Dinámica de cAMP en tiempo real en células vivas utilizando el detector de diferencia de cAMP fluorescente in situ
Summary
El protocolo presentado en este estudio ilustra la efectividad del Detector de Diferencia de AMPc In Situ en la medición de AMPc a través de dos métodos. Un método utiliza un espectrofotómetro de lectura de placa de 96 pocillos con celdas HEK-293. El otro método muestra células HASM individuales bajo un microscopio fluorescente.
Abstract
cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) es un nuevo biosensor que permite la medición continua de los niveles de cAMP en células vivas. El biosensor se crea a partir de una proteína fluorescente permutada circularmente unida a la región bisagra de Epac2. Esto crea un único biosensor de fluoróforo que muestra un aumento o una disminución de la fluorescencia tras la unión del AMPc. El biosensor existe en versiones rojas y verdes hacia arriba, así como en versiones verdes hacia abajo, y varias versiones rojas y verdes dirigidas a ubicaciones subcelulares. Para ilustrar la eficacia del biosensor, se utilizó la versión verde hacia abajo, que disminuye la fluorescencia al unirse al AMPc. Se muestran dos protocolos que utilizan este sensor: uno que utiliza un espectrofotómetro de lectura de placa de 96 pocillos compatible con el cribado de alto rendimiento y otro que utiliza imágenes de una sola célula en un microscopio fluorescente. En el lector de placas, las células HEK-293 cultivadas en placas de 96 pocillos se estimularon con 10 μM de forskolina o 10 nM de isoproterenol, lo que indujo disminuciones rápidas y grandes de la fluorescencia en la versión verde hacia abajo. El biosensor se utilizó para medir los niveles de AMPc en células individuales de músculo liso de las vías respiratorias humanas (HASM) monitoreadas bajo un microscopio fluorescente. El biosensor verde hacia abajo mostró respuestas similares a las poblaciones de células cuando se estimularon con forskolina o isoproterenol. Este ensayo de una sola célula permite la visualización de la ubicación del biosensor con aumentos de 20x y 40x. Por lo tanto, este biosensor de AMPc es sensible y flexible, lo que permite la medición en tiempo real de AMPc tanto en células inmortalizadas como primarias, y con células individuales o poblaciones de células. Estos atributos hacen que cADDis una herramienta valiosa para estudiar la dinámica de señalización de cAMP en células vivas.
Introduction
El monofosfato cíclico de adenosina 3′,5′-cíclico, AMPc, desempeña un papel central en la comunicación celular y la coordinación de diversos procesos fisiológicos. El AMPc actúa como un segundo mensajero, transmitiendo señales externas de hormonas, neurotransmisores u otras moléculas extracelulares para iniciar una cascadade eventos intracelulares. Además, el AMPc está estrechamente implicado en varias vías de señalización, incluidas las asociadas con los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) y las adenilil ciclasas. Comprender el papel del AMPc en la señalización celular es fundamental para desentrañar los complejos mecanismos que subyacen a las funciones celulares normales y el desarrollo de posibles terapias para una amplia gamade afecciones médicas.
En el pasado, se han empleado varios métodos para medir el AMPc directa o indirectamente. Estos incluyeron el radiomarcaje de grupos celulares de ATP seguido de purificación en columna, HPLC, radioinmunoensayos e inmunoensayos ligados a enzimas 1,2. Estos ensayos heredados están limitados por el hecho de que son medidas de punto final, que requieren un gran número de muestras para construir respuestas dependientes del tiempo. Más recientemente, se desarrollaron sensores de transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) para crear ensayos en células vivas, produciendo datos dinámicos en tiempo real y permitiendo que los sensores se dirijan a diferentes ubicaciones subcelulares3. FRET aprovecha dos fluoróforos, un donante fluorescente y un aceptor fluorescente que, cuando están muy cerca, el fluoróforo aceptor será excitado por la salida fluorescente del donante. Los dos fluoróforos más utilizados son la proteína fluorescente cian (CFP) y la proteína fluorescente amarilla (YFP), ya que tienen propiedades de excitación y emisión compatibles. Además de CFP e YFP, la utilización de la proteína fluorescente verde (GFP) y la proteína fluorescente roja (RFP) se usa comúnmente para los biosensores FRET. Los biosensores cAMP FRET funcionan teniendo un donante y un aceptor en los extremos opuestos de la proteína de unión a Epac2 cAMP. La unión de AMPc altera la confirmación de Epac y aumenta la distancia entre los fluoróforos donantes y aceptores 3,4. Este cambio conformacional se detecta por una pérdida de FRET, es decir, la excitación del fluoróforo aceptor por la energía transferida de las gotas de fluoróforo donantes3. Si bien es un proceso aparentemente simple, existen una gran cantidad de limitaciones y problemas con el biosensor FRET para la investigación de cAMP5. Una de ellas es la selección de proteínas fluorescentes, por ejemplo, GFP, que pueden dimerizarse de forma natural, reduciendo así la sensibilidad6. Los biosensores de AMPc basados en FRET se han dirigido a microdominios específicos7, pero puede haber limitaciones debido al gran tamaño de una construcción con dos fluoróforos6. Otra cuestión importante es la baja relación señal-ruido de las señales FRET resultante de la superposición entre la excitación y la emisión del fluoróforo, lo que da lugar a una alta frecuencia de muestreo y complica el análisis de los resultados 4,5.
