דינמיקת cAMP בזמן אמת בתאים חיים באמצעות גלאי ההבדל cAMP פלואורסצנטי באתרו
Summary
הפרוטוקול המוצג במחקר זה ממחיש את יעילותו של cAMP Difference Detector In Situ במדידת cAMP בשתי שיטות. שיטה אחת משתמשת בספקטרופוטומטר קריאת לוחות 96 בארות עם תאי HEK-293. השיטה השנייה מדגימה תאי HASM בודדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Abstract
cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) הוא חיישן ביולוגי חדשני המאפשר מדידה רציפה של רמות cAMP בתאים חיים. הביוסנסור נוצר מחלבון פלואורסצנטי בעל תמורות מעגליות המקושר לאזור הציר של Epac2. זה יוצר חיישן ביולוגי פלואורופור יחיד המציג פלואורסצנטיות מוגברת או מופחתת בעת קשירת cAMP. הביוסנסור קיים בגרסאות אדומות וירוקות כלפי מעלה, כמו גם בגרסאות ירוקות כלפי מטה, ובמספר גרסאות אדומות וירוקות הממוקדות למיקומים תת-תאיים. כדי להמחיש את יעילותו של הביוסנסור נעשה שימוש בגרסה הירוקה כלפי מטה, אשר פוחתת בפלואורסצנטיות בעת קשירת cAMP. שני פרוטוקולים המשתמשים בחיישן זה מודגמים: האחד משתמש בספקטרופוטומטר קריאת לוחות של 96 בארות התואם לסינון בתפוקה גבוהה והשני באמצעות הדמיה של תא בודד במיקרוסקופ פלואורסצנטי. בקורא הצלחות, תאי HEK-293 שגודלו בתרבית בצלחות 96 בארות עוררו עם 10 מיקרומטר פורסקולין או 10 ננומטר איזופרוטרנול, מה שגרם לירידות מהירות וגדולות בפלואורסצנטיות בגרסה הירוקה כלפי מטה. הביוסנסור שימש למדידת רמות cAMP בתאי שריר חלק של דרכי נשימה אנושיות בודדות (HASM) המנוטרות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הביוסנסור הירוק כלפי מטה הראה תגובות דומות לאוכלוסיות של תאים כאשר הוא מגורה באמצעות פורסקולין או איזופרוטרנול. בדיקה חד-תאית זו מאפשרת הדמיה של מיקום הביו-חיישן בהגדלה של פי 20 ו-40. לפיכך, חיישן ביולוגי cAMP זה רגיש וגמיש, ומאפשר מדידה בזמן אמת של cAMP הן בתאים אימורטליים והן בתאים ראשוניים, ועם תאים בודדים או אוכלוסיות של תאים. תכונות אלה הופכות את cADDis לכלי רב ערך לחקר דינמיקת איתות cAMP בתאים חיים.
Introduction
אדנוזין 3′,5′-מונופוספט מחזורי, cAMP, ממלא תפקיד מרכזי בתקשורת התאית ובתיאום תהליכים פיזיולוגיים שונים. cAMP פועל כשליח שני, ומעביר אותות חיצוניים מהורמונים, מוליכים עצביים או מולקולות חוץ-תאיות אחרות כדי ליזום שרשרת של אירועים תוך-תאיים1. יתר על כן, cAMP מעורב באופן מורכב במסלולי איתות שונים, כולל אלה הקשורים לקולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) וציקלזות אדניליל. הבנת התפקיד של cAMP באיתות תאי היא בסיסית לפענוח המנגנונים המורכבים העומדים בבסיס תפקודים תאיים נורמליים ופיתוח טיפולים פוטנציאליים למגוון רחב של מצבים רפואיים2.
