Glykan-Protein-Wechselwirkungen entwirren: Kernspinresonanz (NMR) als Rettung
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Erfassung, Verarbeitung und Analyse einer Reihe von NMR-Experimenten zur Charakterisierung von Protein-Glykan-Wechselwirkungen in Lösung beschreibt. Es werden die gängigsten ligandenbasierten und proteinbasierten Methoden skizziert, die zweifellos zu den Bereichen der strukturellen Glykobiologie und der molekularen Erkennungsstudien beitragen.
Abstract
Die Wechselwirkungen von Glykanen mit Proteinen modulieren viele Ereignisse, die mit Gesundheit und Krankheit zusammenhängen. Tatsächlich sind die Etablierung dieser Erkennungsereignisse und ihre biologischen Konsequenzen eng mit den dreidimensionalen Strukturen beider Partner sowie mit ihren dynamischen Merkmalen und ihrer Präsentation auf den entsprechenden Zellkompartimenten verbunden. NMR-Techniken sind einzigartig, um diese Eigenschaften zu entwirren, und in der Tat wurden verschiedene NMR-basierte Methoden entwickelt und angewendet, um die Bindungsereignisse von Glykanen mit ihren assoziierten Rezeptoren zu überwachen. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Erfassung, Verarbeitung und Analyse von zwei der leistungsfähigsten NMR-Methoden , dieim Bereich der NMR-Glykobiologie eingesetzt werden, 1 H-Sättigungstransferdifferenz (STD) und 1 H,15N-Heteronukleare Single Quantum Kohärenz (HSQC) Titrationsexperimente, die komplementär Informationen aus der Glykan- bzw. Proteinperspektive liefern. In Kombination bieten sie ein leistungsfähiges Instrumentarium, um sowohl die strukturellen als auch die dynamischen Aspekte molekularer Erkennungsprozesse aufzuklären. Dieser umfassende Ansatz verbessert unser Verständnis der Glykan-Protein-Wechselwirkungen und trägt dazu bei, die Forschung auf dem Gebiet der chemischen Glykobiologie voranzutreiben.
Introduction
Die molekulare Erkennung von Glykanen ist für viele Prozesse im Zusammenhang mit Gesundheit und Krankheit unerlässlich. Die Spezifität und Selektivität biologischer Rezeptoren (Lektine, Antikörper, Enzyme) für Glykane hängt stark davon ab, wie das prekäre Gleichgewicht zwischen den verschiedenen Komponenten der Enthalpie (CH-π und van der Waals, Wasserstoffbrückenbindungen, Elektrostatik) und der Entropie (Hydrophobie, Dynamik, Solvatations-Desolvatation)1 eingestellt wird.
Angesichts der großen chemischen Vielfalt und dynamischen Natur von Glykanen werden NMR-Methoden seit mehr als 25 Jahren in großem Umfang eingesetzt, um Glykanwechselwirkungenzu analysieren 2, da diese Methoden hervorragende Informationen über molekulare Erkennungsereignisse mit präzisen Details bei atomarer Auflösung 3,4 liefern, selbst wenn die erforderlichen Wechselwirkungsnachweise nicht mit anderen Methoden abgerufen werden können. Ein wichtiger Punkt ist, dass die NMR vielseitig ist und die Untersuchung dynamischer Ereignisse auf atomarer Ebene auf verschiedenen Zeitskalen ermöglicht, was bei weitem die beste Technik für die Untersuchung der Struktur, Konformation und Dynamik von Glykanen in Lösung darstellt. Nichtsdestotrotz kann die Entflechtung dieser Informationen ein recht komplexer Prozess sein, der den Einsatz klar definierter Strategien in Verbindung mit einer sorgfältigen Datenanalyse erfordert5.
