فك تشابك تفاعلات بروتين الجليكان: الرنين المغناطيسي النووي (NMR) للإنقاذ
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا يوضح بالتفصيل اكتساب ومعالجة وتحليل سلسلة من تجارب الرنين المغناطيسي النووي التي تهدف إلى توصيف تفاعلات البروتين والجليكان في المحلول. تم تحديد المنهجيات الأكثر شيوعا القائمة على الليجند والبروتين ، والتي تساهم بلا شك في مجالات علم الأحياء السكري الهيكلي ودراسات التعرف الجزيئي.
Abstract
تفاعلات الجليكان مع البروتينات تعدل العديد من الأحداث المتعلقة بالصحة والمرض. في الواقع ، يرتبط إنشاء أحداث التعرف هذه وعواقبها البيولوجية ارتباطا وثيقا بالهياكل ثلاثية الأبعاد لكلا الشريكين ، وكذلك بخصائصها الديناميكية وعرضها على مقصورات الخلايا المقابلة. تعتبر تقنيات الرنين المغناطيسي النووي فريدة من نوعها لفصل هذه الخصائص ، وفي الواقع ، تم تطوير منهجيات متنوعة قائمة على الرنين المغناطيسي النووي وتطبيقها لمراقبة أحداث ارتباط الجليكان مع المستقبلات المرتبطة بها. يحدد هذا البروتوكول إجراءات الحصول على اثنتين من أقوى منهجيات الرنين المغناطيسي النووي المستخدمة في مجال البيولوجيا السكرية بالرنين المغناطيسي النووي ومعالجتها وتحليلها ، 1H-Saturation Transfer Difference (STD) و 1H ، 15N-Heterocore أحادي التماسك الكمي (HSQC) تجارب المعايرة ، والتي تقدم معلومات مكملة من منظور الجليكان والبروتين ، على التوالي. في الواقع ، عند دمجها ، فإنها توفر مجموعة أدوات قوية لتوضيح الجوانب الهيكلية والديناميكية لعمليات التعرف الجزيئي. يعزز هذا النهج الشامل فهمنا لتفاعلات البروتين الغليكان ويساهم في تطوير البحث في مجال علم الأحياء السكرية الكيميائي.
Introduction
يعد التعرف الجزيئي على الجليكان أمرا ضروريا للعديد من العمليات المتعلقة بالصحة والمرض. تعتمد خصوصية وانتقائية المستقبلات البيولوجية (المحاضرات والأجسام المضادة والإنزيمات) للجليكان بشكل كبير على ضبط التوازن غير المستقر بين المكونات المتنوعة للمحتوى الحراري (CH-π و van der Waals ، روابط الهيدروجين ، الكهرباء الساكنة) والانتروبيا (الكارهة للماء ، الديناميات ، الذوبان الذوبان)1.
نظرا للتنوع الكيميائي الكبير والطبيعة الديناميكية للجليكان ، فقد تم استخدام طرق الرنين المغناطيسي النووي على نطاق واسع لتشريح تفاعلات الجليكان لأكثر من 25 عاما2 ، نظرا لأن هذه المنهجيات توفر معلومات رائعة عن أحداث التعرف الجزيئي بتفاصيل دقيقة ، بدقةذرية 3,4 ، حتى عندما لا يمكن استرداد دليل التفاعل المطلوب باستخدام منهجيات أخرى. كنقطة أساسية ، فإن الرنين المغناطيسي النووي متعدد الاستخدامات ويسمح بدراسة الأحداث الديناميكية ، على المستوى الذري ، على نطاقات زمنية مختلفة ، مما يشكل أفضل تقنية حتى الآن لدراسة بنية وتشكيل وديناميكيات الجليكان في المحلول. ومع ذلك ، قد يكون فك تشابك هذه المعلومات عملية معقدة إلى حد ما تتطلب استخدام استراتيجيات محددة جيدا جنبا إلى جنب مع تحليل دقيق للبيانات5.
