Glikan-Protein Etkileşimlerinin Çözülmesi: Kurtarmaya Nükleer Manyetik Rezonans (NMR)
Summary
Burada, çözeltideki protein-glikan etkileşimlerini karakterize etmeyi amaçlayan bir dizi NMR deneyinin elde edilmesini, işlenmesini ve analizini detaylandıran bir protokol sunuyoruz. En yaygın ligand bazlı ve protein bazlı metodolojiler ana hatlarıyla belirtilmiştir ve bu da şüphesiz yapısal glikobiyoloji ve moleküler tanıma çalışmaları alanlarına katkıda bulunmaktadır.
Abstract
Glikanların proteinlerle etkileşimleri, sağlık ve hastalıkla ilgili birçok olayı modüle eder. Aslında, bu tanıma olaylarının kurulması ve biyolojik sonuçları, her iki partnerin üç boyutlu yapılarının yanı sıra, dinamik özellikleri ve karşılık gelen hücre bölmeleri üzerindeki sunumları ile yakından ilgilidir. NMR teknikleri, bu özellikleri çözmek için benzersizdir ve aslında, glikanların ortak reseptörleri ile bağlanma olaylarını izlemek için çeşitli NMR tabanlı metodolojiler geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Bu protokol, NMR-glikobiyoloji alanında kullanılan en güçlü NMR metodolojilerinden ikisini, 1H-Doygunluk transfer farkı (STD) ve 1 H,15N-Heteronükleer tek kuantum tutarlılık (HSQC) titrasyon deneylerini elde etmek, işlemek ve analiz etmek için prosedürleri ana hatlarıyla belirtir. Gerçekten de, bir araya getirildiklerinde, moleküler tanıma süreçlerinin hem yapısal hem de dinamik yönlerini aydınlatmak için güçlü bir araç seti sunarlar. Bu kapsamlı yaklaşım, glikan-protein etkileşimleri hakkındaki anlayışımızı geliştirir ve kimyasal glikobiyoloji alanındaki araştırmaların ilerlemesine katkıda bulunur.
Introduction
Glikanların moleküler olarak tanınması, sağlık ve hastalıkla ilgili birçok süreç için gereklidir. Glikanlar için biyolojik reseptörlerin (lektinler, antikorlar, enzimler) özgüllüğü ve seçiciliği, büyük ölçüde entalpi (CH-π ve van der Waals, hidrojen bağları, elektrostatik) ve entropinin (hidrofobiklik, dinamik, çözünme-çözünme) çeşitli bileşenleri arasındaki istikrarsız dengenin ayarlanmasına bağlıdır1.
Glikanların büyük kimyasal çeşitliliği ve dinamik doğası göz önüne alındığında, NMR yöntemleri 25 yıldan fazla bir süredir glikan etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır2, çünkü bu metodolojiler, gerekli etkileşim kanıtları diğer metodolojiler kullanılarak elde edilemese bile, atomik çözünürlükte 3,4 kesin ayrıntılara sahip moleküler tanıma olayları hakkında mükemmel bilgiler sağlar. Kilit nokta olarak, NMR çok yönlüdür ve dinamik olayların atomik düzeyde, farklı zaman ölçeklerinde incelenmesine izin verir, bu da çözeltideki glikanların yapısını, konformasyonunu ve dinamiklerini incelemek için açık ara en iyi tekniği oluşturur. Bununla birlikte, bu bilgilerin çözülmesi, dikkatli veri analizi ile birlikte iyi tanımlanmış stratejilerin kullanılmasını gerektiren oldukça karmaşık bir süreç olabilir5.
NMR teknikleri çeşitlidir ve gerçekten de glikan-protein etkileşimlerini çözmek için kullanılabilecek birçok metodoloji vardır6. Burada, glikan-reseptör etkileşimlerini 7,8 deşifre etmek için şu anda kullanılan iki temel NMR yaklaşımını açıklıyoruz ve anahtar glikan epitopunun yanı sıra protein bağlanma bölgesinin9 sunumunun nasıl çözüleceğine vurgu yapıyoruz.
Herhangi bir moleküler tanıma olayında, bir reseptör belirli bir ligand’a bağlandığında, bağlanma10’daki katılımcıların birçok NMR parametresini etkileyen bir kimyasal değişim süreci vardır. Bu nedenle, NMR perspektifinden bakıldığında, etkileşim ya glikan ligandının bakış açısından ya da protein reseptörü11’in bakış açısından izlenebilir. Genel olarak konuşursak, protein reseptörü büyük bir biyomoleküldür (ns zaman ölçeğindeki oranlarla yavaş dönme hareketi ve dolayısıyla hızlı enine gevşeme), etkileşen glikan ise küçük-orta büyüklükte bir molekül olarak düşünülebilir (hızlı dönme hareketi, ps zaman ölçeğindeki oranlarla ve yavaş enine gevşeme)12. Standart bir perspektiften bakıldığında, glikanın NMR sinyalleri dar, reseptörünkiler ise geniştir13.