NMR-Techniken sind vielfältig und in der Tat gibt es viele Methoden, die eingesetzt werden können, um Glykan-Protein-Wechselwirkungen zu entschlüsseln6. Wir beschreiben hier zwei grundlegende NMR-Ansätze, die derzeit zur Entschlüsselung von Glykan-Rezeptor-Wechselwirkungen eingesetzt werden 7,8, wobei der Schwerpunkt darauf liegt, wie die Darstellung des Schlüssel-Glykan-Epitops sowie der Proteinbindungsstelle 9 entwirrt werdenkann.
Bei jedem molekularen Erkennungsereignis, wenn ein Rezeptor an einen gegebenen Liganden bindet, findet ein chemischer Austauschprozess statt, der viele NMR-Parameter der an der Bindung beteiligten Teilnehmer beeinflusst10. Aus der NMR-Perspektive kann die Interaktion daher entweder aus der Sicht des Glykanliganden oder aus der des Proteinrezeptors11 überwacht werden. Im Allgemeinen handelt es sich bei dem Proteinrezeptor um ein großes Biomolekül (langsame Rotationsbewegung mit Raten in der ns-Zeitskala und daher schnelle transversale Relaxation), während das interagierende Glykan als kleines bis mittelgroßes Molekül betrachtet werden kann (schnelle Rotationsbewegung mit Raten auf der ps-Zeitskala und langsame transversale Relaxation)12. Aus der Standardperspektive sind die NMR-Signale des Glykans schmal, während die des Rezeptors breit sind13.
Ligandenbasierte NMR-Methoden beruhen auf der dramatischen Veränderung, die viele Glykan-NMR-Parameter beim Übergang vom freien in den gebundenen Zustanderfahren 14. STD-NMR ist die am häufigsten eingesetzte experimentelle NMR-Technik zur Bewertung verschiedener Glykanbindungsmerkmale15, von der Ableitung des Vorhandenseins einer Bindung im Lösungszustand bis zur Bestimmung des Glykanbindungshetops; das heißt, die Atome des Liganden, die mit dem Proteinrezeptor16 in Kontakt stehen.
Alternativ dazu überwachen rezeptorbasierte NMR-Methoden die Veränderungen, die in den Signalen des Proteinrezeptors in Gegenwart des Glykans im Vergleich zu den für den Apo-Zustand17 aufgezeichneten Veränderungen stattfinden. Diese konzentrieren sich hauptsächlich auf das Screening der chemischen Verschiebungsstörungen der Proteinsignale zwischen beiden Zuständen. Das am häufigsten verwendete Experiment ist 1 H-15N HSQC oder seine TROSY-Alternativen18.
Die Kombination beider Ansätze ermöglicht die Anwendung der NMR auf viele verschiedene Systeme, die ein breites Spektrum an Affinitäten aufweisen. Für die rezeptorbasierten NMR-Methoden muss jedoch im Gegensatz zu denen, die auf dem Liganden basieren, eine relativ große Menge an löslichem, nicht aggregiertem, stabilisotopenmarkiertem (15N) Protein zur Verfügung stehen.
