Rapida separazione e visualizzazione di agenti fibrinogenolitici attivi in Sipunculus nudus attraverso l'elettroforesi su gel di fibrinogeno-poliacrilammide
Summary
Qui, presentiamo un protocollo di elettroforesi su gel di fibrinogeno-poliacrilammide (PAGE) per separare e visualizzare rapidamente gli agenti fibrinogenolitici di Sipunculus nudus.
Abstract
Gli agenti fibrinogenolitici in grado di sciogliere direttamente il fibrinogeno sono stati ampiamente utilizzati nel trattamento anticoagulante. In generale, l’identificazione di nuovi agenti fibrinogenolitici richiede prima la separazione di ciascun componente e quindi il controllo delle loro attività fibrinogenolitiche. Attualmente, l’elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) e la cromatografia sono utilizzate principalmente nella fase di separazione. Nel frattempo, il test su piastra di fibrinogeno e i prodotti di reazione basati su PAGE sono solitamente adottati per mostrare le loro attività fibrinogenolitiche. Tuttavia, a causa della separazione spazio-temporale di questi due stadi, è impossibile separare e visualizzare gli agenti fibrinogenolitici attivi con lo stesso gel. Per semplificare i processi di separazione e visualizzazione dell’identificazione degli agenti fibrinogenotici, abbiamo costruito un nuovo metodo fibrinogeno-PAGE per separare e visualizzare rapidamente gli agenti fibrinogenolitici dei vermi delle arachidi (Sipunculus nudus) in questo studio. Questo metodo include la preparazione del fibrinogeno-PAGE, l’elettroforesi, la rinaturazione, l’incubazione, la colorazione e la decolorazione. L’attività fibrinogenolitica e il peso molecolare della proteina possono essere rilevati simultaneamente. Secondo questo metodo, abbiamo rilevato con successo più di un agente fibrinogenolitico attivo di omogenato di verme di arachidi entro 6 ore. Inoltre, questo metodo fibrinogeno-PAGE è rispettoso in termini di tempo e costi. Inoltre, questo metodo potrebbe essere utilizzato per studiare gli agenti fibrinogenolitici di altri organismi.
Introduction
Negli ultimi anni, a causa del continuo aumento delle malattie trombotiche, le malattie trombotiche sono diventate un nuovo importante problema sanitario globale1. Attualmente, i farmaci antitrombotici sono classificati in tre gruppi: farmaci antiaggreganti piastrinici, anticoagulanti e farmaci trombolitici. Tra questi, i farmaci trombolitici, come l’urochinasi (UK), l’attivatore del plasminogeno tissutale (tPA), ecc., sono gli unici farmaci clinicamente utilizzati in grado di idrolizzare il trombo2. Nel frattempo, farmaci trombolitici più sicuri ed efficaci sono in fase di sviluppo grazie all’identificazione di nuovi agenti trombolitici3.
Tuttavia, l’identificazione di nuovi agenti trombolitici richiede molto tempo e lavoro, il che coinvolge principalmente le fasi di separazione/purificazione e caratterizzazione/controllo. Il primo è quello di separare ogni componente, e il secondo è quello di mostrare le loro attività fibrino(geno)litiche 4,5. In studi precedenti, nonostante il fatto che abbiamo isolato con successo un nuovo enzima fibrino(geno)litico (sFE) dal verme delle arachidi (Sipunculus nudus) mediante cromatografia di affinità e saggio su piastra di fibrina(ogeno) 6,7,8, questi processi richiedono molto tempo e lavoro. In primo luogo, è necessario determinare se gli omogenati di verme delle arachidi hanno attività fibrino(geno)litica con il metodo della piastra di fibrina(ogen) e dei prodotti di reazione basati su PAGINA9. Quindi, per la separazione ela purificazione devono essere eseguite una serie di cromatografie, come la cromatografia a scambio ionico, la cromatografia con filtrazione su gel, la cromatografia di affinità e altri metodi. Successivamente, viene eseguito nuovamente il saggio della piastra di fibrina per verificare l’attività fibrinogenolitica di ciascun componente separato. Infine, vengono eseguiti native-PAGE e sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE per determinare il peso molecolare degli agenti fibrinogenolitici attivi12. Pertanto, è fondamentale separare e visualizzare rapidamente gli agenti fibrinogenolitici attivi.
Per separare e visualizzare rapidamente gli agenti fibrinogenolitici attivi negli omogenati di vermi delle arachidi, è stato sviluppato un nuovo metodo fibrinogeno-PAGE combinando i metodi PAGE e piastra di fibrinogeno, ovvero i substrati degli agenti fibrinogenici fibrinogeno sono stati aggiunti al gel nativo PAGE. Dopo la PAGE nativa, i componenti sono stati separati in base al loro peso molecolare. Nel frattempo, ogni componente fibrinogenolitico attivo può essere visualizzato mediante colorazione. Con questo metodo, abbiamo rilevato con successo più di un agente fibrinogenolitico attivo dell’omogenato di verme delle arachidi entro 6 ore. Inoltre, questo metodo fibrinogeno-PAGE è rispettoso in termini di tempo e costi. Inoltre, questo metodo potrebbe essere utilizzato per studiare gli agenti fibrinogenolitici di altri organismi.
Protocol
Representative Results
Discussion
sFE è un nuovo enzima fibrino(geno)litico isolato dai vermi delle arachidi dal nostro team precedentemente 3,6,8,13. Tuttavia, i processi di identificazione dell’sFE richiedevano molto tempo e lavoro, coinvolgendo il rilevamento dell’attività fibrinogenolitica, la separazione dei componenti proteici e le fasi di conferma dell’attività. Come metodo semplice, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dall’Ufficio per la scienza e la tecnologia della città di Xiamen (n. 3502Z20227197), dall’Ufficio per la scienza e la tecnologia della provincia del Fujian (n. 2019J01070; n. 2022J01311) e Progetto di innovazione e imprenditorialità dei talenti di alto livello del Quanzhou Science and Technology Plan (n. 2022C015R). Ringraziamo Fucai Wang (Università di Huaqiao) e Lei Tong (Università di Huaqiao) per la loro assistenza tecnica.
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | |
| 30% Acrylamide/Bis-acrylamide | Biosharp | BL513B | |
| Ammonium persulfate | XiLONG SCIENTIFIC | 7727-54-0 | |
| Beaker | PYREX | 2-9425-02 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Coomas Brillant Blue Stainning solution | Beyotime | P0017F | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Fibrinogen | Solarbio | F8051 | |
| Gel loading pipette tips, Bulk | Biosharp | BS-200-GTB | |
| Homogenizer | AHS | ATS-1500 | |
| Horizontal rotation oscillator | NuoMi | NMSP-600 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | BIO-RAD | 165-8000~165-8007 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| Pipette Tip (1 mL) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | T-10XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (10µL) | Thermo Fisher Scientific | ZX98775 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Pipettor (50 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY15331 | |
| Refrigerated Centrifuge | cence | H1650R | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | V900859 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| Tris-HCl | Solarbio | T8230 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
References
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