Districare le interazioni glicano-proteina: la risonanza magnetica nucleare (NMR) in soccorso
Summary
Qui, presentiamo un protocollo che descrive in dettaglio l’acquisizione, l’elaborazione e l’analisi di una serie di esperimenti NMR volti a caratterizzare le interazioni proteina-glicano in soluzione. Vengono descritte le metodologie più comuni basate su ligandi e proteine, che indubbiamente contribuiscono ai campi della glicobiologia strutturale e degli studi di riconoscimento molecolare.
Abstract
Le interazioni dei glicani con le proteine modulano molti eventi legati alla salute e alla malattia. Infatti, l’instaurarsi di questi eventi di riconoscimento e le loro conseguenze biologiche sono intimamente correlate alle strutture tridimensionali di entrambi i partner, nonché alle loro caratteristiche dinamiche e alla loro presentazione sui corrispondenti compartimenti cellulari. Le tecniche NMR sono uniche per districare queste caratteristiche e, in effetti, sono state sviluppate e applicate diverse metodologie basate sulla NMR per monitorare gli eventi di legame dei glicani con i loro recettori associati. Questo protocollo delinea le procedure per acquisire, elaborare e analizzare due delle più potenti metodologie NMR impiegate nel campo della glicobiologia NMR, gli esperimenti di titolazione 1H-Saturation transfer difference (STD) e 1 H,15 N,15N-Eteronuclear single quantum coherence (HSQC), che offrono informazioni complementari rispettivamente dal punto di vista del glicano e della proteina. Infatti, quando combinati offrono un potente kit di strumenti per chiarire sia gli aspetti strutturali che dinamici dei processi di riconoscimento molecolare. Questo approccio globale migliora la nostra comprensione delle interazioni glicano-proteina e contribuisce a far progredire la ricerca nel campo della glicobiologia chimica.
Introduction
Il riconoscimento molecolare dei glicani è essenziale per molti processi legati alla salute e alla malattia. La specificità e la selettività dei recettori biologici (lectine, anticorpi, enzimi) per i glicani dipendono fortemente dalla regolazione del precario equilibrio tra i diversi componenti dell’entalpia (CH-π e van der Waals, legami idrogeno, elettrostatica) e dell’entropia (idrofobicità, dinamica, solvatazione-desolvatazione)1.
Data la grande diversità chimica e la natura dinamica dei glicani, i metodi NMR sono stati ampiamente impiegati per sezionare le interazioni dei glicani per più di 25 anni2, poiché queste metodologie forniscono informazioni eccellenti sugli eventi di riconoscimento molecolare con dettagli precisi, alla risoluzione atomica 3,4, anche quando l’evidenza di interazione richiesta non può essere recuperata impiegando altre metodologie. Come punto chiave, la risonanza magnetica nucleare è versatile e consente di studiare eventi dinamici, a livello atomico, a diverse scale temporali, costituendo di gran lunga la tecnica migliore per studiare la struttura, la conformazione e la dinamica dei glicani in soluzione. Tuttavia, districare queste informazioni può essere un processo piuttosto complesso che richiede l’impiego di strategie ben definite insieme a un’attenta analisi dei dati5.
Le tecniche NMR sono diverse e, in effetti, ci sono molte metodologie che possono essere impiegate per svelare le interazioni glicano-proteina6. Di seguito descriviamo due approcci NMR di base che sono attualmente impiegati per decifrare le interazioni glicano-recettore 7,8, ponendo l’accento su come districare la presentazione dell’epitopo chiave del glicano e del sito di legame della proteina9.
In qualsiasi evento di riconoscimento molecolare, quando un recettore si lega a un dato ligando, si verifica un processo di scambio chimico che influenza molti parametri NMR dei partecipanti al legame10. Pertanto, dal punto di vista della RMN, l’interazione può essere monitorata sia dal punto di vista del ligando del glicano che da quello del recettore proteico11. In generale, il recettore proteico è una biomolecola di grandi dimensioni (movimento rotatorio lento, con velocità nella scala temporale ns e, quindi, rilassamento trasversale rapido), mentre il glicano interagente può essere considerato come una molecola di dimensioni medio-piccole (movimento rotatorio veloce, con velocità nella scala temporale ps e rilassamento trasversale lento)12. Da una prospettiva standard, i segnali NMR del glicano sono stretti, mentre quelli del recettore sono ampi13.