Im Folgenden beschreiben wir beide Methoden und heben ihre Stärken und Schwächen hervor. Beachten Sie, dass die im Protokoll beschriebenen grundlegenden Schritte als Beispiele für die Verwendung von Bruker-Spektrometern dienen. Folglich stimmen die Namen von Befehlen und Parametern mit denen überein, die in TopSpin (der Spektrometersteuerungssoftware von Bruker) verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die NMR (STD-NMR) hat sich zur am häufigsten verwendeten und vielseitigsten NMR-Methode zur Untersuchung von Liganden-Protein-Wechselwirkungen entwickelt. Wie oben gezeigt, beruht es auf dem Phänomen des Sättigungstransfers, und der Versuchsaufbau beinhaltet die Aufnahme von zwei eindimensionalen (1D) 1H-Spektren: dem On-Resonanz- und dem Off-Resonanz-Spektro. Während des On-Resonanz-Experiments wird die Sättigung spezifischer Protonen des Proteins erreicht, indem eine Reihe von Radiofrequenzpulsen mit geringer Leistung während eines bestimmten Zeitraums angewendet wird (die Sättigungszeit liegt typischerweise zwischen 1 und 3 s). Um eine direkte Sättigung des Liganden zu vermeiden, sind die Frequenz und Länge der Sättigungspulse für die selektive Bestrahlung spezifischer Protonen des Proteins optimiert; d.h. sie müssen mit einer Frequenz angewendet werden, die frei von allen Ligandensignalen ist, und mit einer angemessenen Länge (Abbildung 1). Als Faustregel für 50 ms Sättigungspulse gilt, dass 1 ppm Differenz zwischen dem Sättigungsbereich und den nächstgelegenen Ligandensignalen eingehalten werden sollte. Im Allgemeinen führen selektive Sättigungsimpulse, die auf die aliphatische Region des Proteins angewendet werden, zu erhöhten Sättigungseffekten. Alternativ können auch aromatische Protonen (6-7 ppm) bestrahlt werden, wenn das Ligandenmolekül keine aromatischen Signale enthält. Dies ist sehr nützlich für natürlich vorkommende Glykane, da sie keine aromatischen Gruppen tragen. Sobald eine bestimmte Region des Proteins selektiv bestrahlt wird, breitet sich die Sättigung entlang des Proteins durch dipolare 1 H-1 H-Kreuzrelaxation(Spindiffusion) aus. Schließlich erreicht die Sättigung die Proteinprotonen an der Bindungsstelle, die dann über intermolekulare 1 H-1H NOEs auf die Zuckerprotonen übertragen wird, die in engem Kontakt (r < 5 Å) mit dem Rezeptor stehen. Offensichtlich nimmt die Intensität der Signale der gesättigten Liganden Protonen ab. Nach Erhalt der Sättigung dissoziieren die transient gebundenen Liganden aufgrund der Bindungskinetik (ein schneller Austausch ist erforderlich) und die Sättigungsinformation wird im freien Zustand akkumuliert. Aufgrund dieses Prozesses weisen die NMR-On-Resonanz-Spektren verminderte Signale auf (Abbildung 2).
Um diese Intensitätsstörung der 1-H-Kerne eines bindenden Glykans eindeutig darzustellen, wird ein Kontrollprotonen-NMR-Spektrum (Off-Resonanz) aufgenommen, bei dem die Sättigung weit entfernt von jedem Rezeptor- oder Kohlenhydratsignal (normalerweise zwischen 40-100 ppm) unter den gleichen Bedingungen angelegt wird. Das subtrahierte 1D-Spektrum zwischen der Off-Resonanz und der On-Resonanz zeigt ausschließlich die Signale der 1H-Kerne des Liganden, die modifizierte Intensitäten aufweisen: diejenigen, die nahe genug an der Rezeptorbindungsstelle waren, um die Magnetisierung zu empfangen (Abbildung 2).
Dennoch erhalten nicht alle 1H-Kerne des gebundenen Kohlenhydrats die gleiche Sättigung. Theoretisch ist der Magnetisierungstransfer vom Rezeptor zum gebundenen Liganden abstandsabhängig (1/r6). Dies bedeutet, dass die Intensitäten der übertragenen Sättigung zwischen den Glykan-1H-Kernen Informationen über die räumlichen Abstände zwischen den Protonen des Liganden und denen des Rezeptors enthalten, und die STD-NMR-Intensitäten für diejenigen Protonen, die näher am Rezeptor liegen, größer sind. Dementsprechend ermöglicht das STD-NMR-Experiment auch die Bestimmung des Bindungsepitops des Kohlenhydrats (Abbildung 2 und Abbildung 3), da Protonen des Liganden, die näher an der Proteinoberfläche sitzen, höhere Intensitäten aufweisen als solche, die nicht direkt an der Bindung beteiligt sind.
