התרת אינטראקציות גליקן-חלבון: תהודה מגנטית גרעינית (NMR) להצלה
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול המפרט רכישה, עיבוד וניתוח של סדרת ניסויי NMR שמטרתם לאפיין אינטראקציות חלבון-גליקן בתמיסה. מתוארות רוב המתודולוגיות הנפוצות המבוססות על ליגנדות וחלבונים, אשר ללא ספק תורמות לתחומי הגליקוביולוגיה המבנית ומחקרי הזיהוי המולקולרי.
Abstract
האינטראקציות של גליקנים עם חלבונים מווסתות אירועים רבים הקשורים לבריאות ומחלות. למעשה, הקמת אירועי הכרה אלה והשלכותיהם הביולוגיות קשורים קשר הדוק למבנים התלת-ממדיים של שני בני הזוג, כמו גם לתכונותיהם הדינמיות ולהצגתם על תאי התא המתאימים. טכניקות NMR הן ייחודיות להתרת מאפיינים אלה, ואכן, מתודולוגיות מגוונות מבוססות NMR פותחו ויושמו כדי לנטר את אירועי הקישור של גליקנים עם הקולטנים הקשורים אליהם. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים לרכישה, עיבוד וניתוח של שתיים ממתודולוגיות ה- NMR החזקות ביותר המשמשות בתחום הגליקוביולוגיה של NMR, 1H-Saturation Transfer Difference (STD) ו- 1 H,15N-Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) ניסויי טיטרציה, המציעים מידע משלים מנקודת המבט של גליקן וחלבון, בהתאמה. ואכן, כאשר הם משולבים הם מציעים ערכת כלים רבת עוצמה להבהרת ההיבטים המבניים והדינמיים של תהליכי זיהוי מולקולרי. גישה מקיפה זו משפרת את הבנתנו את יחסי הגומלין בין גליקן-חלבון ותורמת לקידום המחקר בתחום הגליקוביולוגיה הכימית.
Introduction
זיהוי מולקולרי של גליקנים חיוני לתהליכים רבים הקשורים לבריאות ולמחלות. הספציפיות והסלקטיביות של קולטנים ביולוגיים (לקטינים, נוגדנים, אנזימים) עבור גליקנים תלויה במידה רבה בהתאמת האיזון הרעוע בין המרכיבים השונים של אנתלפיה (CH-π ואן דר ואלס, קשרי מימן, אלקטרוסטטיקה) ואנטרופיה (הידרופוביות, דינמיקה, המסה-המסה)1.
בהתחשב במגוון הכימי הגדול ובאופי הדינמי של גליקנים, שיטות NMR נמצאות בשימוש נרחב לניתוח אינטראקציות גליקן במשך יותר מ -25 שנה2, שכן מתודולוגיות אלה מספקות מידע מעולה על אירועי זיהוי מולקולרי עם פרטים מדויקים, ברזולוציה אטומית 3,4, גם כאשר לא ניתן לאחזר את ראיות האינטראקציה הנדרשות על ידי שימוש במתודולוגיות אחרות. כנקודת מפתח, NMR הוא רב-תכליתי ומאפשר לחקור אירועים דינמיים, ברמה האטומית, בסקאלות זמן שונות, המהווים את הטכניקה הטובה ביותר ללא ספק לחקר המבנה, הקונפורמציה והדינמיקה של גליקנים בתמיסה. עם זאת, התרת מידע זה עשויה להיות תהליך מורכב למדי הדורש שימוש באסטרטגיות מוגדרות היטב יחד עם ניתוח נתונים זהיר5.
טכניקות NMR הן מגוונות, ואכן, ישנן מתודולוגיות רבות שניתן להשתמש בהן כדי לפענח אינטראקציות גליקן-חלבון6. אנו מתארים כאן שתי גישות NMR בסיסיות המשמשות כיום לפענוח אינטראקציות קולטן גליקן 7,8, תוך שימת דגש על האופן שבו ניתן להתיר את ההצגה של אפיטופ המפתח גליקן כמו גם את אתר קישור החלבונים9.
בכל אירוע זיהוי מולקולרי, כאשר קולטן נקשר לליגנד נתון, מתרחש תהליך חילופי כימיקלים המשפיע על פרמטרים רבים של NMR של המשתתפים בקישור10. לכן, מנקודת המבט של NMR, ניתן לעקוב אחר האינטראקציה מנקודת המבט של ליגנד הגליקן או מזה של קולטן החלבון11. באופן כללי, קולטן החלבון הוא ביומולקולה גדולה (תנועה סיבובית איטית, עם קצב בציר הזמן, ולכן הרפיה רוחבית מהירה), בעוד שהגליקן המקיים אינטראקציה יכול להיחשב כמולקולה בגודל קטן-בינוני (תנועה סיבובית מהירה, עם קצב בציר הזמן ps, והרפיה רוחבית איטית)12. מנקודת מבט סטנדרטית, אותות ה-NMR של הגליקן צרים, בעוד אלה של הקולטן רחבים13.
