Динамика цАМФ в реальном времени в живых клетках с использованием флуоресцентного дифференциального детектора цАМФ in situ

Аденозин-3′,5′-циклический монофосфат, цАМФ, играет центральную роль в клеточной коммуникации и координации различных физиологических процессов. цАМФ действует как второй посредник, ретранслируя внешние сигналы от гормонов, нейротрансмиттеров или других внеклеточных молекул, чтобы инициировать каскад внутриклеточных событий¹. Кроме того, цАМФ неразрывно связан с различными сигнальными путями, в том числе связанными с рецепторами, связанными с G-белком (GPCR) и аденилатциклазами. Понимание роли цАМФ в передаче клеточной сигнализации имеет основополагающее значение для разгадки сложных механизмов, лежащих в основе нормальных клеточных функций, и разработки потенциальных методов лечения широкого спектра^{заболеваний.}

В прошлом для прямого или косвенного измерения цАМФ использовались различные методы. Они включали радиоактивное мечение клеточных пулов АТФ с последующей очисткой колонки, ВЭЖХ, радиоиммунными анализами и иммуноферментными анализами ^1,2. Эти устаревшие анализы ограничены тем фактом, что они являются конечными измерениями, требующими большого количества образцов для построения зависимых от времени ответов. Совсем недавно были разработаны датчики флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) для создания анализов в живых клетках, производящих динамические данные в режиме реального времени и позволяющих нацеливаться на датчики в различных субклеточных местоположениях. FRET использует два флуорофора, один флуоресцентный донор и один флуоресцентный акцептор, которые при нахождении в непосредственной близости от акцептора флуорофора будут возбуждаться донорским флуоресцентным выходом. Двумя наиболее часто используемыми флуорофорами являются голубой флуоресцентный белок (CFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP), поскольку они обладают совместимыми свойствами возбуждения и излучения. В дополнение к CFP и YFP, использование зеленого флуоресцентного белка (GFP) и красного флуоресцентного белка (RFP) обычно используется для биосенсоров FRET. Биосенсоры cAMP FRET работают за счет наличия донора и акцептора на противоположных концах связывающего белка Epac2 cAMP. Связывание цАМФ изменяет подтверждение Epac и увеличивает расстояние между донором и акцепторными флуорофорами ^3,4. Это конформационное изменение обнаруживается потерей FRET, то есть возбуждением акцепторного флуорофора энергией, передаваемой^{от капель} донорного флуорофора3. Несмотря на кажущуюся простоту процесса, существует множество ограничений и проблем с биосенсором FRET для исследований цАМФ⁵. Одним из них является отбор флуоресцентных белков, например, GFP, которые могут димеризоваться естественным образом, снижая таким образом чувствительность⁶. Биосенсоры cAMP на основе FRET были нацелены на конкретные микродомены⁷, но могут быть ограничения из-за большого размера конструкции с двумя флуорофорами⁶. Другой существенной проблемой является низкое отношение сигнал/шум сигналов FRET в результате перекрытия между возбуждением и излучением флуорофора, что приводит к высокой частоте дискретизации и усложнению анализа результатов ^4,5.

Совсем недавно новый биосенсор (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis решил эти и другие ограничения, когда дело доходит до изучения регуляции передачи сигналов cAMP⁸. Одним из важных улучшений является зависимость от одного флуорофора. Это обеспечивает быстрый и эффективный сигнал с более широким динамическим диапазоном и высоким соотношением сигнал/шум. В результате может быть больше точности, так как существует менее широкий диапазон длин волн для прочесывания⁸. Как и FRET-зонды, биосенсор был нацелен на субклеточные места, что позволяет проводить исследования в области теории компартментации и исследовать липидные рафты и не-рафты, а также другие субклеточные^{домены.} Возможно, наиболее важным является пригодность одного флуорофорного биосенсора для высокопроизводительного скрининга, который имеет улучшенную чувствительность и воспроизводимость по сравнению с биосенсорами на основе FRET. Биосенсор упакован в вектор BacMam, что обеспечивает легкую трансдукцию широкого спектра типов клеток и точный контроль экспрессии белков.

Контроль экспрессии с помощью вектора BacMam может быть особенно полезен при анализах с использованием ортологов GPCR различных видов для облегчения интерпретации данных исследований на животных. Кроме того, контроль над экспрессией рецепторов имеет решающее значение для измерения различных степеней эффективности лекарств (например, обратных агонистов и частичных агонистов), а низкие уровни экспрессии рецепторов полезны для имитации низких уровней, обнаруженных в тканях животных. BacMam представляет собой бакуловирусный вектор, который был модифицирован для трансдукции клеток млекопитающих, таких как первичные клеточные культуры и линии HEK-293¹⁰. Доминирующие селективные маркеры позволяют BacMam обеспечивать большую стабильность по сравнению с традиционными плазмидными инфекциями¹¹. Такие селективные промоторы обеспечивают более эффективную доставку и экспрессию генов. Кроме того, добавление трихостатина А (ингибитора гистондеацетилазы) повышает уровень репортерного белка¹¹. Уровни экспрессии можно контролировать с помощью титра используемого вируса BacMam, и они должны быть оптимизированы для каждого типа клеток. В случае этого биосенсора красный или зеленый флуоресцентный белок связан с Epac на N- и C-концах. Когда цАМФ связывается, конформационное изменение в биосенсоре перемещает аминокислоты, прилегающие к флуоресцентному белку. Такой сдвиг перемещает поглощение из анионного состояния в нейтральное состояние с длиной волны 400 нм, тем самым уменьшая флуоресценцию.

В одной клетке экспрессируется 90-120 GPCR, которые реагируют на широкий спектр нейрогуморальных сигналов¹². Таким образом, можно предположить, что по крайней мере несколько десятков GPCR на клетку могут стимулировать или ингибировать цАМФ через Gs или Gi-связь соответственно. Несмотря на то, что был достигнут прогресс в мониторинге этого второго мессенджера в режиме реального времени, такого как FRET, необходимы более эффективные методы. Представлена методология мониторинга синтеза и деградации сигналов cAMP с помощью cADDis в режиме реального времени. Изменение флуоресценции можно контролировать в режиме реального времени с помощью считывателя флуоресцентных планшетов для высокопроизводительных анализов или с помощью флуоресцентного микроскопа для анализа отдельных клеток. Эти методы полезны для решения широкого круга биологических вопросов, касающихся передачи сигналов GPCR через цАМФ.