I metodi NMR basati su ligandi si basano sul drastico cambiamento che molti parametri NMR dei glicani sperimentano quando passano dallo stato libero a quello legato14. STD-NMR è la tecnica NMR sperimentale più impiegata per valutare diverse caratteristiche di legame dei glicani15, dalla deduzione dell’esistenza di legame nello stato di soluzione alla determinazione dell’epitopo di legame dei glicani; cioè, gli atomi del ligando che sono in contatto con il recettore proteico16.
In alternativa, i metodi NMR basati su recettori monitorano i cambiamenti che avvengono nei segnali del recettore proteico in presenza del glicano rispetto a quelli registrati per lo stato apo17. Questi si concentrano principalmente sullo screening delle perturbazioni di spostamento chimico dei segnali proteici tra i due stati. L’esperimento più comunemente impiegato è 1 H-15N HSQC, o le sue alternative TROSY18.
La combinazione di entrambi gli approcci consente di applicare la risonanza magnetica mobile a molti sistemi diversi che mostrano un’ampia gamma di affinità. Tuttavia, per i metodi NMR basati su recettori, a differenza di quelli basati sul ligando, deve essere disponibile una quantità relativamente grande di proteina solubile, non aggregata, marcata con isotopi stabili (15N).
Descriviamo qui entrambi i metodi, evidenziandone i punti di forza e di debolezza. Si noti che i passaggi di base descritti nel protocollo servono come esempi per l’uso degli spettrometri Bruker. Di conseguenza, i nomi dei comandi e dei parametri sono in linea con quelli utilizzati in TopSpin (il software di controllo degli spettrometri di Bruker).
Protocol
Representative Results
Discussion
La differenza di trasferimento di saturazione NMR (STD-NMR) è diventata il metodo NMR più utilizzato e versatile per studiare le interazioni ligando-proteina. Come mostrato sopra, si basa sul fenomeno del trasferimento di saturazione e la configurazione sperimentale prevede l’acquisizione di due spettri monodimensionali (1D) 1H: lo spettro in risonanza e lo spettro in fuori risonanza. Durante l’esperimento di risonanza, la saturazione di protoni specifici della proteina viene ottenuta applicando un treno di impulsi a radiofrequenza a bassa potenza durante un certo periodo (il tempo di saturazione varia tipicamente da 1 a 3 s). Per evitare la saturazione diretta del ligando, la frequenza e la lunghezza degli impulsi di saturazione sono ottimizzate per irradiare selettivamente protoni specifici della proteina; cioè, devono essere applicati a una frequenza libera da qualsiasi segnale del ligando e con una lunghezza appropriata (Figura 1). Come regola generale, per impulsi di saturazione di 50 ms, è necessario mantenere una differenza di 1 ppm tra la regione di saturazione e i segnali del ligando più vicini. Generalmente, gli impulsi di saturazione selettiva applicati sulla regione alifatica della proteina forniscono un aumento degli effetti di saturazione. In alternativa, i protoni aromatici (6-7 ppm) possono anche essere irradiati se la molecola del ligando non contiene alcun segnale aromatico. Questo è molto utile per i glicani presenti in natura, in quanto non portano gruppi aromatici. Una volta che una certa regione della proteina viene irradiata selettivamente, la saturazione si propaga lungo la proteina attraverso il cross-rilassamento dipolare 1 H-1H (diffusione dello spin). Alla fine, la saturazione raggiunge i protoni proteici nel sito di legame, che viene poi trasferito ai protoni dello zucchero che sono in stretto contatto (r < 5 Å) con il recettore tramite NOE intermolecolari 1 H-1H. Ovviamente, l’intensità dei segnali dei protoni ligando saturi diminuisce. Dopo aver ricevuto la saturazione, a causa della cinetica di legame, i ligandi legati transitoriamente (è richiesto uno scambio veloce) si dissociano e l’informazione di saturazione si accumula nello stato libero. A causa di questo processo, gli spettri di risonanza NMR presentano segnali ridotti (Figura 2).
Per mostrare chiaramente questa perturbazione dell’intensità dei nuclei 1H di un glicano legante, viene acquisito uno spettro NMR del protone di controllo (off-resonance) in cui la saturazione viene applicata lontano da qualsiasi segnale recettoriale o glucidico (di solito tra 40-100 ppm), nelle stesse condizioni. Lo spettro 1D sottratto tra la risonanza off e la risonanza on mostra esclusivamente i segnali dei nuclei 1H del ligando che hanno intensità modificate: quelli che erano abbastanza vicini al sito di legame del recettore per ricevere la magnetizzazione (Figura 2).