Das Experiment kann auf Systeme mit schwacher bis mittlerer Affinität angewendet werden, selten auf Systeme mit starken Affinitäten im niedrigen μM- oder nM-Bereich. In der Tat erfordert es, dass die Dissoziationsrate in der Entspannungszeitskala schnell ist. Andernfalls geht die Information des Sättigungstransfers durch Relaxation verloren, bevor der Ligand dissoziiert.
Auf der anderen Seite sind proteinbasierte NMR-Experimente einzigartig, um die Liganden-Protein-Interaktion mit Genauigkeit auf Aminosäureebene zu entschlüsseln, ohne die Strukturen der atomaren Auflösung zu lösen. Es untersucht molekulare Erkennungsphänomene direkt in Lösung, ohne dass eine Kokristallisation erforderlich ist. Das CSP-Analyse-Mapping ist außergewöhnlich leistungsfähig für die Entdeckung von Liganden und die Kartierung der Proteinbindungsstelle (Abbildung 4 und Abbildung 5). Diese Methode ist auf jeden Bereich von Affinitäten zwischen dem mM- und dem nM-Bereich anwendbar, selbst für Systeme, bei denen der Austauschkurs in der Zeitskala der chemischen Verschiebung21 langsam ist.
Nichtsdestotrotz wird dieser Ansatz bei Proteinen mit Molekulargewichten über 30-40 kDa aufgrund von Relaxationsproblemen wahrscheinlich nicht funktionieren. Anschließend kann die TROSY-Alternative18 verwendet werden, die in Verbindung mit der Proteindeuterierung besonders leistungsfähig ist. Darüber hinaus sollte das Protein einheitlich mit 15N markiert werden (und eine weitere Probe mit 13C und 15N doppelt markiert werden, um die erforderliche Rückgratzuordnung abschließen zu können). Daher sollten die Proteinexpressionsbedingungen, einschließlich des entsprechenden Expressionssystems, optimiert werden, um Milligrammmengen an Protein erhalten zu können. Proteine, die eine Tendenz zur Oligomerisierung oder Aggregation aufweisen, sind für diese Analyse ebenfalls nicht geeignet. Das hierin verwendete Instrument zur Aufzeichnung der NMR-Daten ist ein Bruker 800 MHz Spektrometer, das mit einer TCI-Kryosonde ausgestattet ist. Es wäre eine große Herausforderung, diese Methode mit Instrumenten unter 600 MHz oder ohne kryogene Sonde anzuwenden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der spanischen Agencia Estatal de Investigación für die Akkreditierung des Severo Ochoa Center of Excellence CEX2021-001136-S, finanziert von MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, und CIBERES, einer Initiative des Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, Madrid, Spanien). Wir danken auch der Europäischen Kommission für das Projekt GLYCOTWINNING.
Materials
| 5 mm Shigemi microtube set mat | CortecNet SAS | S30BMS-005B | |
| Alpha-Lactose-Agarose | Sigma-Aldrich Química S.L. | 7634-5ML | |
| Ammonium chloride (15 N, 99%) | LC-0179-N-50G | Tracer Tecnologías Analíticas S.L | |
| Ampicillin (Sodium Salt) | Melford Laboratories LTD | A40040 | |
| BIOVIA Discovery studio | BIOVIA, Dassault Systèmes | ||
| BL21(DE3) Chemically Competent Cells | Merck Life Science, S.L.U. | CMC0014-40X40UL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-22R | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-1000 | |
| Incubator | Eppendorf | Innova 42 | |
| IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside) | VWR International Eurolab S.L. | VW437144N | |
| LacNAc | Elicityl | GLY008 | |
| Luria Bertani (LB) Broth | Merck Life Science, S.L.U. | 3397-1KG | |
| Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC | VWR International Eurolab S.L. | 214-1137 | |
| PBS 10x | Bio-Rad | 1610780 | |
| PyMOL | PyMOL Molecular Graphics System | Version 2.0 Schrödinger | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | VC 505 | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 600 MHz AVANCE III | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 800 MHz AVANCE III |
References
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