Ligand bazlı NMR yöntemleri, serbest durumdan bağlı durumageçerken birçok glikan NMR parametresinin yaşadığı dramatik değişime dayanır 14. STD-NMR, çözelti durumunda bağlanmanın varlığının çıkarılmasından glikan bağlayıcı epitopun belirlenmesine kadar çeşitli glikan bağlanma özelliklerini15 değerlendirmek için en çok kullanılan deneysel NMR tekniğidir; yani, protein reseptörü16 ile temas halinde olan ligand atomları.
Alternatif olarak, reseptör bazlı NMR yöntemleri, apo durumu17 için kaydedilenlere göre glikan varlığında protein reseptörünün sinyallerinde meydana gelen değişiklikleri izler. Bunlar esas olarak, her iki durum arasındaki protein sinyallerinin kimyasal kayma bozulmalarını taramaya odaklanmıştır. En yaygın olarak kullanılan deney 1 H-15N HSQC veya TROSY alternatifleri18’dir.
Her iki yaklaşımın kombinasyonu, NMR’nin çok çeşitli afiniteler gösteren birçok farklı sisteme uygulanmasına izin verir. Bununla birlikte, reseptör bazlı NMR yöntemleri için, liganda dayalı olanların aksine, nispeten büyük miktarda çözünür, toplanmamış, kararlı izotop etiketli (15N) protein mevcut olmalıdır.
Burada her iki yöntemi de güçlü ve zayıf yönlerini vurgulayarak açıklıyoruz. Protokolde açıklanan temel adımların Bruker spektrometrelerinin kullanımı için örnek teşkil ettiğini unutmayın. Sonuç olarak, komutlar ve parametre adları TopSpin’de (Bruker’in spektrometreleri kontrol yazılımı) kullanılanlarla uyumludur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doygunluk transfer farkı NMR (STD-NMR), ligand-protein etkileşimlerini incelemek için en çok kullanılan ve çok yönlü NMR yöntemi haline gelmiştir. Yukarıda gösterildiği gibi, doygunluk transfer fenomenine dayanır ve deney düzeneği, iki tek boyutlu (1D) 1H spektrumunun elde edilmesini içerir: rezonans açık” ve “rezonans dışı spektrumlar”. Rezonans deneyi sırasında, proteinin spesifik protonlarının doygunluğu, belirli bir süre boyunca (doyma süresi tipik olarak 1-3 s arasında değişir) düşük güçlü radyofrekans darbelerinin bir dizisi uygulanarak elde edilir. Ligandın doğrudan doygunluğunu önlemek için, doygunluk darbelerinin frekansı ve uzunluğu, proteinin spesifik protonlarını seçici olarak ışınlamak için optimize edilmiştir; yani, herhangi bir ligand sinyalinin boş olduğu bir frekansta ve uygun bir uzunlukta uygulanmalıdırlar (Şekil 1). Genel bir kural olarak, 50 ms doygunluk darbeleri için, doygunluk bölgesinden en yakın ligand sinyallerine kadar 1 ppm’lik fark korunmalıdır. Genel olarak, proteinin alifatik bölgesine uygulanan seçici doygunluk darbeleri, doygunluk etkilerinin artmasını sağlar. Alternatif olarak, ligand molekülü herhangi bir aromatik sinyal içermiyorsa aromatik protonlar (6-7 ppm) da ışınlanabilir. Bu, aromatik gruplar taşımadıkları için doğal olarak oluşan glikanlar için çok faydalıdır. Proteinin belirli bir bölgesi seçici olarak ışınlandıktan sonra, doygunluk, dipolar 1 H-1H çapraz gevşeme (spin difüzyonu) yoluyla protein boyunca yayılır. Sonunda, doygunluk, bağlanma bölgesindeki protein protonlarına ulaşır, bu daha sonra moleküller arası 1 H-1H NOE’ler yoluyla reseptör ile yakın temas halinde olan şeker protonlarına (r < 5 Å) aktarılır. Açıkçası, doymuş ligand protonlarının sinyallerinin yoğunluğu azalır. Doygunluğu aldıktan sonra, bağlanma kinetiği nedeniyle, geçici olarak bağlı ligandlar (hızlı değişim gereklidir) ayrışır ve doygunluk bilgisi serbest durumda toplanır. Bu işlem nedeniyle, NMR rezonans spektrumları azalmış sinyaller sunar (Şekil 2).