Más recientemente, el novedoso biosensor (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis, ha resuelto estas y otras limitaciones a la hora de estudiar la regulación de la señalización de cAMP8. Una mejora importante es la dependencia de un solo fluoróforo. Esto permite una señal rápida y eficiente con un rango dinámico más amplio y una alta relación señal-ruido. Como resultado, puede haber más precisión, ya que hay un alcance menos amplio de longitudes de onda para peinar8. Al igual que las sondas FRET, el biosensor se ha dirigido a ubicaciones subcelulares, lo que permite la investigación de la teoría de la compartimentación y la exploración en balsas y no balsas lipídicas, y otros dominios subcelulares9. Quizás lo más importante es la idoneidad de un solo biosensor de fluoróforo para el cribado de alto rendimiento, que ha mejorado la sensibilidad y la reproducibilidad en comparación con los biosensores basados en FRET. El biosensor está empaquetado en un vector BacMam para una fácil transducción de una amplia gama de tipos de células y un control preciso sobre la expresión de proteínas.
El control de la expresión a través del vector BacMam puede ser especialmente útil en ensayos que utilizan ortólogos GPCR de diferentes especies para facilitar la interpretación de los datos de los estudios con animales. Además, el control sobre la expresión del receptor es fundamental para medir los diferentes grados de eficacia del fármaco (por ejemplo, agonistas inversos y agonistas parciales), y los niveles bajos de expresión del receptor son útiles para imitar los niveles bajos que se encuentran en el tejido animal. BacMam es un vector de baculovirus que ha sido modificado para transducir células de mamíferos como cultivos celulares primarios y líneas HEK-29310. Los marcadores dominantes seleccionables permiten que BacMam proporcione más estabilidad sobre las infecciones plásmidas tradicionales11. Estos promotores selectivos permiten una entrega y expresión génica más eficientes. Además, la adición de tristolatina A (un inhibidor de la histona desacetilasa) aumenta los niveles de proteínas reporteras11. Los niveles de expresión pueden controlarse a través del título del virus BacMam utilizado y deben optimizarse para cada tipo de célula. En el caso de este biosensor, una proteína fluorescente roja o verde se une a la Epac en los extremos N y C. Cuando el AMPc se une, un cambio conformacional en el biosensor mueve los aminoácidos adyacentes a la proteína fluorescente. Tal cambio mueve la absorbancia del estado aniónico al estado neutro a 400 nm, disminuyendo así la fluorescencia.
Existen entre 90 y 120 GPCRs expresados en una sola célula que responden a una amplia variedad de señales neurohumorales12. Por lo tanto, se puede plantear la hipótesis de que al menos varias docenas de GPCR por célula pueden estimular o inhibir el AMPc a través del acoplamiento Gs o Gi, respectivamente. Si bien ha habido avances en el monitoreo de este segundo mensajero en tiempo real, como FRET, se necesitan métodos más eficientes. Aquí se presenta la metodología para monitorear la síntesis y degradación de señales de cAMP utilizando cADDis en tiempo real. El cambio en la fluorescencia se puede monitorear en tiempo real utilizando un lector de placas de fluorescencia para ensayos de alto rendimiento o usando un microscopio fluorescente para ensayos de una sola célula. Estos métodos son útiles para una amplia gama de cuestiones biológicas relacionadas con la señalización de GPCR a través de cAMP.
Protocol
Representative Results
Discussion
La medición precisa y sensible del AMPc es crucial para comprender su papel en diversos procesos celulares y para estudiar la actividad de las vías de señalización dependientes del AMPc. Existen varios métodos comúnmente empleados para medir los niveles de AMPc, incluyendo ELISA, radioinmunoensayo, biosensores FRET y el ensayo GloSensor cAMP 14,15,16,17,18.</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue respaldado por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NHLBI, por sus siglas en inglés) (HL169522).
Materials
| 96-well plate (clear) | Fisherbrand | 21-377-203 | |
| 35 mm dish | Greiner Bio-One | 627870 | Cell culture dishes with glass bottom |
| 96-well plate | Corning | 3904 | Black with clear flat bottom |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | For HEK and HASM media |
| BZ-X fluorescence microscope | Keyence | ||
| Calcium chloride (IM) | Quality Biological Inc | E506 | For HASM media |
| Centrifuge tube (15 mL) | Thermo Scientific | 339651 | |
| DMEM (1x) | Gibco | 11965092 | HEK media |
| DPBS with Mg2+ and Ca2+ | Gibco | 14040-133 | |
| DPBS without Mg2+ and Ca2+ | Corning | 14040-133 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11195 | For HEK and HASM media |
| Forskolin | Millipore | 344270 | Drug |
| Green Down cADDis cAMP Assay Kit | Montana Molecular | #D0200G | Reagent |
| Ham's F-12K | Gibco | 21127022 | For HASM media |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | For HASM media |
| Isoproterenol | Sigma | I6504 | Drug |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | For HASM media |
| Microcentrifuge tube (2 mL) | Eppendorf | 22363352 | |
| Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | Antibiotic for HASM media |
| RNAse away | Thermo Scientific | 700511 | Reagent |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | S2770 | For HASM media |
| Spectrmax M5 plate reader | Molecular Devices | ||
| Trichostatin A | TCI America | T2477 | Reagent |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent |
References
- Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
- Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769 (2020).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of fret measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332 (2018).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
- Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
- Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
- Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
- Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
- Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
- Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
- Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
- Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
- Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
- Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
- Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
- Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
- Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
- De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646 (2022).
- Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
- Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
- Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
- Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297 (2022).
- Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).
