Распутывание гликан-белковых взаимодействий: на помощь приходит ядерный магнитный резонанс (ЯМР)
Summary
Здесь мы представляем протокол, подробно описывающий получение, обработку и анализ серии экспериментов ЯМР, направленных на характеристику белково-гликановых взаимодействий в растворе. Описаны наиболее распространенные методологии, основанные на лигандах и белках, которые, несомненно, вносят вклад в области структурной гликобиологии и исследований молекулярного распознавания.
Abstract
Взаимодействие гликанов с белками модулирует многие события, связанные со здоровьем и болезнями. На самом деле, установление этих событий узнавания и их биологические последствия тесно связаны с трехмерными структурами обоих партнеров, а также с их динамическими особенностями и представлением в соответствующих клеточных компартментах. Методы ЯМР уникальны для распутывания этих характеристик, и, действительно, были разработаны и применены различные методологии на основе ЯМР для мониторинга событий связывания гликанов с их ассоциированными рецепторами. В этом протоколе описываются процедуры сбора, обработки и анализа двух наиболее мощных методологий ЯМР, используемых в области ЯМР-гликобиологии, экспериментовпо титрованию 1 H-Saturation Transfer difference (STD) и 1 H,15N-гетеронуклеарной одиночной квантовой когерентности (HSQC), которые дополняют друг друга информацией с точки зрения гликана и белка соответственно. Действительно, в сочетании они предлагают мощный инструментарий для прояснения как структурных, так и динамических аспектов процессов молекулярного узнавания. Этот комплексный подход расширяет наше понимание гликан-белковых взаимодействий и способствует продвижению исследований в области химической гликобиологии.
Introduction
Молекулярное распознавание гликанов имеет важное значение для многих процессов, связанных со здоровьем и болезнями. Специфичность и селективность биологических рецепторов (лектинов, антител, ферментов) к гликанам в значительной степени зависят от корректировки нарушенного баланса между различными компонентами энтальпии (CH-π и Ван-дер-Ваальса, водородные связи, электростатика) и энтропии (гидрофобность, динамика, сольватация-десольватация)1.
Учитывая большое химическое разнообразие и динамическую природу гликанов, методы ЯМР широко используются для анализа взаимодействий гликанов уже более 25лет2, поскольку эти методологии предоставляют превосходную информацию о событиях молекулярного распознавания с точными деталями при атомном разрешении 3,4, даже когда требуемые доказательства взаимодействия не могут быть получены с помощью других методологий. Ключевым моментом является то, что ЯМР универсален и позволяет изучать динамические события на атомном уровне, в различных временных масштабах, что на сегодняшний день является лучшим методом для изучения структуры, конформации и динамики гликанов в растворе. Тем не менее, распутывание этой информации может быть довольно сложным процессом, требующим использования четко определенных стратегий в сочетании с тщательным анализом данных.
Методы ЯМР разнообразны, и, действительно, существует множество методологий, которые могут быть использованы для раскрытия гликан-белковых взаимодействий6. В данной работе мы описываем два основных подхода к ЯМР, которые в настоящее время используются для расшифровки гликан-рецепторных взаимодействий 7,8, уделяя особое внимание тому, как распутать презентацию ключевого эпитопа гликанов, а также сайта связывания белка9.
При любом событии молекулярного узнавания, когда рецептор связывается с данным лигандом, происходит процесс химического обмена, который влияет на многие параметры ЯМР участников связывания10. Таким образом, с точки зрения ЯМР, взаимодействие можно контролировать либо с точки зрения гликанового лиганда, либо с точки зрения белкового рецептора11. Вообще говоря, белковый рецептор представляет собой крупную биомолекулу (медленное вращательное движение, со скоростями в масштабе ns и, следовательно, быструю поперечную релаксацию), в то время как взаимодействующий гликан можно рассматривать как молекулу малого и среднего размера (быстрое вращательное движение, со скоростями в масштабе ps и медленная поперечная релаксация)12. Со стандартной точки зрения, сигналы ЯМР гликана узкие, в то время как сигналы рецептораширокие13.