Bağlayıcı bir glikanın 1H çekirdeğinin bu yoğunluk bozulmasını açıkça göstermek için, doygunluğun herhangi bir reseptör veya karbonhidrat sinyalinden (genellikle 40-100 ppm arasında) çok uzağa uygulandığı bir kontrol protonu NMR spektrumu (rezonans dışı) elde edilir. Kapalı rezonans ve rezonans açık arasındaki çıkarılan 1D spektrumu, yalnızca ligandın değiştirilmiş yoğunluklara sahip 1H çekirdeklerinin sinyallerini gösterir: manyetizasyonu almak için reseptör bağlanma bölgesine yeterince yakın olanlar (Şekil 2).
Bununla birlikte, bağlı karbonhidratın tüm 1H çekirdekleri aynı miktarda doygunluk almaz. Teorik olarak, reseptörden bağlı liganda manyetizasyon transferi mesafeye bağlıdır (1/r6). Bu, glikan 1H çekirdekleri arasında aktarılan doygunluğun yoğunluklarının, ligandın protonları ile reseptörün protonları arasındaki uzamsal yakınlıklar hakkında bilgi içerdiği ve STD NMR yoğunluklarının reseptöre daha yakın olan protonlar için daha büyük olduğu anlamına gelir. Buna göre, STD NMR deneyi aynı zamanda karbonhidratın bağlanma epitopunun belirlenmesine de izin verir (Şekil 2 ve Şekil 3), çünkü protein yüzeyine daha yakın oturan ligandın protonları, bağlanmaya doğrudan katılmayanlardan daha yüksek yoğunluklar gösterir.
Deney, zayıf-orta afiniteye sahip sistemlere, nadiren düşük μM veya nM aralığında güçlü afiniteye sahip sistemlere uygulanabilir. Gerçekten de, gevşeme zaman ölçeğinde ayrışma oranının hızlı olmasını gerektirir. Aksi takdirde, doygunluk transfer bilgisi, ligand ayrışmadan önce gevşeme yoluyla kaybolur.
Öte yandan, protein bazlı NMR deneyleri, atomik çözünürlük yapılarını çözmeden ligand-protein etkileşimini amino asit seviyesi doğruluğu ile çözmek için benzersizdir. Birlikte kristalleşmeye ihtiyaç duymadan çözelti içindeki moleküler tanıma olaylarını doğrudan inceler. CSP analiz haritalaması, ligandları keşfetmek ve protein bağlanma bölgesini haritalamak için son derece güçlüdür (Şekil 4 ve Şekil 5). Bu yöntem, kimyasal kayma zaman ölçeğinde21 değişim kurunun yavaş olduğu sistemler için bile, mM ve nM aralığı arasındaki herhangi bir afinite aralığına uygulanabilir.
Bununla birlikte, bu yaklaşım, gevşeme sorunları nedeniyle moleküler ağırlıkları 30-40 kDa’nın üzerinde olan proteinler için muhtemelen işe yaramayacaktır. TROSY alternatifi18 daha sonra kullanılabilir, protein döterasyonu ile birleştirildiğinde özellikle güçlüdür. Ayrıca, protein 15N ile eşit şekilde etiketlenmelidir (ve gerekli omurga atamasını tamamlayabilmek için 13C ve 15N ile çift etiketlenmiş başka bir numune). Bu nedenle, karşılık gelen ekspresyon sistemi de dahil olmak üzere protein ekspresyon koşulları, miligram miktarlarda protein elde edebilmek için optimize edilmelidir. Oligomerleşme veya toplanma eğilimi gösteren proteinler de bu analiz için uygun değildir. Burada NMR verilerini kaydetmek için kullanılan cihaz, bir TCI kriyoprob ile donatılmış bir Bruker 800 MHz spektrometresidir. Bu metodolojiyi 600 MHz’in altındaki aletler kullanarak veya kriyojenik prob olmadan kullanmak oldukça zor olacaktır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MCIN/AEI/10.13039/501100011033 tarafından finanse edilen Severo Ochoa Mükemmeliyet Merkezi Akreditasyonu CEX2021-001136-S ve Instituto de Salud Carlos III’ün (ISCIII, Madrid, İspanya) bir girişimi olan CIBERES için İspanya’dan Agencia Estatal de Investigación’a teşekkür ederiz. GLYCOTWINNING projesi için Avrupa Komisyonu’na da teşekkür ederiz.