בעבר ננקטו שיטות שונות למדידת cAMP במישרין או בעקיפין. אלה כללו תיוג רדיואקטיבי של מאגרי ATP תאיים ולאחר מכן טיהור עמודות, HPLC, בדיקות רדיואימוניות ובדיקות חיסוניות הקשורות לאנזימים 1,2. מבחני מורשת אלה מוגבלים על ידי העובדה שהם מדדי נקודת קצה, הדורשים מספר רב של דגימות כדי לבנות תגובות תלויות זמן. לאחרונה פותחו חיישני העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית (FRET) כדי ליצור בדיקות בתאים חיים, לייצר נתונים דינמיים בזמן אמת ולאפשר מיקוד חיישנים במקומות תת-תאיים שונים3. FRET ממנף שני פלואורופורים, תורם פלואורסצנטי אחד ומקבל פלואורסצנטי אחד שכאשר הוא נמצא בקרבת מקום, פלואורופור המקבל יתרגש מפלט הפלואורסצנט של התורם. שני הפלואורופורים הנפוצים ביותר הם חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) וחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מכיוון שיש להם תכונות עירור ופליטה תואמות. בנוסף ל-CFP ול-YFP, השימוש בחלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) ובחלבון הפלואורסצנטי האדום (RFP) משמש בדרך כלל עבור ביו-חיישנים של FET. חיישנים ביולוגיים של cAMP FRET פועלים על ידי תורם ומקבל בקצוות מנוגדים של חלבון הקישור של Epac2 cAMP. כריכת cAMP משנה את האישור של Epac ומגדילה את המרחק בין פלואורופוריםשל תורם ומקבל 3,4. שינוי קונפורמטיבי זה מזוהה על ידי אובדן של FRET, כלומר, עירור של פלואורופור מקבל על ידי אנרגיה המועברת מן טיפות פלואורופור התורם3. בעוד תהליך פשוט לכאורה, יש שפע של מגבלות ובעיות עם biosensor FRET עבור מחקר cAMP5. אחד מהם הוא הבחירה של חלבונים פלואורסצנטיים, למשל, GFP, אשר יכול dimerize באופן טבעי, ובכך להפחית את הרגישות6. ביו-חיישנים מבוססי CFET cAMP כוונו למיקרו-דומיינים ספציפיים7, אך ייתכנו מגבלות בשל גודלו הגדול של מבנה עם שני פלואורופורים6. בעיה משמעותית נוספת היא יחס האות לרעש הנמוך של אותות FRET כתוצאה מהחפיפה בין עירור ופליטה של הפלואורופור, וכתוצאה מכך תדירות דגימה גבוהה וניתוח מסובך של התוצאות 4,5.
לאחרונה, biosensor החדש (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis פתר מגבלות אלה ואחרות כשמדובר בחקר הרגולציה של איתות cAMP8. שיפור חשוב אחד הוא התלות בפלואורופור יחיד. הדבר מאפשר אות מהיר ויעיל עם טווח דינמי רחב יותר ויחס אות לרעש גבוה. כתוצאה מכך, יכול להיות דיוק רב יותר מכיוון שיש טווח פחות רחב של אורכי גל לסרוק דרך8. בדומה לגשושיות RET, הביו-סנסור כוון למיקומים תת-תאיים, מה שמאפשר מחקר בתיאוריית המידור וחקר רפסודות שומנים ולא רפסודות, ותחומים תת-תאיים אחרים9. אולי החשוב ביותר הוא ההתאמה של biosensor פלואורופור יחיד עבור סינון תפוקה גבוהה, אשר שיפר את הרגישות ואת יכולת השחזור על פני biosensors מבוסס FRET. הביוסנסור ארוז לתוך וקטור BacMam להתמרה קלה של מגוון רחב של סוגי תאים ושליטה מדויקת על ביטוי חלבונים.
