Floresan cAMP Fark Dedektörünü Yerinde Kullanarak Canlı Hücrelerde Gerçek Zamanlı cAMP Dinamikleri
Summary
Bu çalışmada sunulan protokol, cAMP Fark Dedektörünün In Situ olarak cAMP ölçümündeki etkinliğini iki yöntemle göstermektedir. Bir yöntem, HEK-293 hücreli 96 oyuklu bir plaka okuma spektrofotometresi kullanır. Diğer yöntem, bir floresan mikroskobu altında tek tek HASM hücrelerini gösterir.
Abstract
cAMP Fark Dedektörü In Situ (cADDis), canlı hücrelerde cAMP seviyelerinin sürekli olarak ölçülmesini sağlayan yeni bir biyosensördür. Biyosensör, Epac2’nin menteşe bölgesine bağlı dairesel olarak permütasyonlu bir floresan proteinden oluşturulur. Bu, cAMP’nin bağlanması üzerine artan veya azalan floresan gösteren tek bir florofor biyosensörü oluşturur. Biyosensör, kırmızı ve yeşil yukarı doğru versiyonların yanı sıra yeşil aşağı versiyonlarda ve hücre altı konumları hedefleyen birkaç kırmızı ve yeşil versiyonda bulunur. Biyosensörün etkinliğini göstermek için, cAMP bağlanması üzerine floresan olarak azalan yeşil aşağı doğru versiyon kullanıldı. Bu sensörü kullanan iki protokol gösterilmiştir: biri yüksek verimli tarama ile uyumlu 96 oyuklu bir plaka okuma spektrofotometresi kullanır ve diğeri floresan mikroskopta tek hücreli görüntüleme kullanır. Plaka okuyucuda, 96 oyuklu plakalarda kültürlenen HEK-293 hücreleri, 10 μM forskolin veya 10 nM izoproterenol ile uyarıldı, bu da yeşil aşağı doğru versiyonda floresanda hızlı ve büyük düşüşlere neden oldu. Biyosensör, floresan mikroskobu altında izlenen bireysel insan hava yolu düz kas (HASM) hücrelerindeki cAMP seviyelerini ölçmek için kullanıldı. Yeşil aşağı doğru biyosensör, forskolin veya izoproterenol ile uyarıldığında hücre popülasyonlarına benzer tepkiler gösterdi. Bu tek hücreli tahlil, biyosensör konumunun 20x ve 40x büyütmede görselleştirilmesini sağlar. Bu nedenle, bu cAMP biyosensörü hassas ve esnektir, hem ölümsüzleştirilmiş hem de birincil hücrelerde ve tek hücrelerde veya hücre popülasyonlarında cAMP’nin gerçek zamanlı ölçümüne izin verir. Bu özellikler, cADD’yi canlı hücrelerde cAMP sinyal dinamiklerini incelemek için değerli bir araç haline getirir.
Introduction
Adenozin 3′,5′-siklik monofosfat, cAMP, hücresel iletişimde ve çeşitli fizyolojik süreçlerin koordinasyonunda merkezi bir rol oynar. cAMP, hücre içi olaylar dizisi başlatmak için hormonlardan, nörotransmiterlerden veya diğer hücre dışı moleküllerden gelen dış sinyalleri ileten ikinci bir haberci görevi görür1. Ayrıca, cAMP, G-proteinine bağlı reseptörler (GPCR’ler) ve adenilil siklazlar ile ilişkili olanlar dahil olmak üzere çeşitli sinyal yollarında karmaşık bir şekilde yer alır. cAMP’nin hücresel sinyallemedeki rolünü anlamak, normal hücresel fonksiyonların altında yatan karmaşık mekanizmaların çözülmesi ve çok çeşitli tıbbi durumlar için potansiyel tedavilerin geliştirilmesi için esastır2.
