Desembaraçando as interações glicano-proteína: ressonância magnética nuclear (RMN) para o resgate
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo detalhando a aquisição, processamento e análise de uma série de experimentos de RMN destinados a caracterizar as interações proteína-glicano em solução. As metodologias mais comuns baseadas em ligantes e proteínas são descritas, o que, sem dúvida, contribui para os campos da glicobiologia estrutural e estudos de reconhecimento molecular.
Abstract
As interações dos glicanos com as proteínas modulam muitos eventos relacionados à saúde e à doença. De fato, o estabelecimento desses eventos de reconhecimento e suas consequências biológicas estão intimamente relacionados às estruturas tridimensionais de ambos os parceiros, bem como às suas características dinâmicas e sua apresentação nos compartimentos celulares correspondentes. As técnicas de RMN são únicas para desvendar essas características e, de fato, diversas metodologias baseadas em RMN foram desenvolvidas e aplicadas para monitorar os eventos de ligação dos glicanos com seus receptores associados. Este protocolo descreve os procedimentos para adquirir, processar e analisar duas das mais poderosas metodologias de RMN empregadas no campo da RMN-glicobiologia, experimentos de titulação de 1 diferença de transferência de saturação (STD) de 1H-saturação e 1 H,15N-Heteronuclear de coerência quântica única (HSQC), que oferecem complementarmente informações do ponto de vista do glicano e da proteína, respectivamente. De fato, quando combinados, eles oferecem um poderoso kit de ferramentas para elucidar os aspectos estruturais e dinâmicos dos processos de reconhecimento molecular. Essa abordagem abrangente aprimora nossa compreensão das interações glicano-proteína e contribui para o avanço da pesquisa no campo da glicobiologia química.
Introduction
O reconhecimento molecular de glicanos é essencial para muitos processos relacionados à saúde e à doença. A especificidade e a seletividade dos receptores biológicos (lectinas, anticorpos, enzimas) para glicanos dependem fortemente do ajuste do equilíbrio precário entre os diversos componentes da entalpia (CH-π e van der Waals, ligações de hidrogênio, eletrostática) e entropia (hidrofobicidade, dinâmica, solvatação-dessolvatação)1.
Dada a grande diversidade química e natureza dinâmica dos glicanos, os métodos de RMN têm sido amplamente empregados para dissecar as interações dos glicanos há mais de 25 anos2, uma vez que essas metodologias fornecem informações excelentes sobre eventos de reconhecimento molecular com detalhes precisos, em resolução atômica 3,4, mesmo quando as evidências de interação necessárias não podem ser recuperadas empregando outras metodologias. Como ponto chave, a RMN é versátil e permite estudar eventos dinâmicos, em nível atômico, em diferentes escalas de tempo, constituindo de longe a melhor técnica para estudar a estrutura, conformação e dinâmica de glicanos em solução. No entanto, desembaraçar essas informações pode ser um processo bastante complexo que requer o emprego de estratégias bem definidas e uma análise cuidadosa dos dados5.
As técnicas de RMN são diversas e, de fato, existem muitas metodologias que podem ser empregadas para desvendar as interações glicano-proteína6. Descrevemos aqui duas abordagens básicas de RMN que são atualmente empregadas para decifrar as interações glicano-receptor 7,8, enfatizando como desvendar a apresentação do epítopo chave do glicano, bem como o local de ligação à proteína9.
Em qualquer evento de reconhecimento molecular, quando um receptor se liga a um determinado ligante, há um processo de troca química que afeta muitos parâmetros de RMN dos participantes na ligação10. Portanto, do ponto de vista da RMN, a interação pode ser monitorada tanto do ponto de vista do ligante glicano quanto do receptor proteico11. De modo geral, o receptor proteico é uma grande biomolécula (movimento rotacional lento, com taxas na escala de tempo ns e, portanto, relaxamento transversal rápido), enquanto o glicano em interação pode ser considerado como uma molécula de tamanho pequeno-médio (movimento rotacional rápido, com taxas na escala de tempo ps e relaxamento transversal lento)12. De uma perspectiva padrão, os sinais de RMN do glicano são estreitos, enquanto os do receptor são amplos13.