تقنيات الرنين المغناطيسي النووي متنوعة ، وفي الواقع ، هناك العديد من المنهجيات التي يمكن استخدامها لكشف تفاعلات البروتين الغليكان6. نصف هنا نهجين أساسيين للرنين المغناطيسي النووي يستخدمان حاليا لفك تشفير تفاعلات مستقبلات الجليكان 7,8 ، مع التركيز على كيفية فك تشابك عرض حاتمة الجليكان الرئيسية بالإضافة إلى موقع ربط البروتين9.
في أي حدث التعرف الجزيئي ، عندما يرتبط مستقبل برابط معين ، هناك عملية تبادل كيميائي تؤثر على العديد من معلمات الرنين المغناطيسي النووي للمشاركين في الارتباط10. لذلك ، من منظور الرنين المغناطيسي النووي ، يمكن مراقبة التفاعل إما من وجهة نظر ليجند الجليكان أو من وجهة نظر مستقبل البروتين11. بشكل عام ، مستقبل البروتين هو جزيء حيوي كبير (حركة دورانية بطيئة ، مع معدلات في المقياس الزمني ns ، وبالتالي ، استرخاء عرضي سريع) ، في حين يمكن اعتبار الجليكان المتفاعل جزيئا صغيرا ومتوسط الحجم (حركة دورانية سريعة ، مع معدلات في المقياس الزمني ps ، والاسترخاء المستعرض البطيء)12. من منظور قياسي ، تكون إشارات الرنين المغناطيسي النووي للجليكان ضيقة ، في حين أن إشارات المستقبل واسعة13.
تعتمد طرق الرنين المغناطيسي النووي القائمة على الليجند على التغيير الدراماتيكي الذي تتعرض له العديد من معلمات الرنين المغناطيسي النووي الجليكان عند الانتقال من الحالة الحرة إلى الحالةالمقيدة 14. STD-NMR هي تقنية الرنين المغناطيسي النووي التجريبية الأكثر استخداما لتقييم ميزات ربط الجليكان المتنوعة15 ، من استنتاج وجود الارتباط في حالة المحلول إلى تحديد حاتم ربط الجليكان. أي ذرات الرباط التي تتلامس مع مستقبلات البروتين16.
بدلا من ذلك ، تراقب طرق الرنين المغناطيسي النووي القائمة على المستقبلات التغييرات التي تحدث في إشارات مستقبلات البروتين في وجود الجليكان فيما يتعلق بتلك المسجلة لحالة apo17. تركز هذه بشكل أساسي على فحص اضطرابات التحول الكيميائي لإشارات البروتين بين الحالتين. التجربة الأكثر استخداما هي 1 H-15N HSQC ، أو بدائلها TROSY18.
يسمح الجمع بين كلا النهجين بتطبيق الرنين المغناطيسي النووي على العديد من الأنظمة المتنوعة التي تعرض مجموعة واسعة من التقاربات. ومع ذلك ، بالنسبة لطرق الرنين المغناطيسي النووي القائمة على المستقبلات ، على عكس تلك القائمة على الرباط ، يجب أن تتوفر كمية كبيرة نسبيا من البروتين القابل للذوبان وغير المجمع والمستقر الموسوم بالنظائر (15N).
نصف هنا كلتا الطريقتين ، ونسلط الضوء على نقاط القوة والضعف لديهما. لاحظ أن الخطوات الأساسية الموضحة في البروتوكول تعمل كأمثلة لاستخدام مطياف بروكر. وبالتالي ، تتوافق أسماء الأوامر والمعلمات مع تلك المستخدمة في TopSpin (برنامج التحكم في مطياف Bruker).