Materials
| 5 mm Shigemi microtube set mat | CortecNet SAS | S30BMS-005B | |
| Alpha-Lactose-Agarose | Sigma-Aldrich Química S.L. | 7634-5ML | |
| Ammonium chloride (15 N, 99%) | LC-0179-N-50G | Tracer Tecnologías Analíticas S.L | |
| Ampicillin (Sodium Salt) | Melford Laboratories LTD | A40040 | |
| BIOVIA Discovery studio | BIOVIA, Dassault Systèmes | ||
| BL21(DE3) Chemically Competent Cells | Merck Life Science, S.L.U. | CMC0014-40X40UL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-22R | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-1000 | |
| Incubator | Eppendorf | Innova 42 | |
| IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside) | VWR International Eurolab S.L. | VW437144N | |
| LacNAc | Elicityl | GLY008 | |
| Luria Bertani (LB) Broth | Merck Life Science, S.L.U. | 3397-1KG | |
| Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC | VWR International Eurolab S.L. | 214-1137 | |
| PBS 10x | Bio-Rad | 1610780 | |
| PyMOL | PyMOL Molecular Graphics System | Version 2.0 Schrödinger | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | VC 505 | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 600 MHz AVANCE III | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 800 MHz AVANCE III |
References
- Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
- Poveda, A., Jimenez-Barbero, J. NMR studies of carbohydrate-protein interactions in solution. Chem Soc Rev. 27, 133-144 (1998).
- Kogelberg, H., Solís, D., Jiménez-Barbero, J. New structural insights into carbohydrate-protein interactions from NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 13 (5), 646-653 (2003).
- Widmalm, G. Glycan shape, motions, and interactions explored by NMR spectroscopy. JACS Au. 4 (1), 20-39 (2024).
- Marchetti, R., et al. 34;Rules of Engagement" of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling. ChemistryOpen. 5 (4), 274-296 (2016).
- Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. The recognition of glycans by protein receptors. Insights from NMR spectroscopy. Chem Commun. 54 (38), 4761-4769 (2018).
- Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Glycan structures and their interactions with proteins. A NMR view. Curr Opin Struct Biol. 62, 22-30 (2020).
- Cañada, F. J., et al. Conformational and structural characterization of carbohydrates and their interactions studied by NMR. Curr Med Chem. 29 (7), 1147-1172 (2022).
- Valverde, P., Quintana, J. I., Santos, J. I., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Novel NMR avenues to explore the conformation and interactions of glycans. ACS Omega. 4, 13618-13630 (2019).
- Jiménez-Barbero, J., Asensio, J. L., Cañada, F. J., Poveda, A. Free and protein-bound carbohydrate structures. Curr Opin Struct Biol. 9 (5), 549-555 (1999).
- Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR. Chem Soc Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).
- Roldós, V., Cañada, F. J., Jiménez-Barbero, J. Carbohydrate-protein interactions: a 3D view by NMR. Chembiochem. 12 (7), 990-1005 (2011).
- Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J., Millet, O. NMR of glycoproteins: profiling, structure, conformation, and interactions. Curr Opin Struct Biol. 68, 9-17 (2021).
- del Carmen Fernández-Alonso, M., Díaz, D., Berbis, M. A., Marcelo, F., Cañada, J., Jiménez-Barbero, J. Protein-carbohydrate interactions studied by NMR: from molecular recognition to drug design. Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 816-830 (2012).
- Angulo, J., Nieto, P. M. STD-NMR: application to transient interactions between biomolecules-a quantitative approach. Eur Biophys J. 40 (12), 1357-1369 (2012).
- Mayer, M., Meyer, B. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor. J Am Chem Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).
- Williamson, M. P. Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 73, 1-16 (2013).
- Fernández, C., Adeishvili, K., Wüthrich, K. Transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy with the outer membrane protein OmpX in dihexanoyl phosphatidylcholine micelles. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2358-2363 (2001).
- Yee, A., Gutmanas, A., Arrowsmith, C. H. Solution NMR in structural genomics. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 611-617 (2006).
- Skinner, S. P., Fogh, R. H., Boucher, W., Ragan, T. J., Mureddu, L. G., Vuister, G. W. CCPNMR AnalysisAssign: a flexible platform for integrated NMR analysis. J Biomol NMR. 66 (2), 111-124 (2016).
- Gimeno, A., et al. Minimizing the entropy penalty for ligand binding: Lessons from the molecular recognition of the histo blood-group antigens by human Galectin-3. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (22), 7268-7272 (2019).