שיטות NMR מבוססות ליגנד מסתמכות על השינוי הדרמטי שחווים פרמטרים רבים של NMR גליקני בעת מעבר מהמצב החופשי למצב המוגבל14. STD-NMR היא טכניקת ה-NMR הניסיונית הנפוצה ביותר להערכת תכונות קשירת גליקן מגוונות15, החל מהסקת קיומה של קשירה במצב תמיסה ועד לקביעת אפיטופ קשירת גליקן; כלומר, האטומים של הליגנד הנמצאים במגע עם קולטן החלבון16.
לחלופין, שיטות NMR מבוססות קולטן מנטרות את השינויים המתרחשים באותות של קולטן החלבון בנוכחות הגליקן ביחס לאלה שנרשמו עבור מצב apo17. אלה מתמקדים בעיקר בסינון הפרעות השינוי הכימי של אותות החלבון בין שני המצבים. הניסוי הנפוץ ביותר הוא 1 H-15N HSQC, או חלופות TROSY18.
השילוב של שתי הגישות מאפשר יישום תמ”ג במערכות רבות ומגוונות המציגות מגוון רחב של זיקות. עם זאת, עבור שיטות NMR מבוססות קולטן, בניגוד לאלה המבוססות על ליגנד, כמות גדולה יחסית של חלבון מסיס, לא מצטבר ויציב מסומן איזוטופ (15N) חייב להיות זמין.
נתאר כאן את שתי השיטות, תוך הדגשת נקודות החוזק והחולשה שלהן. שים לב שהשלבים הבסיסיים המתוארים בפרוטוקול משמשים דוגמאות לשימוש בספקטרומטרים של Bruker. כתוצאה מכך, שמות הפקודות והפרמטרים מתיישרים עם אלה המשמשים ב- TopSpin (תוכנת בקרת הספקטרומטרים של Bruker).
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרש העברת רוויה NMR (STD-NMR) הפך לשיטת NMR הנפוצה והמגוונת ביותר לחקר אינטראקציות ליגנד-חלבון. כפי שמוצג לעיל, היא מסתמכת על תופעת העברת הרוויה, והמערך הניסויי כרוך ברכישה של שני ספקטרום חד-ממדי (1D) 1H: ספקטרום התהודה¬ וספקטרום ¬off-resonance. במהלך ניסוי התהודה, הרוויה של פרוטונים ספציפיים של החלבון מושגת על ידי הפעלת רכבת של פולסים בתדרי רדיו בהספק נמוך במהלך תקופה מסוימת (זמן הרוויה נע בדרך כלל בין 1-3 שניות). כדי למנוע רוויה ישירה של הליגנד, התדירות והאורך של פעימות הרוויה מותאמים להקרנה סלקטיבית של פרוטונים ספציפיים של החלבון; כלומר, יש ליישם אותם בתדר פנוי מכל אותות הליגנד ובאורך מתאים (איור 1). ככלל אצבע לפעימות רוויה של 50 אלפיות השנייה, יש לשמור על הפרש של 1 חל”מ מאזור הרוויה לאותות הליגנד הקרובים ביותר. בדרך כלל, פעימות רוויה סלקטיבית המיושמות על האזור האליפאטי של החלבון מספקות השפעות רוויה מוגברות. לחלופין, פרוטונים ארומטיים (6-7 ppm) יכולים להיות מוקרנים גם אם מולקולת הליגנד אינה מכילה אותות ארומטיים. זה מאוד שימושי עבור גליקנים המתרחשים באופן טבעי, כפי שהם אינם נושאים קבוצות ארומטיות. ברגע שאזור מסוים של החלבון מוקרן באופן סלקטיבי, הרוויה מתפשטת לאורך החלבון באמצעות הרפיה צולבת דיפולרית 1 H-1H (דיפוזיית ספין). בסופו של דבר, הרוויה מגיעה לפרוטוני החלבונים באתר הקשירה, אשר מועברים לאחר מכן לפרוטוני הסוכר הנמצאים במגע הדוק (r < 5 Å) עם הקולטן באמצעות אינטרמולקולרי 1 H-1H NOEs. ברור שעוצמת האותות של פרוטוני הליגנד הרווי פוחתת. לאחר קבלת הרוויה, בשל הקינטיקה המחייבת, הליגנדות הקשורות באופן ארעי (נדרש חילוף מהיר) מתנתקות ומידע הרוויה נצבר במצב החופשי. בשל התהליך הזה, ספקטרום התהודה של NMR מציג אותות מופחתים (איור 2).
