Dynamique de l’AMPc en temps réel dans les cellules vivantes à l’aide du détecteur de différence AMPc fluorescent in situ
Summary
Le protocole présenté dans cette étude illustre l’efficacité du détecteur de différence AMPc in situ dans la mesure de l’AMPc à l’aide de deux méthodes. L’une des méthodes utilise un spectrophotomètre à lecture de plaques à 96 puits avec des cellules HEK-293. L’autre méthode permet de visualiser des cellules HASM individuelles au microscope fluorescent.
Abstract
cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) est un nouveau biocapteur qui permet de mesurer en continu les niveaux d’AMPc dans les cellules vivantes. Le biocapteur est créé à partir d’une protéine fluorescente permutée circulairement liée à la région charnière d’Epac2. Cela crée un biocapteur fluorophore unique qui affiche une fluorescence accrue ou diminuée lors de la liaison de l’AMPc. Le biocapteur existe en versions rouges et vertes vers le haut, ainsi qu’en versions vertes vers le bas, et en plusieurs versions rouges et vertes ciblées sur des emplacements subcellulaires. Pour illustrer l’efficacité du biocapteur, la version verte vers le bas, dont la fluorescence diminue lors de la liaison à l’AMPc, a été utilisée. Deux protocoles utilisant ce capteur sont présentés : l’un utilisant un spectrophotomètre à lecture de plaques à 96 puits compatible avec le criblage à haut débit et l’autre utilisant l’imagerie unicellulaire sur un microscope fluorescent. Sur le lecteur de plaques, les cellules HEK-293 cultivées dans des plaques à 96 puits ont été stimulées avec de la forskoline 10 μM ou de l’isoprotérénol 10 nM, ce qui a induit des diminutions rapides et importantes de la fluorescence dans la version verte descendante. Le biocapteur a été utilisé pour mesurer les niveaux d’AMPc dans des cellules individuelles de muscle lisse des voies respiratoires humaines (HASM) surveillées au microscope fluorescent. Le biocapteur vert vers le bas a montré des réponses similaires à des populations de cellules lorsqu’il a été stimulé avec de la forskoline ou de l’isoprotérénol. Ce test unicellulaire permet de visualiser l’emplacement du biocapteur à des grossissements de 20x et 40x. Ainsi, ce biocapteur d’AMPc est sensible et flexible, permettant de mesurer en temps réel l’AMPc dans les cellules immortalisées et primaires, ainsi qu’avec des cellules uniques ou des populations de cellules. Ces attributs font de cADDest un outil précieux pour étudier la dynamique de signalisation de l’AMPc dans les cellules vivantes.
Introduction
L’adénosine 3′,5′-monophosphate cyclique, AMPc, joue un rôle central dans la communication cellulaire et la coordination de divers processus physiologiques. L’AMPc agit comme un second messager, relayant les signaux externes des hormones, des neurotransmetteurs ou d’autres molécules extracellulaires pour initier une cascade d’événements intracellulaires1. De plus, l’AMPc est intimement impliquée dans diverses voies de signalisation, y compris celles associées aux récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et aux adénylyl cyclases. La compréhension du rôle de l’AMPc dans la signalisation cellulaire est fondamentale pour démêler les mécanismes complexes qui sous-tendent les fonctions cellulaires normales et le développement de thérapies potentielles pour un large éventail de conditions médicales2.
Dans le passé, diverses méthodes ont été employées pour mesurer l’AMPc directement ou indirectement. Il s’agissait notamment du radiomarquage des pools d’ATP cellulaires suivi d’une purification en colonne, d’une HPLC, de tests radio-immunologiques et d’immunotests liés à des enzymes 1,2. Ces tests hérités sont limités par le fait qu’il s’agit de mesures finales, nécessitant un grand nombre d’échantillons pour construire des réponses dépendantes du temps. Plus récemment, des capteurs FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ont été développés pour créer des tests dans des cellules vivantes, produisant des données dynamiques en temps réel et permettant aux capteurs d’être ciblés dans différents emplacements subcellulaires3. FRET exploite deux fluorophores, un donneur fluorescent et un accepteur fluorescent qui, lorsqu’ils sont à proximité, le fluorophore accepteur sera excité par la sortie fluorescente du donneur. Les deux fluorophores les plus utilisés sont la protéine fluorescente cyan (CFP) et la protéine fluorescente jaune (YFP) car elles ont des propriétés d’excitation et d’émission compatibles. En plus de la CFP et de la YFP, l’utilisation de la protéine fluorescente verte (GFP) et de la protéine fluorescente rouge (RFP) est couramment utilisée pour les biocapteurs FRET. Les biocapteurs FRET cAMP fonctionnent en ayant un donneur et un accepteur aux extrémités opposées de la protéine de liaison Epac2 cAMP. La liaison de l’AMPc modifie la confirmation de l’Epac et augmente la distance entre les fluorophores donneurs et accepteurs 3,4. Ce changement conformationnel est détecté par une perte de FRET, c’est-à-dire l’excitation du fluorophore accepteur par l’énergie transférée des gouttes de fluorophore donneuses3. Bien qu’il s’agisse d’un processus apparemment simple, le biocapteur FRET pour la recherche sur l’AMPc5 présente une multitude de limites et de problèmes. L’une d’entre elles est la sélection de protéines fluorescentes, par exemple la GFP, qui peuvent se dimériser naturellement, réduisant ainsi la sensibilité6. Les biocapteurs d’AMPc basés sur FRET ont été ciblés sur des microdomaines spécifiques7, mais il peut y avoir des limites en raison de la grande taille d’une construction avec deux fluorophores6. Un autre problème important est le faible rapport signal/bruit des signaux FRET résultant du chevauchement entre l’excitation et l’émission du fluorophore, ce qui entraîne une fréquence d’échantillonnage élevée et complique l’analyse des résultats 4,5.
