Fibrinojen-Poliakrilamid Jel Elektroforezi ile Sipunculus nudus'ta Aktif Fibrinojenolitik Ajanların Hızlı Ayrılması ve Görüntülenmesi
Summary
Burada, Sipunculus nudus’un fibrinojenolitik ajanlarını hızlı bir şekilde ayırmak ve görüntülemek için bir fibrinojen-poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) protokolü sunuyoruz.
Abstract
Fibrinojeni doğrudan çözebilen fibrinojenolitik ajanlar, anti-koagülasyon tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Genel olarak, yeni fibrinogenolitik ajanların tanımlanması, önce her bir bileşenin ayrılmasını ve ardından fibrinogenolitik aktivitelerinin kontrol edilmesini gerektirir. Şu anda, ayırma aşamasında çoğunlukla poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ve kromatografi kullanılmaktadır. Bu arada, fibrinojen plaka tahlili ve PAGE bazlı reaksiyon ürünleri genellikle fibrinojenolitik aktivitelerini göstermek için benimsenir. Bununla birlikte, bu iki aşamanın uzay-zamansal ayrımı nedeniyle, aktif fibrinojenolitik ajanları aynı jel ile ayırmak ve görüntülemek mümkün değildir. Fibrinojenolitik ajan tanımlamasının ayırma ve görüntüleme süreçlerini basitleştirmek için, bu çalışmada yer fıstığı kurtlarının (Sipunculus nudus) fibrinojenolitik ajanlarını hızlı bir şekilde ayırmak ve görüntülemek için yeni bir fibrinojen-PAGE yöntemi oluşturduk. Bu yöntem, fibrinojen-PAGE hazırlama, elektroforez, renatürasyon, inkübasyon, boyama ve renk gidermeyi içerir. Proteinin fibrinojenolitik aktivitesi ve moleküler ağırlığı aynı anda tespit edilebilir. Bu yönteme göre, fıstık kurduhomojenatın birden fazla aktif fibrinojenolitik ajanını 6 saat içinde başarıyla tespit ettik. Ayrıca, bu fibrinojen-PAGE yöntemi zaman ve maliyet dostudur. Ayrıca, bu yöntem diğer organizmaların fibrinojenolitik ajanlarını incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Son yıllarda, trombotik hastalıkların devam eden artışı nedeniyle, trombotik hastalıklar yeni ve önemli bir küresel sağlık sorunu haline gelmiştir1. Şu anda, antitrombotik ilaçlar üç gruba ayrılır: anti-trombosit agregasyon ilaçları, antikoagülanlar ve trombolitik ilaçlar. Bunlar arasında, ürokinaz (İngiltere), doku plazminojen aktivatörü (tPA), vb. gibi trombolitik ilaçlar, trombüs2’yi hidrolize edebilen klinik olarak kullanılan tek ilaçlardır. Bu arada, yeni trombolitik ajanların tanımlanması ile daha güvenli ve etkili trombolitik ilaçlar geliştirilmektedir3.
Bununla birlikte, yeni trombolitik ajanların tanımlanması zaman alıcı ve emek yoğundur, bu da esas olarak ayırma/saflaştırma ve karakterizasyon/kontrol aşamalarını içerir. Birincisi, her bir bileşeni ayırmak ve ikincisi, fibrino (geno) litik aktivitelerini göstermektir 4,5. Önceki çalışmalarda, fıstık kurdundan (Sipunculus nudus) afinite kromatografisi ve fibrin (ojen) plaka testi 6,7,8 ile yeni bir fibrino (geno) litik enzimi (sFE) başarılı bir şekilde izole etmiş olmamıza rağmen, bu işlemler çok zaman ve emek alıcıdır. İlk olarak, fıstık kurdu homojenatlarının fibrino(geno)litik aktiviteye sahip olup olmadığının fibrin(ojen) plaka yöntemi ve SAYFA9’a dayalı reaksiyon ürünleri ile belirlenmesi gerekmektedir. Daha sonra, ayırma ve saflaştırma için iyon değişim kromatografisi, jel filtrasyon kromatografisi, afinite kromatografisi ve diğer yöntemler gibi bir dizi kromatografi gerçekleştirilmelidir10,11. Daha sonra, ayrılan her bir bileşenin fibrinojenolitik aktivitesini kontrol etmek için fibrin plaka testi tekrar gerçekleştirilir. Son olarak, aktif fibrinojenolitik ajanların12 moleküler ağırlığını belirlemek için doğal PAGE ve sodyum dodesil sülfat (SDS)-PAGE gerçekleştirilir. Bu nedenle, aktif fibrinojenolitik ajanların hızlı bir şekilde ayrılması ve görüntülenmesi kritik öneme sahiptir.