כדי להציג בבירור הפרעה בעוצמה זו של גרעיני 1H של גליקן קשירה, נרכש ספקטרום NMR של פרוטון בקרה (off-resonance) שבו הרוויה מוחלת הרחק מכל קולטן או אות פחמימות (בדרך כלל בין 40-100 ppm), באותם תנאים. הספקטרום ה-1D שהוחסר בין ה-off-resonance ל-on-resonance מראה באופן בלעדי את האותות של גרעיני 1Hשל הליגנד ששינו את העוצמות: אלה שהיו קרובים מספיק לאתר הקישור של הקולטן כדי לקבל את המגנטיזציה (איור 2).
עם זאת, לא כל גרעיני 1H של פחמימה קשורה מקבלים את אותה כמות רוויה. תיאורטית, העברת המגנטיזציה מהקולטן לליגנד הכבול היא תלוית מרחק (1/r6). משמעות הדבר היא שעוצמות הרוויה המועברת בין גרעיני גליקן 1H מכילות מידע על הקרבה המרחבית בין פרוטוני הליגנד לאלה של הקולטן, ועוצמות STD NMR גדולות יותר עבור אותם פרוטונים הקרובים יותר לקולטן. בהתאם לכך, ניסוי STD NMR מאפשר גם לקבוע את אפיטופ הקישור של הפחמימה (איור 2 ואיור 3) מאחר שפרוטונים של הליגנד היושב קרוב יותר לפני השטח של החלבון מראים עוצמות גבוהות יותר מאלה שאינם משתתפים ישירות בקשירה.
הניסוי יכול להיות מיושם על מערכות עם זיקה חלשה-בינונית, לעתים רחוקות על מערכות עם זיקות חזקות בתחום μM או nM נמוך. אכן, היא דורשת שקצב הדיסוציאציה יהיה מהיר בסקאלת זמן ההרפיה. אחרת, מידע העברת הרוויה הולך לאיבוד באמצעות הרפיה לפני שהליגנד מתנתק.
מצד שני, ניסויי NMR מבוססי חלבון הם ייחודיים לפענוח אינטראקציה ליגנד-חלבון עם דיוק ברמת חומצות אמינו מבלי לפתור את מבני הרזולוציה האטומית. הוא בוחן ישירות תופעות של זיהוי מולקולרי בתמיסה ללא צורך בהתגבשות משותפת. מיפוי ניתוח CSP הוא בעל עוצמה יוצאת דופן לגילוי ליגנדות ולמיפוי אתר קשירת החלבונים (איור 4 ואיור 5). שיטה זו ישימה לכל טווח של זיקות בין תחום mM ו- nM, אפילו עבור מערכות שבהן שער החליפין איטי בסקאלת זמן השינוי הכימי21.
עם זאת, גישה זו כנראה לא תעבוד עבור חלבונים עם משקל מולקולרי מעל 30-40 kDa בשל בעיות הרפיה. לאחר מכן ניתן להשתמש בחלופה18 של TROSY, והיא חזקה במיוחד בשילוב עם דאוטרציה של חלבונים. יתר על כן, החלבון צריך להיות מסומן באופן אחיד עם 15N (ועוד מדגם כפול מסומן עם 13C ו 15N כדי להיות מסוגל להשלים את המשימה עמוד השדרה הנדרש). לכן, תנאי ביטוי החלבון, כולל מערכת הביטוי המתאימה צריכים להיות אופטימליים כדי להיות מסוגלים לקבל כמויות מיליגרם של חלבון. חלבונים המציגים נטייה לאוליגומריזציה או צבירה גם אינם מתאימים לניתוח זה. המכשיר המשמש כאן להקלטת נתוני NMR הוא ספקטרומטר Bruker 800 MHz המצויד בקריופרוב TCI. יהיה מאתגר מאוד להשתמש במתודולוגיה זו באמצעות מכשירים מתחת ל-600 מגה-הרץ או ללא בדיקה קריוגנית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Agencia Estatal de Investigación של ספרד עבור Severo Ochoa Center of Excellence Accreditation CEX2021-001136-S, במימון MCIN/AEI/10.13039/ 501100011033, ו- CIBERES, יוזמה של Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, מדריד, ספרד). אנו מודים גם לנציבות האירופית על פרויקט GLYCOTWIN.