בקרת ביטוי באמצעות וקטור BacMam יכולה להיות שימושית במיוחד בבדיקות באמצעות אורתולוגים GPCR ממינים שונים כדי להקל על פירוש נתונים ממחקרים בבעלי חיים. יתר על כן, שליטה על ביטוי הקולטן היא קריטית למדידת דרגות שונות של יעילות התרופה (למשל, אגוניסטים הפוכים ואגוניסטים חלקיים), ורמות נמוכות של ביטוי קולטן שימושיות כדי לחקות את הרמות הנמוכות הנמצאות ברקמת בעלי חיים. BacMam הוא וקטור baculovirus כי כבר שונה כדי להתמיר תאים יונקים כגון תרביות תאים ראשוניים HEK-293 שורות10. סמנים דומיננטיים הניתנים לבחירה מאפשרים ל- BacMam לספק יציבות רבה יותר על פני זיהומי פלסמיד מסורתיים11. מקדמים סלקטיביים כאלה מאפשרים העברה וביטוי גנים יעילים יותר. בנוסף, הוספת טריכוסטטין A (מעכב היסטון דאצטילאז) משפרת את רמות החלבון11. ניתן לשלוט ברמות הביטוי באמצעות הטיטר של וירוס BacMam המשמש ויש להתאים אותו לכל סוג תא. במקרה של ביוסנסור זה, חלבון פלואורסצנטי אדום או ירוק מקושר ל- Epac ב- N- ו- C-termini. כאשר cAMP נקשר, שינוי קונפורמטיבי בחיישן הביולוגי מזיז חומצות אמינו הסמוכות לחלבון הפלואורסצנטי. שינוי כזה מעביר את הספיגה מהמצב האניוני למצב הניטרלי ב-400 ננומטר, ובכך מקטין את הפלואורסצנטיות.
ישנם 90-120 GPCRs המבוטאים בתא בודד המגיבים למגוון רחב של אותות נוירוהומורליים12. לכן, ניתן לשער כי לפחות כמה עשרות GPCRs לכל תא יכולים לעורר או לעכב cAMP באמצעות צימוד Gs או Gi, בהתאמה. אמנם חלה התקדמות בניטור שליח שני זה בזמן אמת, כגון FRET, אך יש צורך בשיטות יעילות יותר. המתודולוגיה לניטור הסינתזה וההשפלה של אותות cAMP באמצעות cADDis בזמן אמת מוצגת כאן. ניתן לנטר את השינוי בפלואורסצנטיות בזמן אמת באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי למבחני תפוקה גבוהה או באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לבדיקות חד-תאיות. שיטות אלה שימושיות למגוון רחב של שאלות ביולוגיות בנוגע לאיתות GPCR באמצעות cAMP.
Protocol
Representative Results
Discussion
מדידה מדויקת ורגישה של cAMP חיונית להבנת תפקידו בתהליכים תאיים שונים ולחקר הפעילות של מסלולי איתות תלויי cAMP. ישנן מספר שיטות נפוצות למדידת רמות cAMP, כולל ELISA, radioimmunoassay, חיישנים ביולוגיים של FRET ובדיקת cAMP של GloSensor 14,15,16,17,18.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם (NHLBI) (HL169522).
Materials
| 96-well plate (clear) | Fisherbrand | 21-377-203 | |
| 35 mm dish | Greiner Bio-One | 627870 | Cell culture dishes with glass bottom |
| 96-well plate | Corning | 3904 | Black with clear flat bottom |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | For HEK and HASM media |
| BZ-X fluorescence microscope | Keyence | ||
| Calcium chloride (IM) | Quality Biological Inc | E506 | For HASM media |
| Centrifuge tube (15 mL) | Thermo Scientific | 339651 | |
| DMEM (1x) | Gibco | 11965092 | HEK media |
| DPBS with Mg2+ and Ca2+ | Gibco | 14040-133 | |
| DPBS without Mg2+ and Ca2+ | Corning | 14040-133 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11195 | For HEK and HASM media |
| Forskolin | Millipore | 344270 | Drug |
| Green Down cADDis cAMP Assay Kit | Montana Molecular | #D0200G | Reagent |
| Ham's F-12K | Gibco | 21127022 | For HASM media |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | For HASM media |
| Isoproterenol | Sigma | I6504 | Drug |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | For HASM media |
| Microcentrifuge tube (2 mL) | Eppendorf | 22363352 | |
| Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | Antibiotic for HASM media |
| RNAse away | Thermo Scientific | 700511 | Reagent |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | S2770 | For HASM media |
| Spectrmax M5 plate reader | Molecular Devices | ||
| Trichostatin A | TCI America | T2477 | Reagent |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent |
References
- Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
- Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769 (2020).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of fret measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332 (2018).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
- Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
- Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
- Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
- Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
- Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
- Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
- Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
- Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
- Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
- Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
- Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
- Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
- Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
- De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646 (2022).
- Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
- Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
- Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
- Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297 (2022).
- Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).
