Summary

הפרדה מהירה והצגה של חומרים פיברינוגנוליטיים פעילים ב- Sipunculus nudus באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פיברינוגן-פוליאקרילאמיד

Published: April 19, 2024
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורזה של ג’ל פיברינוגן-פוליאקרילאמיד (PAGE) כדי להפריד במהירות ולהציג את הסוכנים הפיברינוגנוליטיים של Sipunculus nudus.

Abstract

חומרים פיברינוגנוליטיים שיכולים להמיס פיברינוגן ישירות נמצאים בשימוש נרחב בטיפול נוגד קרישה. באופן כללי, זיהוי סוכנים פיברינוגנוליטיים חדשים דורש תחילה הפרדה של כל רכיב ולאחר מכן בדיקת הפעילות הפיברינוגנוליטית שלהם. נכון לעכשיו, אלקטרופורזה ג’ל פוליאקרילאמיד (PAGE) וכרומטוגרפיה משמשים בעיקר בשלב ההפרדה. בינתיים, בדיקת צלחת פיברינוגן ומוצרי תגובה מבוססי PAGE מאומצים בדרך כלל כדי להציג את הפעילות הפיברינוגנוליטית שלהם. עם זאת, בגלל ההפרדה המרחבית-זמנית של שני שלבים אלה, אי אפשר להפריד ולהציג את הסוכנים הפיברינוגנוליטיים הפעילים עם אותו ג’ל. כדי לפשט את תהליכי ההפרדה וההצגה של זיהוי סוכנים פיברינוגנוליטיים, בנינו שיטת פיברינוגן-PAGE חדשה כדי להפריד במהירות ולהציג את הסוכנים הפיברינוגנוליטיים של תולעי בוטנים (Sipunculus nudus) במחקר זה. שיטה זו כוללת הכנת פיברינוגן-PAGE, אלקטרופורזה, רנטורה, דגירה, צביעה ודה-קולוריזציה. הפעילות הפיברינוגנוליטית והמשקל המולקולרי של החלבון יכולים להיות מזוהים בו זמנית. על פי שיטה זו, זיהינו בהצלחה יותר מסוכן פיברינוגנוליטי פעיל אחד של תולעת בוטנים בתוך 6 שעות. יתר על כן, שיטת פיברינוגן-PAGE זו היא ידידותית לזמן ועלות. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש לחקר סוכנים פיברינוגנוליטיים של אורגניזמים אחרים.

Introduction

בשנים האחרונות, בשל העלייה המתמשכת של מחלות טרומבוטיות, מחלות טרומבוטיות הפכו לבעיה בריאותית עולמית גדולה חדשה1. כיום, תרופות antithrombotic מסווגים לשלוש קבוצות: תרופות צבירה טסיות, נוגדי קרישה, ותרופות thrombolytic. ביניהם, תרופות thrombolytic, כגון urokinase (בריטניה), רקמות plasminogen activator (tPA), וכו ‘, הם התרופות היחידות בשימוש קליני שיכול hydrolyze פקקת2. בינתיים, תרופות תרומבוליטיות בטוחות ויעילות יותר מפותחות על ידי זיהוי של סוכנים טרומבוליטיים חדשים3.

עם זאת, הזיהוי של חומרים טרומבוליטיים חדשים הוא גוזל זמן ודורש עבודה, הכוללת בעיקר את שלבי ההפרדה/טיהור ואפיון/בדיקה. הראשון הוא להפריד כל רכיב, והשני הוא להציג את הפעילות הפיברינו(גנו) הליטית שלהם 4,5. במחקרים קודמים, למרות העובדה שבודדנו בהצלחה אנזים פיברינו (גנו) ליטי (sFE) מתולעת בוטנים (Sipunculus nudus) על ידי כרומטוגרפיית זיקה ובדיקת צלחת פיברין (עוגן) 6,7,8, תהליכים אלה גוזלים זמן ועבודה. ראשית, יש לקבוע אם לתולעי בוטנים יש פעילות פיברינו (גנו) ליטי על ידי שיטת צלחת פיברין (עוגן) ותוצרי תגובה בהתבסס על עמוד9. לאחר מכן, סדרה של כרומטוגרפיה, כגון כרומטוגרפיית חילופי יונים, כרומטוגרפיית סינון ג’ל, כרומטוגרפיית זיקה ושיטות אחרות, צריכה להתבצע לצורך הפרדה וטיהור10,11. לאחר מכן, בדיקת צלחת פיברין מבוצעת שוב כדי לבדוק את הפעילות הפיברינוגנוליטית של כל רכיב מופרד. לבסוף, native-PAGE ונתרן דודציל סולפט (SDS)-PAGE מבוצעים כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של סוכנים פיברינוגנוליטיים פעילים12. לכן, זה קריטי להפריד במהירות ולהציג את החומרים fibrinogenolytic פעיל.

