Быстрое разделение и отображение активных фибриногенолитических агентов в Sipunculus nudus с помощью электрофореза в фибриноген-полиакриламидном геле
Summary
Здесь мы представляем протокол фибриноген-полиакриламидного гель-электрофореза (PAGE) для быстрого разделения и отображения фибриногенолитических агентов Sipunculus nudus.
Abstract
Фибриногенолитические агенты, которые могут растворять фибриноген напрямую, широко используются в антикоагулянтной терапии. Как правило, идентификация новых фибриногенолитических агентов требует сначала разделения каждого компонента, а затем проверки их фибриногенолитической активности. В настоящее время на стадии разделения в основном используются электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) и хроматография. Между тем, анализ фибриногенных пластин и продукты реакции на основе PAGE обычно используются для демонстрации их фибриногенолитической активности. Однако из-за пространственно-временного разделения этих двух стадий невозможно разделить и отобразить активные фибриногенлитические агенты с одним и тем же гелем. Чтобы упростить процессы разделения и отображения идентификации фибриногенолитических агентов, мы разработали новый метод fibrinogen-PAGE для быстрого разделения и отображения фибриногенолитических агентов арахисовых червей (Sipunculus nudus) в этом исследовании. Этот метод включает в себя получение фибриногена-PAGE, электрофорез, ренатурацию, инкубацию, окрашивание и обесцвечивание. Фибриногенолитическая активность и молекулярная масса белка могут быть обнаружены одновременно. С помощью этого метода мы успешно обнаружили более одного активного фибриногенолитического агента гомогената арахисового червя в течение 6 ч. Кроме того, этот метод fibrinogen-PAGE экономит время и деньги. Кроме того, этот метод может быть использован для изучения фибриногенлитических агентов других организмов.
Introduction
В последние годы, в связи с продолжающимся ростом тромботических заболеваний, тромботические заболевания стали новойсерьезной глобальной проблемой здравоохранения1. В настоящее время антитромботические препараты классифицируются на три группы: антитромбоцитарные агрегирующие препараты, антикоагулянты и тромболитические препараты. Среди них тромболитические препараты, такие как урокиназа (Великобритания), тканевый активатор плазминогена (tPA) и др., являются единственными клинически применяемыми препаратами, способными гидролизовать тромб2. Между тем, разрабатываются более безопасные и эффективные тромболитические препараты путем идентификации новых тромболитических агентов3.
Тем не менее, идентификация новых тромболитических агентов является трудоемкой и трудоемкой процессией, которая в основном включает в себя этапы разделения/очистки и характеристики/проверки. Первый заключается в разделении каждого компонента, а второй в проявлении их фибрино(гено)литической активности 4,5. В предыдущих исследованиях, несмотря на то, что мы успешно выделили новый фибрино(гено)литический фермент (sFE) из арахисового червя (Sipunculus nudus) с помощью аффинной хроматографии и анализа фибрина (огена) 6,7,8, эти процессы являются очень трудоемкими и трудоемкими. Во-первых, необходимо определить, обладают ли гомогенаты арахисового червя фибрино(гено)литической активностью методом фибриновой пластины и продуктами реакции на основе стр.9. Затем необходимо провести серию хроматографий, таких как ионообменная хроматография, гель-фильтрационная хроматография, аффинная хроматография и другие методы для разделения и очистки10,11. Затем снова проводится анализ фибриновой пластины для проверки фибриногенолитической активности каждого выделенного компонента. Наконец, для определения молекулярной массы активных фибриногенолитическихагентов проводят native-PAGE и додецилсульфат натрия (SDS)-PAGE. Поэтому крайне важно быстро отделять и выводить активные фибриногенолитические агенты.
Для быстрого разделения и отображения активных фибриногенолитических агентов в гомогенатах арахисового червя был разработан новый метод фибриноген-ПЕЙДЖ, сочетающий методы ПЕЙДЖ и фибриногенной пластины, т.е. субстраты фибриногенолитических агентов фибриногена были добавлены в нативный гель ПЕЙДЖ. После native-PAGE компоненты были разделены по их молекулярной массе. Между тем, каждый активный фибриногенолитический компонент может быть отображен путем окрашивания. С помощью этого метода мы успешно обнаружили более одного активного фибриногенлитического агента гомогената арахисового червя в течение 6 ч. Кроме того, этот метод fibrinogen-PAGE экономит время и деньги. Кроме того, этот метод может быть использован для изучения фибриногенлитических агентов других организмов.
Protocol
Representative Results
Discussion
sFE – это новый фибрино(гено)литический фермент, выделенный из арахисовых червей нашей командой ранее 3,6,8,13. Тем не менее, процессы идентификации sFE были трудоемкими и трудоемкими, включая определение …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Научно-техническим бюро города Сямынь (No 3502Z20227197), Бюро науки и технологий провинции Фуцзянь (No 2019J01070; No 2022J01311) и проект «Инновации и предпринимательство высокого уровня» Плана науки и техники Цюаньчжоу (No 2022C015R). Мы благодарим Фуцай Вана (Университет Хуацяо) и Лэй Туна (Университет Хуацяо) за их техническую помощь.
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | |
| 30% Acrylamide/Bis-acrylamide | Biosharp | BL513B | |
| Ammonium persulfate | XiLONG SCIENTIFIC | 7727-54-0 | |
| Beaker | PYREX | 2-9425-02 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Coomas Brillant Blue Stainning solution | Beyotime | P0017F | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Fibrinogen | Solarbio | F8051 | |
| Gel loading pipette tips, Bulk | Biosharp | BS-200-GTB | |
| Homogenizer | AHS | ATS-1500 | |
| Horizontal rotation oscillator | NuoMi | NMSP-600 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | BIO-RAD | 165-8000~165-8007 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| Pipette Tip (1 mL) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | T-10XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (10µL) | Thermo Fisher Scientific | ZX98775 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Pipettor (50 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY15331 | |
| Refrigerated Centrifuge | cence | H1650R | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | V900859 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| Tris-HCl | Solarbio | T8230 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
References
- Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
- Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
- Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
- Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
- Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
- Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631 (2023).
- . Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023)
- Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
- Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
- Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764 (2023).
- Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920 (2021).
- . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)
.