Os métodos de RMN baseados em ligantes dependem da mudança dramática que muitos parâmetros de RMN de glicanos experimentam ao passar do estado livre para o estado ligado14. A RNM-STD é a técnica experimental de RMN mais empregada para avaliar diversas características de ligação ao glicano15, desde a dedução da existência de ligação no estado de solução até a determinação do epítopo de ligação do glicano; ou seja, os átomos do ligante que estão em contato com o receptor de proteína16.
Alternativamente, os métodos de RMN baseados em receptores monitoram as mudanças que ocorrem nos sinais do receptor de proteína na presença do glicano em relação aos registrados para o estado apo17. Estes são focados principalmente na triagem das perturbações de deslocamento químico dos sinais de proteína entre os dois estados. O experimento mais comumente empregado é o 1 H-15N HSQC, ou suas alternativas TROSY18.
A combinação de ambas as abordagens permite aplicar a RMN a diversos sistemas que exibem uma ampla gama de afinidades. No entanto, para os métodos de RMN baseados em receptores, em contraste com aqueles baseados no ligante, uma quantidade relativamente grande de proteína solúvel, não agregada e marcada com isótopos estáveis (15N) deve estar disponível.
Descrevemos aqui os dois métodos, destacando seus pontos fortes e fracos. Observe que as etapas básicas descritas no protocolo servem como exemplos para o uso de espectrômetros Bruker. Consequentemente, os nomes dos comandos e parâmetros se alinham com os utilizados no TopSpin (software de controle de espectrômetros da Bruker).
Protocol
Representative Results
Discussion
A RMN por diferença de transferência de saturação (STD-RMN) tornou-se o método de RMN mais utilizado e versátil para estudar as interações ligante-proteína. Como mostrado acima, ele se baseia no fenômeno de transferência de saturação, e a configuração experimental envolve a aquisição de dois espectros unidimensionais (1D) de 1H: os espectros de ressonância e de ressonância. Durante o experimento de ressonância, a saturação de prótons específicos da proteína é alcançada pela aplicação de um trem de pulsos de radiofrequência de baixa potência durante um determinado período (o tempo de saturação normalmente varia de 1 a 3 s). Para evitar a saturação direta do ligante, a frequência e o comprimento dos pulsos de saturação são otimizados para irradiar seletivamente prótons específicos da proteína; ou seja, devem ser aplicados em uma frequência vaga de qualquer sinal de ligante e com um comprimento adequado (Figura 1). Como regra geral para pulsos de saturação de 50 ms, a diferença de 1 ppm deve ser mantida da região de saturação para os sinais de ligante mais próximos. Geralmente, pulsos de saturação seletiva aplicados na região alifática da proteína proporcionam efeitos de saturação aumentados. Alternativamente, prótons aromáticos (6-7 ppm) também podem ser irradiados se a molécula ligante não contiver nenhum sinal aromático. Isso é muito útil para glicanos naturais, pois eles não possuem grupos aromáticos. Uma vez que uma certa região da proteína é irradiada seletivamente, a saturação se propaga ao longo da proteína por meio de relaxamento cruzado dipolar 1 H-1H (difusão de spin). Eventualmente, a saturação atinge os prótons da proteína no local de ligação, que é então transferido para os prótons de açúcar que estão em contato próximo (r < 5 Å) com o receptor por meio de NOEs intermoleculares 1 H-1H. Obviamente, a intensidade dos sinais dos prótons ligantes saturados diminui. Depois de receber a saturação, devido à cinética de ligação, os ligantes transitoriamente ligados (é necessária uma troca rápida) se dissociam e as informações de saturação são acumuladas no estado livre. Devido a esse processo, os espectros de ressonância de RMN apresentam sinais diminuídos (Figura 2).
Para exibir claramente essa perturbação de intensidade dos núcleos 1H de um glicano de ligação, um espectro de RMN de prótons de controle (off-ressonância) é adquirido no qual a saturação é aplicada longe de qualquer sinal de receptor ou carboidrato (geralmente entre 40-100 ppm), sob as mesmas condições. O espectro 1D subtraído entre a off-ressonância e a on-ressonância mostra exclusivamente os sinais dos núcleos 1 H doligante que têm intensidades modificadas: aqueles que estavam próximos o suficiente do local de ligação do receptor para receber a magnetização (Figura 2).
