ديناميكيات cAMP في الوقت الفعلي في الخلايا الحية باستخدام كاشف فرق cAMP الفلوري في الموقع
Summary
يوضح البروتوكول المقدم في هذه الدراسة فعالية كاشف الفرق cAMP في الموقع في قياس cAMP من خلال طريقتين. تستخدم إحدى الطرق مقياس الطيف الضوئي لقراءة الألواح ذات 96 بئرا مع خلايا HEK-293. توضح الطريقة الأخرى خلايا HASM الفردية تحت مجهر الفلورسنت.
Abstract
كاشف الفرق cAMP في الموقع (cADDis) هو مستشعر حيوي جديد يسمح بالقياس المستمر لمستويات cAMP في الخلايا الحية. يتم إنشاء المستشعر الحيوي من بروتين فلوري دائري مرتبط بمنطقة المفصلات في Epac2. يؤدي هذا إلى إنشاء مستشعر حيوي فلوروفور واحد يعرض إما زيادة أو نقصان التألق عند ربط cAMP. يوجد المستشعر الحيوي في إصدارات تصاعدية حمراء وخضراء ، بالإضافة إلى إصدارات خضراء هابطة ، والعديد من الإصدارات الحمراء والخضراء التي تستهدف المواقع دون الخلوية. لتوضيح فعالية المستشعر الحيوي ، تم استخدام النسخة الخضراء الهابطة ، والتي تتناقص في التألق عند ربط cAMP. تم عرض بروتوكولين يستخدمان هذا المستشعر: أحدهما يستخدم مقياس الطيف الضوئي لقراءة الألواح ذات 96 بئرا المتوافق مع الفحص عالي الإنتاجية والآخر يستخدم التصوير أحادي الخلية على مجهر الفلورسنت. على قارئ اللوحة ، تم تحفيز خلايا HEK-293 المزروعة في 96 لوحة جيدة باستخدام 10 ميكرومتر فورسكولين أو 10 نانومتر إيزوبروتيرينول ، مما أدى إلى انخفاض سريع وكبير في التألق في النسخة الخضراء الهابطة. تم استخدام المستشعر الحيوي لقياس مستويات cAMP في خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء البشري (HASM) التي تتم مراقبتها تحت مجهر الفلورسنت. أظهر المستشعر الحيوي الأخضر الهابط استجابات مماثلة لمجموعات الخلايا عند تحفيزه باستخدام فورسكولين أو إيزوبروتيرينول. يسمح هذا الفحص أحادي الخلية بتصور موقع المستشعر الحيوي بتكبير 20x و 40x. وبالتالي ، فإن هذا المستشعر الحيوي cAMP حساس ومرن ، مما يسمح بقياس cAMP في الوقت الفعلي في كل من الخلايا الخالدة والأولية ، ومع الخلايا المفردة أو مجموعات الخلايا. هذه السمات تجعل cADDis أداة قيمة لدراسة ديناميكيات إشارات cAMP في الخلايا الحية.
Introduction
الأدينوزين 3 ′ ، 5 ′ أحادي الفوسفات الدوري ، cAMP ، يلعب دورا مركزيا في الاتصالات الخلوية وتنسيق العمليات الفسيولوجية المختلفة. يعمل cAMP كرسول ثان ، ينقل الإشارات الخارجية من الهرمونات أو الناقلات العصبية أو الجزيئات الأخرى خارج الخلية لبدء سلسلة من الأحداث داخل الخلايا1. علاوة على ذلك ، يشارك cAMP بشكل معقد في مسارات الإشارات المختلفة ، بما في ذلك تلك المرتبطة بمستقبلات البروتين G (GPCRs) وسيكلاز الأدينيل. يعد فهم دور cAMP في الإشارات الخلوية أمرا أساسيا لكشف الآليات المعقدة التي تكمن وراء الوظائف الخلوية الطبيعية وتطوير العلاجات المحتملة لمجموعة واسعة من الحالات الطبية2.
