة اللون. يمكن الكشف عن نشاط تحلل الفيبرين والوزن الجزيئي للبروتين في وقت واحد. وفقا لهذه الطريقة ، نجحنا في اكتشاف أكثر من عامل نشط لتحلل الفيبرين من دودة الفول السوداني في غضون 6 ساعات. علاوة على ذلك ، فإن طريقة fibrinogen-PAGE هذه مناسبة للوقت والتكلفة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة العوامل المحللة للفيبرين للكائنات الحية الأخرى.
Introduction
في السنوات الأخيرة ، بسبب الارتفاع المستمر في أمراض التخثر ، أصبحت أمراض التخثر مشكلة صحية عالمية رئيسية جديدة1. في الوقت الحاضر ، يتم تصنيف الأدوية المضادة للتخثر إلى ثلاث مجموعات: الأدوية المضادة لتراكم الصفائح الدموية ، ومضادات التخثر ، وأدوية التخثر. من بينها ، الأدوية الخثارية ، مثل urokinase (المملكة المتحدة) ، منشط البلازمينوجين النسيجي (tPA) ، وما إلى ذلك ، هي الأدوية الوحيدة المستخدمة سريريا التي يمكنها تحلل الجلطة2. وفي الوقت نفسه ، يتم تطوير أدوية أكثر أمانا وفعالية للتخثر من خلال تحديد عوامل التخثر الجديدة3.
ومع ذلك ، فإن تحديد عوامل التخثر الجديدة يستغرق وقتا طويلا ويتطلب عمالة مكثفة ، والتي تنطوي بشكل أساسي على مراحل الفصل / التنقية والتوصيف / الفحص. الأول هو فصل كل مكون ، والأخير هو عرض أنشطتهم الفيبرينو (geno) lytic 4,5. في الدراسات السابقة ، على الرغم من حقيقة أننا نجحنا في عزل إنزيم فيبرينو (جينو) لاتيك جديد (sFE) من دودة الفول السوداني (Sipunculus nudus) عن طريق كروماتوغرافيا التقارب ومقايسة لوحة الفيبرين (الجين)6،7،8 ، فإن هذه العمليات تستغرق وقتا طويلا وتستغرق عمالة. أولا ، من الضروري تحديد ما إذا كانت متجانسات دودة الفول السوداني لها نشاط تحلل الفيبرينو (الجينو) بواسطة طريقة لوحة الفيبرين (الجين) ومنتجات التفاعل بناء على الصفحة9. بعد ذلك ، يجب إجراء سلسلة من الكروماتوغرافيا ، مثل كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، وكروماتوغرافيا الترشيح الهلامي ، وكروماتوغرافيا التقارب ، وطرق أخرى ، للفصل والتنقية10,11. بعد ذلك ، يتم إجراء فحص لوحة الفيبرين مرة أخرى للتحقق من نشاط تحلل الفيبرين لكل مكون منفصل. أخيرا ، يتم إجراء PAGE الأصلي وكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) -PAGE لتحديد الوزن الجزيئي للعوامل المحللة للفيبرين النشطة12. لذلك ، من الأهمية بمكان فصل وعرض العوامل المحللة للفيبرين النشطة بسرعة.
لفصل وعرض العوامل المحللة للفيبرين النشطة بسرعة في متجانسات دودة الفول السوداني ، تم تطوير طريقة جديدة ل fibrinogen-PAGE من خلال الجمع بين طرق PAGE ولوحة الفيبرينوجين ، أي تمت إضافة ركائز عوامل تحلل الفيبرينوجين الفيبرينوجين إلى هلام PAGE الأصلي. بعد الصفحة الأصلية ، تم فصل المكونات حسب وزنها الجزيئي. وفي الوقت نفسه ، يمكن عرض كل مكون نشط من مكونات تحلل الفيبرين عن طريق تلطيخ. بهذه الطريقة ، اكتشفنا بنجاح أكثر من عامل نشط للفيبرين من تجانس دودة الفول السوداني في غضون 6 ساعات. علاوة على ذلك ، فإن طريقة fibrinogen-PAGE هذه مناسبة للوقت والتكلفة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة العوامل المحللة للفيبرين للكائنات الحية الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
sFE هو إنزيم فيبرينو (جينو) لاتيك جديد معزول من ديدان الفول السوداني من قبل فريقنا سابقا3،6،8،13. ومع ذلك ، كانت عمليات تحديد sFE تستغرق وقتا وعمالة ، بما في ذلك اكتشاف نشاط تحلل الفيبرين ، وفصل مكونات البرو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب العلوم والتكنولوجيا في مدينة شيامن (رقم 3502Z20227197) ، ومكتب العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة فوجيان (رقم 2019J01070; No. 2022J01311) ، ومشروع ابتكار المواهب وريادة الأعمال رفيع المستوى لخطة تشيوانتشو للعلوم والتكنولوجيا (رقم 2022C015R). نشكر Fucai Wang (جامعة Huaqiao) ولي تونغ (جامعة Huaqiao) على مساعدتهما الفنية.
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | |
| 30% Acrylamide/Bis-acrylamide | Biosharp | BL513B | |
| Ammonium persulfate | XiLONG SCIENTIFIC | 7727-54-0 | |
| Beaker | PYREX | 2-9425-02 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Coomas Brillant Blue Stainning solution | Beyotime | P0017F | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Fibrinogen | Solarbio | F8051 | |
| Gel loading pipette tips, Bulk | Biosharp | BS-200-GTB | |
| Homogenizer | AHS | ATS-1500 | |
| Horizontal rotation oscillator | NuoMi | NMSP-600 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | BIO-RAD | 165-8000~165-8007 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| Pipette Tip (1 mL) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | T-10XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (10µL) | Thermo Fisher Scientific | ZX98775 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Pipettor (50 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY15331 | |
| Refrigerated Centrifuge | cence | H1650R | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | V900859 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| Tris-HCl | Solarbio | T8230 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
References
- Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
- Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
- Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
- Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
- Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
- Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631 (2023).
- . Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023)
- Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
- Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
- Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764 (2023).
- Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920 (2021).
- . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)
.