No entanto, nem todos os núcleos 1H do carboidrato ligado recebem a mesma quantidade de saturação. Teoricamente, a transferência de magnetização do receptor para o ligante ligado depende da distância (1 / r6). Isso significa que as intensidades de saturação transferida entre os núcleos de glicano 1H contêm informações sobre as proximidades espaciais entre os prótons do ligante e os do receptor, e as intensidades de RMN de DST são maiores para os prótons que estão mais próximos do receptor. Assim, o experimento de RMN de DST também permite determinar o epítopo de ligação do carboidrato (Figura 2 e Figura 3), uma vez que os prótons do ligante mais próximos da superfície da proteína apresentam intensidades mais altas do que aqueles que não participam diretamente da ligação.
O experimento pode ser aplicado a sistemas com afinidade fraca-média, raramente a sistemas com fortes afinidades na faixa de μM ou nM baixo. Na verdade, requer que a taxa de dissociação seja rápida na escala de tempo de relaxamento. Caso contrário, a informação de transferência de saturação é perdida por relaxamento antes que o ligante se dissocie.
Por outro lado, os experimentos de RMN baseados em proteínas são exclusivos para desvendar a interação ligante-proteína com precisão do nível de aminoácidos sem resolver as estruturas de resolução atômica. Ele examina diretamente os fenômenos de reconhecimento molecular em solução sem a necessidade de co-cristalização. O mapeamento da análise CSP é excepcionalmente poderoso para descobrir ligantes e mapear o local de ligação à proteína (Figura 4 e Figura 5). Este método é aplicável a qualquer faixa de afinidades entre a faixa mM e nM, mesmo para sistemas onde a taxa de câmbio é lenta na escala de tempo de deslocamento químico21.
No entanto, essa abordagem provavelmente não funcionará para proteínas com pesos moleculares acima de 30-40 kDa devido a problemas de relaxamento. A alternativa TROSY18 pode então ser usada, sendo particularmente potente quando acoplada à deuteração de proteínas. Além disso, a proteína deve ser marcada uniformemente com 15N (e outra amostra duplamente marcada com 13C e 15N para poder completar a atribuição de backbone necessária). Portanto, as condições de expressão de proteínas, incluindo o sistema de expressão correspondente, devem ser otimizadas para poder obter quantidades de miligramas de proteína. As proteínas que apresentam tendência a oligomerizar ou agregar também não são adequadas para esta análise. O instrumento usado aqui para registrar os dados de RMN é um espectrômetro Bruker de 800 MHz equipado com uma criossonda TCI. Seria altamente desafiador usar essa metodologia usando instrumentos abaixo de 600 MHz ou sem uma sonda criogênica.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à Agência Estatal de Investigación da Espanha pela Acreditação do Centro de Excelência Severo Ochoa CEX2021-001136-S, financiada pelo MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, e CIBERES, uma iniciativa do Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, Madri, Espanha). Agradecemos também à Comissão Europeia pelo projeto GLYCOTWINNING.
Materials
| 5 mm Shigemi microtube set mat | CortecNet SAS | S30BMS-005B | |
| Alpha-Lactose-Agarose | Sigma-Aldrich Química S.L. | 7634-5ML | |
| Ammonium chloride (15 N, 99%) | LC-0179-N-50G | Tracer Tecnologías Analíticas S.L | |
| Ampicillin (Sodium Salt) | Melford Laboratories LTD | A40040 | |
| BIOVIA Discovery studio | BIOVIA, Dassault Systèmes | ||
| BL21(DE3) Chemically Competent Cells | Merck Life Science, S.L.U. | CMC0014-40X40UL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-22R | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-1000 | |
| Incubator | Eppendorf | Innova 42 | |
| IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside) | VWR International Eurolab S.L. | VW437144N | |
| LacNAc | Elicityl | GLY008 | |
| Luria Bertani (LB) Broth | Merck Life Science, S.L.U. | 3397-1KG | |
| Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC | VWR International Eurolab S.L. | 214-1137 | |
| PBS 10x | Bio-Rad | 1610780 | |
| PyMOL | PyMOL Molecular Graphics System | Version 2.0 Schrödinger | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | VC 505 | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 600 MHz AVANCE III | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 800 MHz AVANCE III |
References
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