Geçmişte, cAMP’yi doğrudan veya dolaylı olarak ölçmek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Bunlar, hücresel ATP havuzlarının radyo-etiketlenmesini ve ardından kolon saflaştırma, HPLC, radyoimmünoassay ve enzime bağlı immünolojik testleriiçeriyordu 1,2. Bu eski tahliller, zamana bağlı yanıtlar oluşturmak için çok sayıda numune gerektiren son nokta ölçümleri olmaları gerçeğiyle sınırlıdır. Daha yakın zamanlarda, canlı hücrelerde tahliller oluşturmak, gerçek zamanlı, dinamik veriler üretmek ve sensörlerin farklı hücre altı konumlarda hedeflenmesine izin vermek için Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) sensörleri geliştirildi3. FRET iki florofor, bir floresan donörü ve bir floresan alıcısı kullanır, bu da yakın olduğunda, alıcı florofor donör floresan çıkışı tarafından uyarılır. En çok kullanılan iki florofor, camgöbeği floresan proteini (CFP) ve sarı floresan proteinidir (YFP), çünkü bunlar uyumlu uyarma ve emisyon özelliklerine sahiptir. CFP ve YFP’ye ek olarak, yeşil floresan proteini (GFP) ve kırmızı floresan proteininin (RFP) kullanımı FRET biyosensörleri için yaygın olarak kullanılmaktadır. cAMP FRET biyosensörleri, Epac2 cAMP bağlayıcı proteinin zıt uçlarında bir verici ve alıcıya sahip olarak çalışır. cAMP bağlanması, Epac’ın onayını değiştirir ve verici ile alıcı floroforlar 3,4 arasındaki mesafeyi artırır. Bu konformasyonel değişiklik, bir FRET kaybı, yani alıcı floroforun donör florofor damlalarından3 aktarılan enerji ile uyarılması ile tespit edilir. Görünüşte basit bir süreç olsa da, cAMP araştırması için FRET biyosensörüyle ilgili çok sayıda sınırlama ve sorun vardır5. Bunlardan biri, floresan proteinlerin, örneğin doğal olarak dimerize olabilen ve böylece hassasiyeti azaltabilen GFP’nin seçimidir6. FRET tabanlı cAMP biyosensörleri belirli mikro alanlara7 hedeflenmiştir, ancak iki floroforlu bir yapının büyük boyutu nedeniylesınırlamalar olabilir 6. Bir diğer önemli konu, floroforun uyarılması ve emisyonu arasındaki örtüşmeden kaynaklanan FRET sinyallerinin düşük sinyal-gürültü oranıdır, bu da yüksek örnekleme frekansı ve sonuçların analizini zorlaştırır 4,5.
Son zamanlarda, yeni biyosensör (cAMP Fark Dedektörü In Situ), cADDis, cAMP sinyalizasyonunun düzenlenmesi söz konusu olduğunda bu ve diğer sınırlamaları çözdü8. Önemli bir gelişme, tek bir florofora bağımlılıktır. Bu, daha geniş bir dinamik aralık ve yüksek sinyal-gürültü oranı ile hızlı ve verimli bir sinyal sağlar. Sonuç olarak,8’i taramak için daha az geniş bir dalga boyu kapsamı olduğundan daha fazla doğruluk olabilir. FRET probları gibi, biyosensör de hücre altı konumlara hedeflenmiştir, bu da lipit sallarında ve sal olmayanlarda ve diğer hücre altı alanlarda bölmeli teori araştırmalarına ve keşiflerine izin vermiştir9. Belki de en önemlisi, FRET tabanlı biyosensörlere göre daha iyi hassasiyet ve tekrarlanabilirliğe sahip olan yüksek verimli tarama için tek bir florofor biyosensörünün uygunluğudur. Biyosensör, çok çeşitli hücre tiplerinin kolay transdüksiyonu ve protein ekspresyonu üzerinde hassas kontrol için bir BacMam vektörüne paketlenmiştir.