Tuttavia, non tutti i nuclei 1H del carboidrato legato ricevono la stessa quantità di saturazione. Teoricamente, il trasferimento di magnetizzazione dal recettore al ligando legato è dipendente dalla distanza (1/r6). Ciò significa che le intensità di saturazione trasferite tra i nuclei del glicano 1H contengono informazioni sulle prossimità spaziali tra i protoni del ligando e quelli del recettore, e le intensità STD NMR sono maggiori per quei protoni che sono più vicini al recettore. Di conseguenza, l’esperimento MRN STD consente anche di determinare l’epitopo di legame del carboidrato (Figura 2 e Figura 3) poiché i protoni del ligando che si trovano più vicino alla superficie proteica mostrano intensità più elevate rispetto a quelli che non partecipano direttamente al legame.
L’esperimento può essere applicato a sistemi con affinità medio-debole, raramente a sistemi con affinità forti nell’intervallo dei μM o nM. Infatti, richiede che il tasso di dissociazione sia veloce nella scala temporale del rilassamento. In caso contrario, l’informazione sul trasferimento della saturazione viene persa attraverso il rilassamento prima che il ligando si dissoci.
D’altra parte, gli esperimenti NMR basati sulle proteine sono unici per svelare l’interazione ligando-proteina con l’accuratezza del livello di amminoacido senza risolvere le strutture di risoluzione atomica. Esamina direttamente i fenomeni di riconoscimento molecolare in soluzione senza la necessità di co-cristallizzazione. La mappatura dell’analisi CSP è eccezionalmente potente per scoprire ligandi e mappare il sito di legame delle proteine (Figura 4 e Figura 5). Questo metodo è applicabile a qualsiasi intervallo di affinità tra l’intervallo mM e nM, anche per sistemi in cui il tasso di cambio è lento nella scala temporale di spostamento chimico21.
Tuttavia, questo approccio probabilmente non funzionerà per proteine con pesi molecolari superiori a 30-40 kDa a causa di problemi di rilassamento. L’alternativa TROSY18 può quindi essere utilizzata, particolarmente potente se accoppiata alla deuterazione delle proteine. Inoltre, la proteina deve essere marcata in modo uniforme con 15N (e un altro campione marcato due volte con 13C e 15N per essere in grado di completare l’assegnazione della spina dorsale richiesta). Pertanto, le condizioni di espressione proteica, incluso il corrispondente sistema di espressione, dovrebbero essere ottimizzate per essere in grado di ottenere quantità di milligrammi di proteine. Anche le proteine che mostrano una tendenza a oligomerizzarsi o aggregarsi non sono adatte per questa analisi. Lo strumento qui utilizzato per registrare i dati NMR è uno spettrometro Bruker da 800 MHz dotato di una criosonda TCI. Sarebbe molto impegnativo utilizzare questa metodologia utilizzando strumenti al di sotto di 600 MHz o senza una sonda criogenica.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo l’Agencia Estatal de Investigación della Spagna per l’accreditamento del Centro di Eccellenza Severo Ochoa CEX2021-001136-S, finanziato da MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, e CIBERES, un’iniziativa dell’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, Madrid, Spagna). Ringraziamo anche la Commissione Europea per il progetto GLYCOTWINNING.
Materials
| 5 mm Shigemi microtube set mat | CortecNet SAS | S30BMS-005B | |
| Alpha-Lactose-Agarose | Sigma-Aldrich Química S.L. | 7634-5ML | |
| Ammonium chloride (15 N, 99%) | LC-0179-N-50G | Tracer Tecnologías Analíticas S.L | |
| Ampicillin (Sodium Salt) | Melford Laboratories LTD | A40040 | |
| BIOVIA Discovery studio | BIOVIA, Dassault Systèmes | ||
| BL21(DE3) Chemically Competent Cells | Merck Life Science, S.L.U. | CMC0014-40X40UL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-22R | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-1000 | |
| Incubator | Eppendorf | Innova 42 | |
| IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside) | VWR International Eurolab S.L. | VW437144N | |
| LacNAc | Elicityl | GLY008 | |
| Luria Bertani (LB) Broth | Merck Life Science, S.L.U. | 3397-1KG | |
| Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC | VWR International Eurolab S.L. | 214-1137 | |
| PBS 10x | Bio-Rad | 1610780 | |
| PyMOL | PyMOL Molecular Graphics System | Version 2.0 Schrödinger | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | VC 505 | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 600 MHz AVANCE III | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 800 MHz AVANCE III |
References
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