في الماضي ، تم استخدام طرق مختلفة لقياس cAMP بشكل مباشر أو غير مباشر. وشمل ذلك وضع العلامات الإشعاعية لتجمعات ATP الخلوية متبوعة بتنقية العمود ، HPLC ، المقايسات المناعية الإشعاعية ، والمقايسات المناعية المرتبطة بالإنزيم 1,2. هذه المقايسات القديمة محدودة بحقيقة أنها مقاييس نقطة النهاية ، وتتطلب عددا كبيرا من العينات لبناء استجابات تعتمد على الوقت. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير مستشعرات نقل الطاقة بالرنين الفلوري (FRET) لإنشاء مقايسات في الخلايا الحية ، وإنتاج بيانات ديناميكية في الوقت الفعلي والسماح باستهداف أجهزة الاستشعار في مواقع تحت خلوية مختلفة3. تستفيد FRET من اثنين من الفلوروفورات ، ومانح فلوري واحد ، ومستقبل فلوري واحد عندما يكون على مقربة ، فإن الفلوروفور المتقبل سيكون متحمسا لناتج الفلورسنت المانح. الفلوروفوران الأكثر استخداما هما بروتين الفلورسنت السماوي (CFP) والبروتين الفلوري الأصفر (YFP) نظرا لأن لهما خصائص إثارة وانبعاث متوافقة. بالإضافة إلى CFP و YFP ، يشيع استخدام البروتين الفلوري الأخضر (GFP) والبروتين الفلوري الأحمر (RFP) لأجهزة الاستشعار الحيوية FRET. تعمل المستشعرات الحيوية cAMP FRET من خلال وجود متبرع ومتقبل على طرفي نقيض من بروتين ربط Epac2 cAMP. يغير ربط cAMP تأكيد Epac ويزيد المسافة بين الفلوروفورات المانحة والمستقبلة 3,4. يتم الكشف عن هذا التغيير المطابق عن طريق فقدان FRET ، أي إثارة الفلوروفور المستقبلة بواسطة الطاقة المنقولة من قطرات الفلوروفور المانحة3. في حين أنها عملية تبدو بسيطة ، إلا أن هناك وفرة من القيود والمشكلات المتعلقة بالمستشعر الحيوي FRET لأبحاث cAMP5. أحدها هو اختيار البروتينات الفلورية ، على سبيل المثال ، GFP ، والتي يمكن أن تخفي بشكل طبيعي ، وبالتالي تقليل الحساسية6. تم استهداف أجهزة الاستشعار الحيوية cAMP القائمة على FRET إلى مجالات دقيقةمحددة 7 ، ولكن قد تكون هناك قيود بسبب الحجم الكبير للبناء مع اثنين من الفلوروفورات6. وثمة مسألة هامة أخرى تتمثل في انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء لإشارات FRET الناتجة عن التداخل بين إثارة وانبعاث الفلوروفور ، مما يؤدي إلى ارتفاع وتيرة أخذ العينات وتعقيد تحليل النتائج 4,5.
في الآونة الأخيرة ، قام المستشعر الحيوي الجديد (كاشف فرق cAMP في الموقع) ، cADDis بحل هذه القيود وغيرها عندما يتعلق الأمر بدراسة تنظيم إشارات cAMP8. أحد التحسينات المهمة هو الاعتماد على فلوروفور واحد. وهذا يسمح بإشارة سريعة وفعالة مع نطاق ديناميكي أوسع ونسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. نتيجة لذلك ، يمكن أن يكون هناك المزيد من الدقة نظرا لوجود نطاق أقل اتساعا من الأطوال الموجية للتمشيط منخلال 8. مثل مجسات FRET ، تم استهداف المستشعر الحيوي للمواقع تحت الخلوية ، مما يسمح بالبحث في نظرية التقسيم والاستكشاف في الطوافات الدهنية وغير الطوافات ، وغيرها من المجالات تحت الخلوية9. ولعل الأهم من ذلك هو مدى ملاءمة جهاز استشعار حيوي فلوروفور واحد للفحص عالي الإنتاجية ، مما أدى إلى تحسين الحساسية والتكاثر على أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على FRET. يتم تعبئة المستشعر الحيوي في ناقل BacMam لسهولة نقل مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والتحكم الدقيق في تعبير البروتين.