Методы ЯМР на основе лигандов основаны на резком изменении, которое претерпевают многие параметры гликанового ЯМР при переходе из свободного состояния в связанное14. ЗППП-ЯМР является наиболее часто используемым экспериментальным методом ЯМР для оценки различных особенностей связывания гликана15, от вывода о существовании связывания в состоянии раствора до определения эпитопа связывания гликанов; То есть, атомы лиганда, которые находятся в контакте с белковым рецептором16.
В качестве альтернативы, методы ЯМР на основе рецепторов отслеживают изменения, происходящие в сигналах белкового рецептора в присутствии гликана по сравнению с теми, которые регистрируются для состояния апо17. Они в основном сосредоточены на скрининге химических сдвигов, возмущений белковых сигналов между обоими состояниями. Наиболее часто используемым экспериментом является 1 H-15N HSQC или его альтернативы TROSY18.
Комбинация обоих подходов позволяет применять ЯМР ко многим разнообразным системам, которые проявляют широкий спектр сродства. Однако для методов ЯМР, основанных на рецепторах, в отличие от методов на основе лиганда, должно быть доступно относительно большое количество растворимого, неагрегированного, меченного стабильным изотопом (15N) белка.
Здесь мы опишем оба метода, выделив их сильные и слабые стороны. Обратите внимание, что основные шаги, описанные в протоколе, служат примерами использования спектрометров Bruker. Следовательно, имена команд и параметров совпадают с теми, которые используются в TopSpin (программное обеспечение для управления спектрометрами Bruker).
Protocol
Representative Results
Discussion
Разностный ЯМР с переносом насыщения (STD-NMR) стал наиболее используемым и универсальным методом ЯМР для изучения лиганд-белковых взаимодействий. Как показано выше, он основан на явлении переноса насыщения, а экспериментальная установка включает в себя получение двух одномерных (1D) 1H спектров: резонансного и внерезонансного спектров. В ходе резонансного эксперимента насыщение конкретных протонов белка достигается за счет подачи последовательности маломощных радиочастотных импульсов в течение определенного периода времени (время насыщения обычно колеблется от 1 до 3 с). Чтобы избежать прямого насыщения лиганда, частоту и длину импульсов насыщения оптимизируют для селективного облучения специфических протонов белка; т.е. они должны применяться на частоте, свободной от любых лигандных сигналов, и с соответствующей длиной (рис. 1). Как правило, для импульсов насыщения длительностью 50 мс следует сохранять разность в 1 ppm от области насыщения до ближайших лигандных сигналов. Как правило, селективные импульсы насыщения, применяемые на алифатической области белка, обеспечивают повышенный эффект насыщения. В качестве альтернативы можно облучать ароматические протоны (6-7 ppm), если молекула лиганда не содержит ароматических сигналов. Это очень полезно для гликанов природного происхождения, так как они не несут ароматических групп. После того, как определенная область белка селективно облучается, насыщение распространяется вдоль белка через диполярную перекрестную релаксацию 1H-1H (спиновая диффузия). В конечном счете, насыщение достигает белковых протонов в месте связывания, которое затем переносится на сахарные протоны, находящиеся в тесном контакте (r < 5 Å) с рецептором через межмолекулярные 1 H-1H NOEs. Очевидно, что интенсивность сигналов насыщенных лигандных протонов уменьшается. После получения насыщения, благодаря кинетике связывания, переходно связанные лиганды (требуется быстрый обмен) диссоциируют, и информация о насыщении накапливается в свободном состоянии. Из-за этого процесса резонансные спектры ЯМР представляют собой ослабленные сигналы (рис. 2).