Yer fıstığı kurdu homojenatlarındaki aktif fibrinojenolitik ajanları hızlı bir şekilde ayırmak ve görüntülemek için, PAGE ve fibrinojen plaka yöntemlerinin birleştirilmesiyle yeni bir fibrinojen-PAGE yöntemi geliştirilmiştir, yani fibrinojen ajanlarının substratları fibrinojen doğal PAGE jeline eklenmiştir. Native-PAGE’den sonra, bileşenler moleküler ağırlıklarına göre ayrıldı. Bu arada, her aktif fibrinojenolitik bileşen boyama ile görüntülenebilir. Bu yöntemle, fıstık kurdu homojenatının birden fazla aktif fibrinojenolitik ajanını 6 saat içinde başarıyla tespit ettik. Ayrıca, bu fibrinojen-PAGE yöntemi zaman ve maliyet dostudur. Ayrıca, bu yöntem diğer organizmaların fibrinojenolitik ajanlarını incelemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
sFE, ekibimiz tarafından daha önce 3,6,8,13 yılında yer fıstığı kurtlarından izole edilen yeni bir fibrino (geno) litik enzimdir. Bununla birlikte, sFE’nin tanımlama süreçleri, fibrinojenolitik aktivite tespiti, protein bileşenlerinin ayrılması ve aktivite doğrulama aşamalarını içeren zaman ve emek alıcıydı. Basit bir yöntem olarak, fibr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Xiamen Şehri Bilim ve Teknoloji Bürosu (No. 3502Z20227197), Fujian Eyaleti Bilim ve Teknoloji Bürosu (No. 2019J01070; No. 2022J01311) ve Quanzhou Bilim ve Teknoloji Planının Üst Düzey Yetenekler İnovasyon ve Girişimcilik Projesi (No. 2022C015R). Fucai Wang (Huaqiao Üniversitesi) ve Lei Tong’a (Huaqiao Üniversitesi) teknik yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | |
| 30% Acrylamide/Bis-acrylamide | Biosharp | BL513B | |
| Ammonium persulfate | XiLONG SCIENTIFIC | 7727-54-0 | |
| Beaker | PYREX | 2-9425-02 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Coomas Brillant Blue Stainning solution | Beyotime | P0017F | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Fibrinogen | Solarbio | F8051 | |
| Gel loading pipette tips, Bulk | Biosharp | BS-200-GTB | |
| Homogenizer | AHS | ATS-1500 | |
| Horizontal rotation oscillator | NuoMi | NMSP-600 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | BIO-RAD | 165-8000~165-8007 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| Pipette Tip (1 mL) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | T-10XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (10µL) | Thermo Fisher Scientific | ZX98775 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Pipettor (50 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY15331 | |
| Refrigerated Centrifuge | cence | H1650R | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | V900859 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| Tris-HCl | Solarbio | T8230 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
References
- Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
- Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
- Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
- Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
- Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
- Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631 (2023).
- . Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023)
- Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
- Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
- Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764 (2023).
- Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920 (2021).
- . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)
.