Protocol
Representative Results
Discussion
أصبح فرق نقل التشبع NMR (STD-NMR) أكثر طرق الرنين المغناطيسي النووي استخداما وتنوعا لدراسة تفاعلات بروتين الليجند. كما هو موضح أعلاه ، فإنه يعتمد على ظاهرة نقل التشبع ، ويتضمن الإعداد التجريبي الحصول على اثنين من الأطياف أحادية البعد (1D) 1H: أطياف الرنين ¬ و ¬ خارج الرنين. أثناء تجربة الرنين ، يتم تحقيق تشبع بروتونات معينة من البروتين عن طريق تطبيق قطار من نبضات الترددات الراديوية منخفضة الطاقة خلال فترة معينة (يتراوح وقت التشبع عادة من 1-3 ثوان). لتجنب التشبع المباشر لليجند ، يتم تحسين تواتر وطول نبضات التشبع لتشعيع بروتونات معينة من البروتين بشكل انتقائي ؛ أي أنه يجب تطبيقها على تردد شاغر لأي إشارات ليجند وبطول مناسب (الشكل 1). كقاعدة عامة لنبضات تشبع 50 مللي ثانية ، يجب الحفاظ على فرق 1 جزء في المليون من منطقة التشبع إلى أقرب إشارات اليجند. بشكل عام ، توفر نبضات التشبع الانتقائية المطبقة على المنطقة الأليفاتية للبروتين تأثيرات تشبع متزايدة. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا تشعيع البروتونات العطرية (6-7 جزء في المليون) إذا كان جزيء الربيطة لا يحتوي على أي إشارات عطرية. هذا مفيد جدا للجليكان الذي يحدث بشكل طبيعي ، لأنها لا تحمل مجموعات عطرية. بمجرد تشعيع منطقة معينة من البروتين بشكل انتقائي ، ينتشر التشبع على طول البروتين عبر الاسترخاء المتقاطع ثنائي القطب 1 H-1 H-1H (انتشار الدوران). في النهاية ، يصل التشبع إلى بروتونات البروتين في موقع الارتباط ، والذي يتم نقله بعد ذلك إلى بروتونات السكر التي تكون على اتصال وثيق (r < 5 Å) مع المستقبل عبر 1 H-1 H-1H NOEs بين الجزيئات. من الواضح أن شدة إشارات بروتونات الليجند المشبعة تتناقص. بعد تلقي التشبع ، بسبب حركية الربط ، تنفصل الروابط المرتبطة بشكل عابر (التبادل السريع مطلوب) وتتراكم معلومات التشبع في الحالة الحرة. بسبب هذه العملية ، تقدم أطياف الرنين المغناطيسي النووي إشارات متناقصة (الشكل 2).
لإظهار هذا الاضطراب الشديد بوضوح لنوى 1H من جليكان ملزم ، يتم الحصول على طيف التحكم في البروتون NMR (خارج الرنين) حيث يتم تطبيق التشبع بعيدا عن أي مستقبلات أو إشارة كربوهيدرات (عادة بين 40-100 جزء في المليون) ، في ظل نفس الظروف. يظهر الطيف 1D المطروح بين الرنين والرنين حصريا إشارات نوى 1H من الربيطة التي عدلت شدتها: تلك التي كانت قريبة بما يكفي من موقع ربط المستقبلات لتلقي المغنطة (الشكل 2).
ومع ذلك ، لا تتلقى جميع نوى 1H من الكربوهيدرات المرتبطة نفس الكمية من التشبع. من الناحية النظرية ، يعتمد نقل المغنطة من المستقبل إلى الربيطة المرتبطة على المسافة (1 / r6). هذا يعني أن شدة التشبع المنقول بين نوى الجليكان 1H تحتوي على معلومات حول القرب المكاني بين بروتونات الربيطة وبروتونات المستقبل ، وشدة الرنين المغناطيسي النووي STD أكبر لتلك البروتونات الأقرب إلى المستقبل. وفقا لذلك ، تسمح تجربة الرنين المغناطيسي النووي STD أيضا بتحديد حاتمة الربط للكربوهيدرات (الشكل 2 والشكل 3) لأن بروتونات الرباط التي تجلس بالقرب من سطح البروتين تظهر كثافة أعلى من تلك التي لا تشارك مباشرة في الربط.