Чтобы наглядно продемонстрировать возмущение этой интенсивности ядер 1Н связывающего гликана, получают контрольный протонный ЯМР-спектр (внерезонансный), в котором насыщение применяется далеко от любого рецептора или углеводного сигнала (обычно между 40-100 ppm) в тех же условиях. Вычитаемый 1D спектр между внерезонансным и он-резонансным показывает исключительно сигналы ядер 1Н лиганда, которые имеют измененную интенсивность: те, которые были достаточно близки к сайту связывания рецептора для получения намагниченности (рис. 2).
Тем не менее, не все ядра 1 Н связанного углевода получают одинаковое количество насыщения. Теоретически перенос намагниченности от рецептора к связанному лиганду зависит от расстояния (1/r6). Это означает, что интенсивности перенесенного насыщения между ядрами гликана 1Н содержат информацию о пространственных близостях между протонами лиганда и протонами рецептора, а интенсивности ЯМР ЗППП больше для тех протонов, которые находятся ближе к рецептору. Соответственно, эксперимент STD NMR также позволяет определить связывающий эпитоп углевода (рис. 2 и рис. 3), поскольку протоны лиганда, находящиеся ближе к поверхности белка, проявляют более высокую интенсивность, чем те, которые непосредственно не участвуют в связывании.
Эксперимент может быть применен к системам со слабым-средним сродством, реже к системам с сильным сродством в низком μМ или нМ диапазоне. Действительно, для этого необходимо, чтобы скорость диссоциации была высокой на шкале времени релаксации. В противном случае информация о переносе насыщения теряется из-за релаксации до того, как лиганд диссоциирует.
С другой стороны, эксперименты ЯМР на основе белков уникальны для раскрытия лиганд-белкового взаимодействия с точностью до уровня аминокислот без решения проблем структуры атомного разрешения. Он непосредственно исследует явления молекулярного узнавания в растворе без необходимости сокристаллизации. Картирование анализа CSP является исключительно мощным средством для обнаружения лигандов и картирования сайта связывания белка (Рисунок 4 и Рисунок 5). Этот метод применим к любому диапазону сродства между мМ и нМ диапазонами, даже для систем, в которых обменный курс является медленным на шкале времени химического сдвига21.
Тем не менее, этот подход, вероятно, не будет работать для белков с молекулярной массой выше 30-40 кДа из-за проблем с релаксацией. В этом случае можно использовать альтернативуTROSY 18 , которая является особенно мощной в сочетании с дейтерацией белка. Кроме того, белок должен быть равномерно помечен 15N (а другой образец должен быть дважды помечен 13C и 15N, чтобы иметь возможность выполнить необходимое назначение основной цепи). Следовательно, условия экспрессии белка, включая соответствующую систему экспрессии, должны быть оптимизированы для получения миллиграммовых количеств белка. Белки, которые проявляют склонность к олигомеризации или агрегации, также не подходят для этого анализа. Прибором, используемым в настоящем документе для регистрации данных ЯМР, является спектрометр Bruker 800 МГц, оснащенный криозондом TCI. Было бы очень сложно использовать эту методологию с приборами на частоте ниже 600 МГц или без криогенного зонда.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Agencia Estatal de Investigación из Испании за аккредитацию Центра передового опыта Северо Очоа CEX2021-001136-S, финансируемую MCIN/AEI/10.13039/501100011033, и CIBERES, инициативу Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, Madrid, Spain). Мы также благодарим Европейскую комиссию за проект GLYCOTWINNING.
