כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורזה של ג’ל פיברינוגן-פוליאקרילאמיד (PAGE) כדי להפריד במהירות ולהציג את הסוכנים הפיברינוגנוליטיים של Sipunculus nudus.
חומרים פיברינוגנוליטיים שיכולים להמיס פיברינוגן ישירות נמצאים בשימוש נרחב בטיפול נוגד קרישה. באופן כללי, זיהוי סוכנים פיברינוגנוליטיים חדשים דורש תחילה הפרדה של כל רכיב ולאחר מכן בדיקת הפעילות הפיברינוגנוליטית שלהם. נכון לעכשיו, אלקטרופורזה ג’ל פוליאקרילאמיד (PAGE) וכרומטוגרפיה משמשים בעיקר בשלב ההפרדה. בינתיים, בדיקת צלחת פיברינוגן ומוצרי תגובה מבוססי PAGE מאומצים בדרך כלל כדי להציג את הפעילות הפיברינוגנוליטית שלהם. עם זאת, בגלל ההפרדה המרחבית-זמנית של שני שלבים אלה, אי אפשר להפריד ולהציג את הסוכנים הפיברינוגנוליטיים הפעילים עם אותו ג’ל. כדי לפשט את תהליכי ההפרדה וההצגה של זיהוי סוכנים פיברינוגנוליטיים, בנינו שיטת פיברינוגן-PAGE חדשה כדי להפריד במהירות ולהציג את הסוכנים הפיברינוגנוליטיים של תולעי בוטנים (Sipunculus nudus) במחקר זה. שיטה זו כוללת הכנת פיברינוגן-PAGE, אלקטרופורזה, רנטורה, דגירה, צביעה ודה-קולוריזציה. הפעילות הפיברינוגנוליטית והמשקל המולקולרי של החלבון יכולים להיות מזוהים בו זמנית. על פי שיטה זו, זיהינו בהצלחה יותר מסוכן פיברינוגנוליטי פעיל אחד של תולעת בוטנים בתוך 6 שעות. יתר על כן, שיטת פיברינוגן-PAGE זו היא ידידותית לזמן ועלות. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש לחקר סוכנים פיברינוגנוליטיים של אורגניזמים אחרים.
בשנים האחרונות, בשל העלייה המתמשכת של מחלות טרומבוטיות, מחלות טרומבוטיות הפכו לבעיה בריאותית עולמית גדולה חדשה1. כיום, תרופות antithrombotic מסווגים לשלוש קבוצות: תרופות צבירה טסיות, נוגדי קרישה, ותרופות thrombolytic. ביניהם, תרופות thrombolytic, כגון urokinase (בריטניה), רקמות plasminogen activator (tPA), וכו ‘, הם התרופות היחידות בשימוש קליני שיכול hydrolyze פקקת2. בינתיים, תרופות תרומבוליטיות בטוחות ויעילות יותר מפותחות על ידי זיהוי של סוכנים טרומבוליטיים חדשים3.
עם זאת, הזיהוי של חומרים טרומבוליטיים חדשים הוא גוזל זמן ודורש עבודה, הכוללת בעיקר את שלבי ההפרדה/טיהור ואפיון/בדיקה. הראשון הוא להפריד כל רכיב, והשני הוא להציג את הפעילות הפיברינו(גנו) הליטית שלהם 4,5. במחקרים קודמים, למרות העובדה שבודדנו בהצלחה אנזים פיברינו (גנו) ליטי (sFE) מתולעת בוטנים (Sipunculus nudus) על ידי כרומטוגרפיית זיקה ובדיקת צלחת פיברין (עוגן) 6,7,8, תהליכים אלה גוזלים זמן ועבודה. ראשית, יש לקבוע אם לתולעי בוטנים יש פעילות פיברינו (גנו) ליטי על ידי שיטת צלחת פיברין (עוגן) ותוצרי תגובה בהתבסס על עמוד9. לאחר מכן, סדרה של כרומטוגרפיה, כגון כרומטוגרפיית חילופי יונים, כרומטוגרפיית סינון ג’ל, כרומטוגרפיית זיקה ושיטות אחרות, צריכה להתבצע לצורך הפרדה וטיהור10,11. לאחר מכן, בדיקת צלחת פיברין מבוצעת שוב כדי לבדוק את הפעילות הפיברינוגנוליטית של כל רכיב מופרד. לבסוף, native-PAGE ונתרן דודציל סולפט (SDS)-PAGE מבוצעים כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של סוכנים פיברינוגנוליטיים פעילים12. לכן, זה קריטי להפריד במהירות ולהציג את החומרים fibrinogenolytic פעיל.