يمكن تطبيق التجربة على الأنظمة ذات التقارب الضعيف المتوسط ، ونادرا ما يتم تطبيقها على الأنظمة ذات الصلات القوية في النطاق المنخفض μM أو nM. في الواقع ، يتطلب أن يكون معدل التفكك سريعا في مقياس وقت الاسترخاء. خلاف ذلك ، يتم فقدان معلومات نقل التشبع من خلال الاسترخاء قبل أن ينفصل الرباط.
من ناحية أخرى ، تعد تجارب الرنين المغناطيسي النووي القائمة على البروتين فريدة من نوعها لكشف تفاعل بروتين الليجند بدقة مستوى الأحماض الأمينية دون حل هياكل الدقة الذرية. يفحص مباشرة ظواهر التعرف الجزيئي في المحلول دون الحاجة إلى التبلور المشترك. يعد رسم خرائط تحليل الطاقة الشمسية المركزة قويا بشكل استثنائي لاكتشاف الروابط ورسم خرائط موقع ارتباط البروتين (الشكل 4 والشكل 5). تنطبق هذه الطريقة على أي نطاق من الصلات بين نطاق mM و nM ، حتى بالنسبة للأنظمة التي يكون فيها سعر الصرف بطيئا في مقياس وقت التحول الكيميائي21.
ومع ذلك ، من المحتمل ألا يعمل هذا النهج مع البروتينات ذات الأوزان الجزيئية التي تزيد عن 30-40 كيلو دالتون بسبب مشاكل الاسترخاء. يمكن بعد ذلك استخدام بديل TROSY18 ، حيث يكون قويا بشكل خاص عندما يقترن بتثنية البروتين. علاوة على ذلك ، يجب تسمية البروتين بشكل موحد ب 15N (وعينة أخرى تحمل علامة مزدوجة ب 13C و 15N لتتمكن من إكمال تعيين العمود الفقري المطلوب). لذلك ، يجب تحسين ظروف التعبير عن البروتين ، بما في ذلك نظام التعبير المقابل لتتمكن من الحصول على كميات ملليغرام من البروتين. البروتينات التي تظهر ميلا إلى قلة القلة، أو التجميع، ليست مناسبة أيضا لهذا التحليل. الأداة المستخدمة هنا لتسجيل بيانات الرنين المغناطيسي النووي هي مطياف Bruker 800 MHz مجهز بمسبار تبريد TCI. سيكون من الصعب للغاية استخدام هذه المنهجية باستخدام أدوات أقل من MHz 600 أو بدون مسبار مبرد.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الوكالة الحكومية للبحوث في إسبانيا على اعتماد مركز سيفيرو أوتشوا للتميز CEX2021-001136-S ، بتمويل من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 ، و CIBERES ، وهي مبادرة من معهد الصحة كارلوس الثالث (ISCIII ، مدريد ، إسبانيا). كما نشكر المفوضية الأوروبية على مشروع GLYCOTWINNING .