Materials
| 5 mm Shigemi microtube set mat | CortecNet SAS | S30BMS-005B | |
| Alpha-Lactose-Agarose | Sigma-Aldrich Química S.L. | 7634-5ML | |
| Ammonium chloride (15 N, 99%) | LC-0179-N-50G | Tracer Tecnologías Analíticas S.L | |
| Ampicillin (Sodium Salt) | Melford Laboratories LTD | A40040 | |
| BIOVIA Discovery studio | BIOVIA, Dassault Systèmes | ||
| BL21(DE3) Chemically Competent Cells | Merck Life Science, S.L.U. | CMC0014-40X40UL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-22R | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-1000 | |
| Incubator | Eppendorf | Innova 42 | |
| IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside) | VWR International Eurolab S.L. | VW437144N | |
| LacNAc | Elicityl | GLY008 | |
| Luria Bertani (LB) Broth | Merck Life Science, S.L.U. | 3397-1KG | |
| Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC | VWR International Eurolab S.L. | 214-1137 | |
| PBS 10x | Bio-Rad | 1610780 | |
| PyMOL | PyMOL Molecular Graphics System | Version 2.0 Schrödinger | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | VC 505 | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 600 MHz AVANCE III | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 800 MHz AVANCE III |
References
- Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
- Poveda, A., Jimenez-Barbero, J. NMR studies of carbohydrate-protein interactions in solution. Chem Soc Rev. 27, 133-144 (1998).
- Kogelberg, H., Solís, D., Jiménez-Barbero, J. New structural insights into carbohydrate-protein interactions from NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 13 (5), 646-653 (2003).
- Widmalm, G. Glycan shape, motions, and interactions explored by NMR spectroscopy. JACS Au. 4 (1), 20-39 (2024).
- Marchetti, R., et al. 34;Rules of Engagement" of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling. ChemistryOpen. 5 (4), 274-296 (2016).
- Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. The recognition of glycans by protein receptors. Insights from NMR spectroscopy. Chem Commun. 54 (38), 4761-4769 (2018).
- Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Glycan structures and their interactions with proteins. A NMR view. Curr Opin Struct Biol. 62, 22-30 (2020).
- Cañada, F. J., et al. Conformational and structural characterization of carbohydrates and their interactions studied by NMR. Curr Med Chem. 29 (7), 1147-1172 (2022).
- Valverde, P., Quintana, J. I., Santos, J. I., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Novel NMR avenues to explore the conformation and interactions of glycans. ACS Omega. 4, 13618-13630 (2019).
- Jiménez-Barbero, J., Asensio, J. L., Cañada, F. J., Poveda, A. Free and protein-bound carbohydrate structures. Curr Opin Struct Biol. 9 (5), 549-555 (1999).
- Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR. Chem Soc Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).
- Roldós, V., Cañada, F. J., Jiménez-Barbero, J. Carbohydrate-protein interactions: a 3D view by NMR. Chembiochem. 12 (7), 990-1005 (2011).
- Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J., Millet, O. NMR of glycoproteins: profiling, structure, conformation, and interactions. Curr Opin Struct Biol. 68, 9-17 (2021).
- del Carmen Fernández-Alonso, M., Díaz, D., Berbis, M. A., Marcelo, F., Cañada, J., Jiménez-Barbero, J. Protein-carbohydrate interactions studied by NMR: from molecular recognition to drug design. Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 816-830 (2012).
- Angulo, J., Nieto, P. M. STD-NMR: application to transient interactions between biomolecules-a quantitative approach. Eur Biophys J. 40 (12), 1357-1369 (2012).
- Mayer, M., Meyer, B. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor. J Am Chem Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).
- Williamson, M. P. Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 73, 1-16 (2013).
- Fernández, C., Adeishvili, K., Wüthrich, K. Transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy with the outer membrane protein OmpX in dihexanoyl phosphatidylcholine micelles. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2358-2363 (2001).
- Yee, A., Gutmanas, A., Arrowsmith, C. H. Solution NMR in structural genomics. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 611-617 (2006).
- Skinner, S. P., Fogh, R. H., Boucher, W., Ragan, T. J., Mureddu, L. G., Vuister, G. W. CCPNMR AnalysisAssign: a flexible platform for integrated NMR analysis. J Biomol NMR. 66 (2), 111-124 (2016).
- Gimeno, A., et al. Minimizing the entropy penalty for ligand binding: Lessons from the molecular recognition of the histo blood-group antigens by human Galectin-3. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (22), 7268-7272 (2019).