כדי להפריד ולהציג במהירות את החומרים הפיברינוגנוליטיים הפעילים בהומוגנאטים של תולעי בוטנים, פותחה שיטת פיברינוגן-PAGE חדשה על ידי שילוב שיטות לוחות PAGE ופיברינוגן, כלומר, הסובסטרטים של חומרים פיברינוגנוליטיים פיברינוגן נוספו לג’ל הילידים-PAGE. לאחר native-PAGE, הרכיבים הופרדו על ידי משקלם המולקולרי. בינתיים, כל רכיב פיברינוגנוליטי פעיל יכול להיות מוצג על ידי צביעה. בשיטה זו, זיהינו בהצלחה יותר מסוכן פיברינוגנוליטי פעיל אחד של הומוגנט תולעי בוטנים בתוך 6 שעות. יתר על כן, שיטת פיברינוגן-PAGE זו היא ידידותית לזמן ועלות. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש לחקר סוכנים פיברינוגנוליטיים של אורגניזמים אחרים.
sFE הוא אנזים פיברינו (גנו) ליטי חדשני שבודד מתולעי בוטנים על ידי הצוות שלנו בעבר 3,6,8,13. עם זאת, תהליכי הזיהוי של sFE היו גוזלים זמן ועבודה, וכללו זיהוי פעילות פיברינוגנוליטית, הפרדת רכיבי חלבונים ושלבי אי?…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי לשכת המדע והטכנולוגיה של העיר שיאמן (מס ‘3502Z20227197), לשכת המדע והטכנולוגיה של מחוז פוג’יאן (מס ‘2019J01070; No. 2022J01311), ופרויקט חדשנות ויזמות של כישרונות ברמה גבוהה של תוכנית המדע והטכנולוגיה של Quanzhou (מס ‘2022C015R). אנו מודים לפוקאי וואנג (אוניברסיטת Huaqiao) ולליי טונג (אוניברסיטת Huaqiao) על עזרתם הטכנית.
1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | |
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | |
30% Acrylamide/Bis-acrylamide | Biosharp | BL513B | |
Ammonium persulfate | XiLONG SCIENTIFIC | 7727-54-0 | |
Beaker | PYREX | 2-9425-02 | |
Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
Coomas Brillant Blue Stainning solution | Beyotime | P0017F | |
Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
Fibrinogen | Solarbio | F8051 | |
Gel loading pipette tips, Bulk | Biosharp | BS-200-GTB | |
Homogenizer | AHS | ATS-1500 | |
Horizontal rotation oscillator | NuoMi | NMSP-600 | |
Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
Mini-PROTEAN Tetra Cell | BIO-RAD | 165-8000~165-8007 | |
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
Pipette Tip (1 mL) | Axygene | T-1000XT-C | |
Pipette Tip (10 µL) | Axygene | T-10XT-C | |
Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
Pipettor (10µL) | Thermo Fisher Scientific | ZX98775 | |
Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
Pipettor (50 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY15331 | |
Refrigerated Centrifuge | cence | H1650R | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | V900859 | |
Tris | Solarbio | T8060 | |
Tris-HCl | Solarbio | T8230 | |
Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
.