Materials
| 5 mm Shigemi microtube set mat | CortecNet SAS | S30BMS-005B | |
| Alpha-Lactose-Agarose | Sigma-Aldrich Química S.L. | 7634-5ML | |
| Ammonium chloride (15 N, 99%) | LC-0179-N-50G | Tracer Tecnologías Analíticas S.L | |
| Ampicillin (Sodium Salt) | Melford Laboratories LTD | A40040 | |
| BIOVIA Discovery studio | BIOVIA, Dassault Systèmes | ||
| BL21(DE3) Chemically Competent Cells | Merck Life Science, S.L.U. | CMC0014-40X40UL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-22R | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-1000 | |
| Incubator | Eppendorf | Innova 42 | |
| IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside) | VWR International Eurolab S.L. | VW437144N | |
| LacNAc | Elicityl | GLY008 | |
| Luria Bertani (LB) Broth | Merck Life Science, S.L.U. | 3397-1KG | |
| Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC | VWR International Eurolab S.L. | 214-1137 | |
| PBS 10x | Bio-Rad | 1610780 | |
| PyMOL | PyMOL Molecular Graphics System | Version 2.0 Schrödinger | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | VC 505 | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 600 MHz AVANCE III | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 800 MHz AVANCE III |
References
- Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
- Poveda, A., Jimenez-Barbero, J. NMR studies of carbohydrate-protein interactions in solution. Chem Soc Rev. 27, 133-144 (1998).
- Kogelberg, H., Solís, D., Jiménez-Barbero, J. New structural insights into carbohydrate-protein interactions from NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 13 (5), 646-653 (2003).
- Widmalm, G. Glycan shape, motions, and interactions explored by NMR spectroscopy. JACS Au. 4 (1), 20-39 (2024).
- Marchetti, R., et al. 34;Rules of Engagement" of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling. ChemistryOpen. 5 (4), 274-296 (2016).
- Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. The recognition of glycans by protein receptors. Insights from NMR spectroscopy. Chem Commun. 54 (38), 4761-4769 (2018).
- Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Glycan structures and their interactions with proteins. A NMR view. Curr Opin Struct Biol. 62, 22-30 (2020).
- Cañada, F. J., et al. Conformational and structural characterization of carbohydrates and their interactions studied by NMR. Curr Med Chem. 29 (7), 1147-1172 (2022).
- Valverde, P., Quintana, J. I., Santos, J. I., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Novel NMR avenues to explore the conformation and interactions of glycans. ACS Omega. 4, 13618-13630 (2019).
- Jiménez-Barbero, J., Asensio, J. L., Cañada, F. J., Poveda, A. Free and protein-bound carbohydrate structures. Curr Opin Struct Biol. 9 (5), 549-555 (1999).
- Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR. Chem Soc Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).
- Roldós, V., Cañada, F. J., Jiménez-Barbero, J. Carbohydrate-protein interactions: a 3D view by NMR. Chembiochem. 12 (7), 990-1005 (2011).
- Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J., Millet, O. NMR of glycoproteins: profiling, structure, conformation, and interactions. Curr Opin Struct Biol. 68, 9-17 (2021).
- del Carmen Fernández-Alonso, M., Díaz, D., Berbis, M. A., Marcelo, F., Cañada, J., Jiménez-Barbero, J. Protein-carbohydrate interactions studied by NMR: from molecular recognition to drug design. Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 816-830 (2012).
- Angulo, J., Nieto, P. M. STD-NMR: application to transient interactions between biomolecules-a quantitative approach. Eur Biophys J. 40 (12), 1357-1369 (2012).
- Mayer, M., Meyer, B. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor. J Am Chem Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).
- Williamson, M. P. Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 73, 1-16 (2013).
- Fernández, C., Adeishvili, K., Wüthrich, K. Transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy with the outer membrane protein OmpX in dihexanoyl phosphatidylcholine micelles. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2358-2363 (2001).
- Yee, A., Gutmanas, A., Arrowsmith, C. H. Solution NMR in structural genomics. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 611-617 (2006).
- Skinner, S. P., Fogh, R. H., Boucher, W., Ragan, T. J., Mureddu, L. G., Vuister, G. W. CCPNMR AnalysisAssign: a flexible platform for integrated NMR analysis. J Biomol NMR. 66 (2), 111-124 (2016).
- Gimeno, A., et al. Minimizing the entropy penalty for ligand binding: Lessons from the molecular recognition of the histo blood-group antigens by human Galectin-3. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (22), 7268-7272 (2019).