Plus récemment, le nouveau biocapteur (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis, a résolu ces limitations et d’autres lorsqu’il s’agit d’étudier la régulation de la signalisation de l’AMPc8. Une amélioration importante est la dépendance à l’égard d’un seul fluorophore. Cela permet d’obtenir un signal rapide et efficace avec une plage dynamique plus large et un rapport signal/bruit élevé. Par conséquent, il peut y avoir plus de précision car il y a une gamme moins large de longueurs d’onde pour passer au peigne fin8. Comme les sondes FRET, le biocapteur a été ciblé sur des emplacements subcellulaires, ce qui a permis la recherche sur la théorie de la compartimentation et l’exploration dans les radeaux lipidiques et les non-radeaux, ainsi que dans d’autres domaines subcellulaires9. Le plus important est peut-être l’adéquation d’un seul biocapteur fluorophore pour le criblage à haut débit, qui a amélioré la sensibilité et la reproductibilité par rapport aux biocapteurs basés sur FRET. Le biocapteur est encapsulé dans un vecteur BacMam pour faciliter la transduction d’un large éventail de types de cellules et un contrôle précis de l’expression des protéines.
Le contrôle de l’expression via le vecteur BacMam peut être particulièrement utile dans les tests utilisant des orthologues GPCR de différentes espèces pour faciliter l’interprétation des données issues d’études animales. De plus, le contrôle de l’expression des récepteurs est essentiel pour mesurer les différents degrés d’efficacité des médicaments (par exemple, les agonistes inverses et les agonistes partiels), et de faibles niveaux d’expression des récepteurs sont utiles pour imiter les faibles niveaux trouvés dans les tissus animaux. BacMam est un vecteur de baculovirus qui a été modifié pour transduire des cellules de mammifères telles que des cultures cellulaires primaires et les lignées10 de HEK-293. Les marqueurs dominants sélectionnables permettent à BacMam d’offrir une plus grande stabilité par rapport aux infections plasmidiques traditionnelles11. De tels promoteurs sélectifs permettent une livraison et une expression plus efficaces des gènes. De plus, l’ajout de trichostatine A (un inhibiteur de l’histone désacétylase) augmente les niveaux de protéine rapporteure11. Les niveaux d’expression peuvent être contrôlés via le titre du virus BacMam utilisé et doivent être optimisés pour chaque type de cellule. Dans le cas de ce biocapteur, une protéine fluorescente rouge ou verte est liée à l’Epac aux extrémités N et C. Lorsque l’AMPc se lie, un changement conformationnel dans le biocapteur déplace les acides aminés adjacents à la protéine fluorescente. Un tel décalage déplace l’absorbance de l’état anionique à l’état neutre à 400 nm, diminuant ainsi la fluorescence.
Il existe 90 à 120 RCPG exprimés dans une seule cellule qui répondent à une grande variété de signaux neurohumoraux12. Par conséquent, on peut supposer qu’au moins plusieurs dizaines de RCPG par cellule peuvent stimuler ou inhiber l’AMPc par le couplage Gs ou Gi, respectivement. Bien qu’il y ait eu des progrès dans la surveillance de ce deuxième messager en temps réel, comme le FRET, des méthodes plus efficaces sont nécessaires. La méthodologie de surveillance de la synthèse et de la dégradation des signaux d’AMPc à l’aide de cADDis en temps réel est présentée ici. Le changement de fluorescence peut être surveillé en temps réel à l’aide d’un lecteur de plaques de fluorescence pour les tests à haut débit ou à l’aide d’un microscope fluorescent pour les tests unicellulaires. Ces méthodes sont utiles pour un large éventail de questions biologiques concernant la signalisation des RCPG via l’AMPc.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une mesure précise et sensible de l’AMPc est cruciale pour comprendre son rôle dans divers processus cellulaires et pour étudier l’activité des voies de signalisation dépendantes de l’AMPc. Il existe plusieurs méthodes couramment utilisées pour mesurer les niveaux d’AMPc, notamment l’ELISA, le dosage radio-immunologique, les biocapteurs FRET et le test GloSensorcAMP 14,15,16,17,18.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (HL169522).
Materials
| 96-well plate (clear) | Fisherbrand | 21-377-203 | |
| 35 mm dish | Greiner Bio-One | 627870 | Cell culture dishes with glass bottom |
| 96-well plate | Corning | 3904 | Black with clear flat bottom |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | For HEK and HASM media |
| BZ-X fluorescence microscope | Keyence | ||
| Calcium chloride (IM) | Quality Biological Inc | E506 | For HASM media |
| Centrifuge tube (15 mL) | Thermo Scientific | 339651 | |
| DMEM (1x) | Gibco | 11965092 | HEK media |
| DPBS with Mg2+ and Ca2+ | Gibco | 14040-133 | |
| DPBS without Mg2+ and Ca2+ | Corning | 14040-133 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11195 | For HEK and HASM media |
| Forskolin | Millipore | 344270 | Drug |
| Green Down cADDis cAMP Assay Kit | Montana Molecular | #D0200G | Reagent |
| Ham's F-12K | Gibco | 21127022 | For HASM media |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | For HASM media |
| Isoproterenol | Sigma | I6504 | Drug |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | For HASM media |
| Microcentrifuge tube (2 mL) | Eppendorf | 22363352 | |
| Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | Antibiotic for HASM media |
| RNAse away | Thermo Scientific | 700511 | Reagent |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | S2770 | For HASM media |
| Spectrmax M5 plate reader | Molecular Devices | ||
| Trichostatin A | TCI America | T2477 | Reagent |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent |
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