Materials
| 5 mm Shigemi microtube set mat | CortecNet SAS | S30BMS-005B | |
| Alpha-Lactose-Agarose | Sigma-Aldrich Química S.L. | 7634-5ML | |
| Ammonium chloride (15 N, 99%) | LC-0179-N-50G | Tracer Tecnologías Analíticas S.L | |
| Ampicillin (Sodium Salt) | Melford Laboratories LTD | A40040 | |
| BIOVIA Discovery studio | BIOVIA, Dassault Systèmes | ||
| BL21(DE3) Chemically Competent Cells | Merck Life Science, S.L.U. | CMC0014-40X40UL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-22R | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-1000 | |
| Incubator | Eppendorf | Innova 42 | |
| IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside) | VWR International Eurolab S.L. | VW437144N | |
| LacNAc | Elicityl | GLY008 | |
| Luria Bertani (LB) Broth | Merck Life Science, S.L.U. | 3397-1KG | |
| Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC | VWR International Eurolab S.L. | 214-1137 | |
| PBS 10x | Bio-Rad | 1610780 | |
| PyMOL | PyMOL Molecular Graphics System | Version 2.0 Schrödinger | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | VC 505 | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 600 MHz AVANCE III | |
| Superconducting NMR magnet | Bruker | 800 MHz AVANCE III |
References
- Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
- Poveda, A., Jimenez-Barbero, J. NMR studies of carbohydrate-protein interactions in solution. Chem Soc Rev. 27, 133-144 (1998).
- Kogelberg, H., Solís, D., Jiménez-Barbero, J. New structural insights into carbohydrate-protein interactions from NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 13 (5), 646-653 (2003).
- Widmalm, G. Glycan shape, motions, and interactions explored by NMR spectroscopy. JACS Au. 4 (1), 20-39 (2024).
- Marchetti, R., et al. 34;Rules of Engagement" of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling. ChemistryOpen. 5 (4), 274-296 (2016).
- Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. The recognition of glycans by protein receptors. Insights from NMR spectroscopy. Chem Commun. 54 (38), 4761-4769 (2018).
- Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Glycan structures and their interactions with proteins. A NMR view. Curr Opin Struct Biol. 62, 22-30 (2020).
- Cañada, F. J., et al. Conformational and structural characterization of carbohydrates and their interactions studied by NMR. Curr Med Chem. 29 (7), 1147-1172 (2022).
- Valverde, P., Quintana, J. I., Santos, J. I., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Novel NMR avenues to explore the conformation and interactions of glycans. ACS Omega. 4, 13618-13630 (2019).
- Jiménez-Barbero, J., Asensio, J. L., Cañada, F. J., Poveda, A. Free and protein-bound carbohydrate structures. Curr Opin Struct Biol. 9 (5), 549-555 (1999).
- Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR. Chem Soc Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).
- Roldós, V., Cañada, F. J., Jiménez-Barbero, J. Carbohydrate-protein interactions: a 3D view by NMR. Chembiochem. 12 (7), 990-1005 (2011).
- Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J., Millet, O. NMR of glycoproteins: profiling, structure, conformation, and interactions. Curr Opin Struct Biol. 68, 9-17 (2021).
- del Carmen Fernández-Alonso, M., Díaz, D., Berbis, M. A., Marcelo, F., Cañada, J., Jiménez-Barbero, J. Protein-carbohydrate interactions studied by NMR: from molecular recognition to drug design. Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 816-830 (2012).
- Angulo, J., Nieto, P. M. STD-NMR: application to transient interactions between biomolecules-a quantitative approach. Eur Biophys J. 40 (12), 1357-1369 (2012).
- Mayer, M., Meyer, B. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor. J Am Chem Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).
- Williamson, M. P. Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 73, 1-16 (2013).
- Fernández, C., Adeishvili, K., Wüthrich, K. Transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy with the outer membrane protein OmpX in dihexanoyl phosphatidylcholine micelles. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2358-2363 (2001).
- Yee, A., Gutmanas, A., Arrowsmith, C. H. Solution NMR in structural genomics. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 611-617 (2006).
- Skinner, S. P., Fogh, R. H., Boucher, W., Ragan, T. J., Mureddu, L. G., Vuister, G. W. CCPNMR AnalysisAssign: a flexible platform for integrated NMR analysis. J Biomol NMR. 66 (2), 111-124 (2016).
- Gimeno, A., et al. Minimizing the entropy penalty for ligand binding: Lessons from the molecular recognition of the histo blood-group antigens by human Galectin-3. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (22), 7268-7272 (2019).