BacMam vektörü aracılığıyla ekspresyon kontrolü, hayvan çalışmalarından elde edilen verilerin yorumlanmasını kolaylaştırmak için farklı türlerden GPCR ortologları kullanılarak yapılan tahlillerde özellikle yararlı olabilir. Ayrıca, reseptör ekspresyonu üzerindeki kontrol, farklı ilaç etkinliği derecelerini ölçmek için kritik öneme sahiptir (ör., ters agonistler ve kısmi agonistler) ve düşük reseptör ekspresyonu seviyeleri, hayvan dokusunda bulunan düşük seviyeleri taklit etmek için yararlıdır. BacMam, birincil hücre kültürleri ve HEK-293 hatları10 gibi memeli hücrelerini dönüştürmek için modifiye edilmiş bir bakulovirüs vektörüdür. Baskın seçilebilir belirteçler, BacMam’ın geleneksel plazmit enfeksiyonlarına göre daha fazla stabilite sağlamasına izin verir11. Bu tür seçici promotörler, daha verimli gen iletimi ve ekspresyonuna izin verir. Ek olarak, trikostatin A (bir histon deasetilaz inhibitörü) eklemek, raportör protein seviyelerini11 arttırır. Ekspresyon seviyeleri, kullanılan BacMam virüsünün titresi ile kontrol edilebilir ve her hücre tipi için optimize edilmelidir. Bu biyosensör durumunda, kırmızı veya yeşil bir floresan protein, N- ve C-terminallerinde Epac’a bağlanır. cAMP bağlandığında, biyosensördeki konformasyonel bir değişiklik, floresan proteine bitişik amino asitleri hareket ettirir. Böyle bir kayma, absorbansı anyonik durumdan 400 nm’de nötr duruma hareket ettirir ve böylece floresansı azaltır.
Çok çeşitli nörohumoral sinyallere yanıt veren tek bir hücrede eksprese edilen 90-120 GPCR vardır12. Bu nedenle, hücre başına en az birkaç düzine GPCR’nin, sırasıyla Gs veya Gi eşleşmesi yoluyla cAMP’yi uyarabileceği veya inhibe edebileceği varsayılabilir. Bu ikinci haberciyi FRET gibi gerçek zamanlı olarak izlemede ilerleme kaydedilmiş olsa da, daha verimli yöntemlere ihtiyaç vardır. cADDis kullanarak cAMP sinyallerinin sentezini ve bozunmasını gerçek zamanlı olarak izleme metodolojisi burada sunulmaktadır. Floresanstaki değişiklik, yüksek verimli deneyler için bir floresan plaka okuyucu veya tek hücreli deneyler için bir floresan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bu yöntemler, cAMP aracılığıyla GPCR sinyalizasyonu ile ilgili çok çeşitli biyolojik sorular için kullanışlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
cAMP’nin doğru ve hassas ölçümü, çeşitli hücresel süreçlerdeki rolünü anlamak ve cAMP’ye bağlı sinyal yollarının aktivitesini incelemek için çok önemlidir. ELISA, radyoimmünoassay, FRET biyosensörleri ve GloSensor cAMP testi 14,15,16,17,18 dahil olmak üzere cAMP seviyelerini ölçmek için yaygın olarak kullanılan çeşitli yöntemler vardır.<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) (HL169522) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 96-well plate (clear) | Fisherbrand | 21-377-203 | |
| 35 mm dish | Greiner Bio-One | 627870 | Cell culture dishes with glass bottom |
| 96-well plate | Corning | 3904 | Black with clear flat bottom |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | For HEK and HASM media |
| BZ-X fluorescence microscope | Keyence | ||
| Calcium chloride (IM) | Quality Biological Inc | E506 | For HASM media |
| Centrifuge tube (15 mL) | Thermo Scientific | 339651 | |
| DMEM (1x) | Gibco | 11965092 | HEK media |
| DPBS with Mg2+ and Ca2+ | Gibco | 14040-133 | |
| DPBS without Mg2+ and Ca2+ | Corning | 14040-133 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11195 | For HEK and HASM media |
| Forskolin | Millipore | 344270 | Drug |
| Green Down cADDis cAMP Assay Kit | Montana Molecular | #D0200G | Reagent |
| Ham's F-12K | Gibco | 21127022 | For HASM media |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | For HASM media |
| Isoproterenol | Sigma | I6504 | Drug |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | For HASM media |
| Microcentrifuge tube (2 mL) | Eppendorf | 22363352 | |
| Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | Antibiotic for HASM media |
| RNAse away | Thermo Scientific | 700511 | Reagent |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | S2770 | For HASM media |
| Spectrmax M5 plate reader | Molecular Devices | ||
| Trichostatin A | TCI America | T2477 | Reagent |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent |
References
- Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
- Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769 (2020).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of fret measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332 (2018).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
- Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
- Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
- Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
- Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
- Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
- Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
- Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
- Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
- Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
- Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
- Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
- Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
- Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
- De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646 (2022).
- Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
- Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
- Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
- Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297 (2022).
- Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).
