Dinamica del cAMP in tempo reale in cellule vive utilizzando il rivelatore di differenza fluorescente cAMP in situ

L’adenosina 3′,5′-monofosfato ciclico, cAMP, svolge un ruolo centrale nella comunicazione cellulare e nel coordinamento di vari processi fisiologici. Il cAMP agisce come un secondo messaggero, trasmettendo segnali esterni da ormoni, neurotrasmettitori o altre molecole extracellulari per avviare una cascata di eventi intracellulari¹. Inoltre, il cAMP è coinvolto in modo complesso in varie vie di segnalazione, comprese quelle associate ai recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e alle adenilil ciclasi. Comprendere il ruolo del cAMP nella segnalazione cellulare è fondamentale per svelare i complessi meccanismi che sono alla base delle normali funzioni cellulari e per lo sviluppo di potenziali terapie per un’ampia gamma di condizioni mediche².

In passato, sono stati impiegati vari metodi per misurare il cAMP direttamente o indirettamente. Questi includevano la radiomarcatura dei pool cellulari di ATP seguita da purificazione della colonna, HPLC, saggi radioimmunologici e saggi immunologici enzimatici ^1,2. Questi saggi legacy sono limitati dal fatto che si tratta di misure end-point, che richiedono un gran numero di campioni per costruire risposte dipendenti dal tempo. Più recentemente, i sensori FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) sono stati sviluppati per creare saggi nelle cellule viventi, producendo dati dinamici in tempo reale e consentendo ai sensori di essere indirizzati in diverse posizioni subcellulari³. FRET sfrutta due fluorofori, un donatore fluorescente e un accettore fluorescente che, quando si trovano nelle immediate vicinanze, il fluoroforo accettore sarà eccitato dall’uscita fluorescente del donatore. I due fluorofori più utilizzati sono la proteina fluorescente ciano (CFP) e la proteina fluorescente gialla (YFP) poiché hanno proprietà di eccitazione ed emissione compatibili. Oltre a CFP e YFP, l’utilizzo della proteina fluorescente verde (GFP) e della proteina fluorescente rossa (RFP) è comunemente utilizzato per i biosensori FRET. I biosensori FRET cAMP funzionano con un donatore e un accettore alle estremità opposte della proteina legante il cAMP Epac2. Il legame cAMP altera la conferma di Epac e aumenta la distanza tra i fluorofori donatore e accettore ^3,4. Questo cambiamento conformazionale è rilevato da una perdita di FRET, cioè dall’eccitazione del fluoroforo accettore da parte dell’energia trasferita dalle gocce di fluoroforo donatore³. Sebbene sia un processo apparentemente semplice, ci sono molte limitazioni e problemi con il biosensore FRET per la ricerca cAMP⁵. Uno dei quali è la selezione di proteine fluorescenti, ad esempio la GFP, che possono dimerizzare naturalmente, riducendo così la sensibilità⁶. I biosensori cAMP basati su FRET sono stati mirati a specifici microdomini⁷, ma potrebbero esserci limitazioni a causa delle grandi dimensioni di un costrutto con due fluorofori⁶. Un altro problema significativo è il basso rapporto segnale/rumore dei segnali FRET risultante dalla sovrapposizione tra eccitazione ed emissione del fluoroforo, con conseguente elevata frequenza di campionamento e complicando l’analisi dei risultati ^4,5.

Più recentemente, il nuovo biosensore (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis ha risolto queste e altre limitazioni quando si tratta di studiare la regolazione della segnalazione cAMP⁸. Un miglioramento importante è la dipendenza da un singolo fluoroforo. Ciò consente di ottenere un segnale rapido ed efficiente con una gamma dinamica più ampia e un elevato rapporto segnale/rumore. Di conseguenza, ci può essere una maggiore precisione in quanto c’è una gamma meno ampia di lunghezze d’onda da pettinare⁸. Come le sonde FRET, il biosensore è stato mirato alle posizioni subcellulari, consentendo la ricerca sulla teoria della compartimentazione e l’esplorazione in zattere lipidiche e non-zattere e altri domini subcellulari⁹. Forse la cosa più importante è l’idoneità di un singolo biosensore fluoroforo per lo screening ad alto rendimento, che ha migliorato la sensibilità e la riproducibilità rispetto ai biosensori basati su FRET. Il biosensore è inserito in un vettore BacMam per una facile trasduzione di un’ampia gamma di tipi di cellule e un controllo preciso sull’espressione proteica.

Il controllo dell’espressione tramite il vettore BacMam può essere particolarmente utile nei saggi che utilizzano ortologhi GPCR di specie diverse per facilitare l’interpretazione dei dati provenienti da studi sugli animali. Inoltre, il controllo sull’espressione dei recettori è fondamentale per misurare i diversi gradi di efficacia dei farmaci (ad esempio, agonisti inversi e agonisti parziali), e bassi livelli di espressione dei recettori sono utili per imitare i bassi livelli riscontrati nei tessuti animali. BacMam è un vettore di baculovirus che è stato modificato per trasdurre cellule di mammifero come colture cellulari primarie e linee HEK-293¹⁰. I marcatori dominanti selezionabili consentono a BacMam di fornire una maggiore stabilità rispetto alle tradizionali infezioni plasmidiche¹¹. Tali promotori selettivi consentono una consegna e un’espressione genica più efficienti. Inoltre, l’aggiunta di tricostatina A (un inibitore dell’istone deacetilasi) aumenta i livelli di proteina reporter¹¹. I livelli di espressione possono essere controllati tramite il titolo del virus BacMam utilizzato e devono essere ottimizzati per ogni tipo di cellula. Nel caso di questo biosensore, una proteina fluorescente rossa o verde è legata all’Epac ai terminali N e C. Quando il cAMP si lega, un cambiamento conformazionale nel biosensore sposta gli amminoacidi adiacenti alla proteina fluorescente. Tale spostamento sposta l’assorbanza dallo stato anionico allo stato neutro a 400 nm, diminuendo così la fluorescenza.

Ci sono 90-120 GPCR espressi in una singola cellula che rispondono a un’ampia varietà di segnali neuroumorali¹². Pertanto, si può ipotizzare che almeno diverse dozzine di GPCR per cellula possano stimolare o inibire il cAMP attraverso l’accoppiamento Gs o Gi, rispettivamente. Sebbene siano stati compiuti progressi nel monitoraggio di questo secondo messenger in tempo reale, come FRET, sono necessari metodi più efficienti. Qui viene presentata la metodologia per monitorare la sintesi e la degradazione dei segnali cAMP utilizzando cADDis in tempo reale. La variazione della fluorescenza può essere monitorata in tempo reale utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza per saggi ad alta produttività o utilizzando un microscopio a fluorescenza per saggi su singola cellula. Questi metodi sono utili per un’ampia gamma di questioni biologiche riguardanti la segnalazione GPCR tramite cAMP.