כדי להפריד ולהציג במהירות את החומרים הפיברינוגנוליטיים הפעילים בהומוגנאטים של תולעי בוטנים, פותחה שיטת פיברינוגן-PAGE חדשה על ידי שילוב שיטות לוחות PAGE ופיברינוגן, כלומר, הסובסטרטים של חומרים פיברינוגנוליטיים פיברינוגן נוספו לג’ל הילידים-PAGE. לאחר native-PAGE, הרכיבים הופרדו על ידי משקלם המולקולרי. בינתיים, כל רכיב פיברינוגנוליטי פעיל יכול להיות מוצג על ידי צביעה. בשיטה זו, זיהינו בהצלחה יותר מסוכן פיברינוגנוליטי פעיל אחד של הומוגנט תולעי בוטנים בתוך 6 שעות. יתר על כן, שיטת פיברינוגן-PAGE זו היא ידידותית לזמן ועלות. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש לחקר סוכנים פיברינוגנוליטיים של אורגניזמים אחרים.

Protocol

1. הכנת תולעי בוטנים הומוגנט הוסף 50 גרם של תולעי בוטנים ו 150 מ”ל של תמיסת מלח לתוך homogenizer. הומוגניזציה ב 24000 סל”ד במשך 60 שניות.הערה: חזור על הפעולה 3 פעמים. צנטריפוגה הומוגנאט ב 9710 x גרם במשך 30 דקות ב 4 °C (75 °F). אספו את הסופרנאטנט כתולעת בוטני…

Representative Results

לאחר אלקטרופורזה, כל הפסים של הסמן הוצגו בבירור. נתיבי הטעינה 1x SDS-PAGE הראו רק 10 רצועות kDa (ברומופנול כחול). דגימות sFE ותולעי בוטנים לא הראו פסים נצפים (איור 1). למרות שהרצועות של הדגימות אינן נראות לעין, הביצועים של הסמן והברומופנול הכחול הצביעו על כך שהאלקטרו…

Discussion

sFE הוא אנזים פיברינו (גנו) ליטי חדשני שבודד מתולעי בוטנים על ידי הצוות שלנו בעבר 3,6,8,13. עם זאת, תהליכי הזיהוי של sFE היו גוזלים זמן ועבודה, וכללו זיהוי פעילות פיברינוגנוליטית, הפרדת רכיבי חלבונים ושלבי אי?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי לשכת המדע והטכנולוגיה של העיר שיאמן (מס ‘3502Z20227197), לשכת המדע והטכנולוגיה של מחוז פוג’יאן (מס ‘2019J01070; No. 2022J01311), ופרויקט חדשנות ויזמות של כישרונות ברמה גבוהה של תוכנית המדע והטכנולוגיה של Quanzhou (מס ‘2022C015R). אנו מודים לפוקאי וואנג (אוניברסיטת Huaqiao) ולליי טונג (אוניברסיטת Huaqiao) על עזרתם הטכנית.

Materials

1  M Tris-HCl (pH 6.8) Solarbio T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) Solarbio T1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamide Biosharp BL513B
Ammonium persulfate XiLONG SCIENTIFIC 7727-54-0
Beaker PYREX 2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL) Biosharp BS-15-M
Constant Temperature Incubator JINGHONG JHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solution Beyotime P0017F
Electronic Analytical Balance DENVER TP-213
Fibrinogen Solarbio F8051
Gel loading pipette tips, Bulk Biosharp BS-200-GTB
Homogenizer AHS ATS-1500
Horizontal rotation oscillator NuoMi NMSP-600
Milli-Q Reference Millipore Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell BIO-RAD 165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine Sigma T9281
Pipette Tip (1 mL) Axygene T-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL) Axygene T-10XT-C
Pipette Tip (200 µL) Axygene T-200XT-C
Pipettor (1 mL) Thermo Fisher Scientific ZY18723
Pipettor (10µL) Thermo Fisher Scientific ZX98775
Pipettor (200 µL) Thermo Fisher Scientific ZY20280
Pipettor (50 µL) Thermo Fisher Scientific ZY15331
Refrigerated Centrifuge cence H1650R
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich V900859
Tris Solarbio T8060
Tris-HCl Solarbio T8230
Triton X-100 Solarbio T8200

References

  1. Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
  2. Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
  3. Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
  4. Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
  5. Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
  6. Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791 (2023).
  7. Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631 (2023).
  8. . Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023)
  9. Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
  10. Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
  11. Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764 (2023).
  12. Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920 (2021).
  13. . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

Cite This Article
Kang, B., Hu, C., Lin, H., Yan, H., Wei, C., Tang, M. Rapid Separation and Display of Active Fibrinogenolytic Agents in Sipunculus nudus through Fibrinogen-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (206), e66536, doi:10.3791/66536 (2024).

View Video