يمكن أن يكون التحكم في التعبير عبر ناقل BacMam مفيدا بشكل خاص في المقايسات باستخدام تقويم GPCR من أنواع مختلفة لتسهيل تفسير البيانات من الدراسات على. علاوة على ذلك ، فإن التحكم في تعبير المستقبلات أمر بالغ الأهمية لقياس الدرجات المختلفة لفعالية الدواء (على سبيل المثال ، الناهضات العكسية والناهضات الجزئية) ، والمستويات المنخفضة من تعبير المستقبلات مفيدة لتقليد المستويات المنخفضة الموجودة في الأنسجة الحيوانية. BacMam هو ناقل للفيروس البقعي تم تعديله لتحويل خلايا الثدييات مثل مزارع الخلايا الأولية وخطوط HEK-29310. تسمح العلامات المهيمنة القابلة للاختيار ل BacMam بتوفير مزيد من الاستقرار مقارنة بعدوى البلازميد التقليدية11. تسمح هذه المروجين الانتقائيين بتوصيل الجينات والتعبير عنها بشكل أكثر كفاءة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إضافة الترايكوستاتين A (مثبط هيستون ديسيتيلاز) يعزز مستويات البروتين المراسل11. يمكن التحكم في مستويات التعبير عن طريق عيار فيروس BacMam المستخدم ويجب تحسينه لكل نوع خلية. في حالة هذا المستشعر الحيوي ، يرتبط بروتين الفلورسنت الأحمر أو الأخضر ب Epac في N- و C-termini. عندما يرتبط cAMP ، يؤدي التغيير المطابق في المستشعر الحيوي إلى تحريك الأحماض الأمينية المجاورة للبروتين الفلوري. مثل هذا التحول ينقل الامتصاص من الحالة الأنيونية إلى الحالة المحايدة عند 400 نانومتر ، وبالتالي يقلل من التألق.
هناك 90-120 GPCRs يتم التعبير عنها في خلية واحدة تستجيب لمجموعة واسعة من الإشارات العصبيةالعضلية 12. لذلك ، يمكن افتراض أن ما لا يقل عن عدة عشرات من GPCRs لكل خلية يمكن أن تحفز أو تمنع cAMP من خلال اقتران Gs أو Gi ، على التوالي. بينما كان هناك تقدم في مراقبة هذا الرسول الثاني في الوقت الفعلي ، مثل FRET ، هناك حاجة إلى طرق أكثر كفاءة. يتم عرض منهجية مراقبة توليف وتدهور إشارات cAMP باستخدام cADDis في الوقت الفعلي هنا. يمكن مراقبة التغير في التألق في الوقت الفعلي باستخدام قارئ لوحة مضان للمقايسات عالية الإنتاجية أو باستخدام مجهر الفلورسنت لفحوصات الخلية الواحدة. هذه الطرق مفيدة لمجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية المتعلقة بإشارات GPCR عبر cAMP.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد القياس الدقيق والحساس ل cAMP أمرا بالغ الأهمية لفهم دوره في العمليات الخلوية المختلفة ولدراسة نشاط مسارات الإشارات المعتمدة على cAMP. هناك العديد من الطرق المستخدمة بشكل شائع لقياس مستويات cAMP ، بما في ذلك ELISA ، والمقايسة المناعية الإشعاعية ، وأجهزة الاستشعار الحيوية FRET ، ومقايسة GloSensor cAMP<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (NHLBI) (HL169522).
Materials
| 96-well plate (clear) | Fisherbrand | 21-377-203 | |
| 35 mm dish | Greiner Bio-One | 627870 | Cell culture dishes with glass bottom |
| 96-well plate | Corning | 3904 | Black with clear flat bottom |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | For HEK and HASM media |
| BZ-X fluorescence microscope | Keyence | ||
| Calcium chloride (IM) | Quality Biological Inc | E506 | For HASM media |
| Centrifuge tube (15 mL) | Thermo Scientific | 339651 | |
| DMEM (1x) | Gibco | 11965092 | HEK media |
| DPBS with Mg2+ and Ca2+ | Gibco | 14040-133 | |
| DPBS without Mg2+ and Ca2+ | Corning | 14040-133 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11195 | For HEK and HASM media |
| Forskolin | Millipore | 344270 | Drug |
| Green Down cADDis cAMP Assay Kit | Montana Molecular | #D0200G | Reagent |
| Ham's F-12K | Gibco | 21127022 | For HASM media |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | For HASM media |
| Isoproterenol | Sigma | I6504 | Drug |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | For HASM media |
| Microcentrifuge tube (2 mL) | Eppendorf | 22363352 | |
| Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | Antibiotic for HASM media |
| RNAse away | Thermo Scientific | 700511 | Reagent |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | S2770 | For HASM media |
| Spectrmax M5 plate reader | Molecular Devices | ||
| Trichostatin A | TCI America | T2477 | Reagent |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent |
References
- Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
- Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769 (2020).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of fret measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332 (2018).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
- Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
- Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
- Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
- Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
- Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
- Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
- Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
- Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
- Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
- Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
- Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
- Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
- Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
- De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646 (2022).
- Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
- Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
- Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
- Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297 (2022).
- Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).
