Trasformazione e rigenerazione delle radici pelose in Arabidopsis thaliana e Brassica napus

1. Preparazione dei terreni e delle soluzioni Preparare le soluzioni madre ormonali.Per la preparazione di 50 mL di soluzione madre di acido 1-naftaleneacetico (NAA), 6-benzilamminopurina (BAP) e acido indolo-3-butirrico (IBA) con una concentrazione di 5 mg/mL, sciogliere 250 mg dell’ormone in polvere in 2 mL di idrossido di sodio 1 M (NaOH) e regolare il volume a 50 mL con acqua ultrapura. Per preparare 50 mL di acido gibberellico (GA3) con una concentrazione di 1 mg/mL, sciogliere 50 mg dell’ormone in polvere in 2 mL di etanolo e regolare il volume a 50 mL di acqua ultrapura. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro per siringa sterile con una dimensione dei pori di 0,22 μm e distribuirla in provette sterili da 2 mL per la conservazione. Conservare la soluzione a -20 °C o 4 °C, a seconda delle raccomandazioni del produttore. Preparare le soluzioni madre di antibiotici. Per 50 mL di soluzione madre disodica di cefotaxima e ticarcillina con una concentrazione di 100 mg/mL, sciogliere 0,5 g dell’antibiotico in polvere in 40 mL di acqua ultrapura e portare a un volume finale di 50 mL. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro per siringa sterile con una dimensione dei pori di 0,22 μm e distribuirla in provette sterili da 2 mL per la conservazione. Conservare la soluzione a -20 °C.NOTA: Antibiotici e ormoni vengono sempre aggiunti al mezzo raffreddato. Preparare 1 L di terreno di Luria Broth (LB) aggiungendo 10 g di bacto-triptone, 5 g di estratto di lievito e 5 g di cloruro di sodio (NaCl) in un cilindro graduato da 1 L e regolare il volume a 1 L con acqua bidistillata. Regolare il pH a 7.0 con KOH con un pHmetro (seguendo le istruzioni del produttore). Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L e aggiungere 15 g di agar batteriologico (1,5%), se si prepara un terreno solido e sterilizzare in autoclave il terreno. Se necessario, aggiungere gli antibiotici appropriati (la resistenza batterica è trasportata sul vettore binario) al mezzo raffreddato.NOTA: Utilizzare un’autoclave per sterilizzare la soluzione. Mettere il flacone nel cestello, chiudere il coperchio e sterilizzarlo per 20 minuti a 121 °C e 98,9 kPa. Questo protocollo viene sempre utilizzato per le soluzioni in autoclave nelle fasi successive. Preparare 1 L di Yeast Extract Beef (YEB) medium mescolando 5 g di estratto di manzo, 1 g di estratto di lievito, 5 g di peptone, 5 g di saccarosio e 0,5 g di cloruro di magnesio (MgCl2 ) in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L. Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L. Autoclavare il mezzo. Preparare 1 L di terreno per la germinazione dei semi mescolando 2,2 g di polvere di Murashige e Skoog (MS), 10 g di saccarosio (1%) e 0,5 g di sali di sodio dell’acido 2-(N-morfolino)etanasolfonico (MES) in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L, mescolare e regolare il pH a 5,8 con KOH. Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L e aggiungere 8 g di agar vegetale (0,8%). Autoclavare il mezzo. Preparare 1 L di terreno di coltura mescolando 2,2 g di polvere di MS, 5 g di saccarosio (0,5%) e 0,5 g di sali MES in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L, mescolare e regolare il pH a 5,8 con KOH. Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L e aggiungere 8 g di agar vegetale (0,8%). Autoclavare il mezzo. Preparare 1 L di terreno di coltura delle radici pelose mescolando 4,4 g di vitamine MS + B5 in polvere, 30 g di saccarosio (3%) e 0,5 g di sali MES in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L, mescolare e regolare il pH a 5,8 con KOH e trasferire la soluzione in una bottiglia da 1 L. Aggiungere 3 g di gelificante (0,3%) e sterilizzare in autoclave il terreno. Aggiungere cefotaxima e ticarcillina disodica a una concentrazione finale di 100 – 200 mg/L e 100 – 500 mg/L, rispettivamente. Se necessario, aggiungere gli antibiotici appropriati (la resistenza è dovuta al T-DNA di un vettore binario). Preparare 1 L di terreno di coltura composito mescolando 2,2 g di vitamine MS + B5 in polvere, 10 g di saccarosio (1%) e 0,5 g di sali MES in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L, mescolare e regolare il pH a 5,8 con KOH e trasferire la soluzione in un flacone da 1 L. Aggiungere 6 g di gelificante (0,6%) e sterilizzare in autoclave il terreno. Aggiungere cefotaxima e ticarcillina disodica a una concentrazione finale di 200 mg/L e 500 mg/L, rispettivamente. Se necessario, aggiungere gli antibiotici appropriati (la resistenza è dovuta al T-DNA di un vettore binario). Preparare 1 L di terreno di rigenerazione mescolando 4,4 g di vitamine MS + B5 in polvere, 30 g di saccarosio (3%) e 0,5 g di sali MES in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L, mescolare e regolare il pH a 5,8 con KOH. Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L e aggiungere 3 g di gelificante (0,3%). Autoclavare il mezzo. Aggiungere NAA e BAP a una concentrazione finale di 8 mg/L e 5 mg/L, rispettivamente, e ticarcillina disodica a una concentrazione finale di 100 mg/L. Preparare 1 L di terreno di allungamento dei germogli mescolando 4,4 g di vitamine MS + B5 in polvere, 20 g di saccarosio (2%) e 0,5 g di sali MES in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L, mescolare e regolare il pH a 5,8 con KOH. Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L e aggiungere 3 g di agar vegetale (0,3%). Autoclavare il mezzo. Aggiungere BAP e GA3 a una concentrazione finale di 0,5 mg/L e 0,03 mg/L, rispettivamente, e cefotaxima a una concentrazione finale di 100 mg/L. Preparare 1 litro di terreno di induzione radicolare mescolando 2,2 g di vitamine MS + B5 in polvere, 10 g di saccarosio (1%) e 0,5 g di sali MES in acqua bidistillata. Regolare il volume a 1 L, mescolare e regolare il pH a 5,8 con KOH. Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L e aggiungere 3 g di gelificante (0,3%). Autoclavare il mezzo. Aggiungere IBA e cefotaxima a una concentrazione finale di 0,5 mg/L e 100 mg/L, rispettivamente. Preparare 1 L di tampone al bromuro di cetiltrimetilammonio (CTAB) aggiungendo 20 g di CTAB (2% p/v finale), 100 mL di 1M Tris-HCl, pH 8,0 (100 mM finale), 40 mL di EDTA 0,5 M, pH 8,0 (20 mM finale), 81,8 g di NaCl (1,4% p/v finale) e 5 g di PVP40 (0,5% p/v finale). Regolare a 1 L con acqua bidistillata. Autoclavare la soluzione. Conservare la soluzione per un massimo di 1 anno a temperatura ambiente. 2. Trasformazione di Agrobacterium con un vettore binario Preparare il DNA di un plasmide binario verificato contenente la cassetta T-DNA da integrare nel genoma della pianta. Assicurarsi che il DNA plasmidico contenga pochi sali per evitare scintille elettriche durante l’uso dell’elettroporazione. Si consiglia di utilizzare un kit di estrazione del DNA plasmidico a scelta. Preparare cellule elettrocompetenti di Agrobacterium tumefaciens C58C1 contenenti il plasmide pRiA4b che induce la radice pelosa inoculando 200 mL di YEB liquido preriscaldato (28 °C) con 8 mL di una coltura fresca durante la notte. Incubare la coltura a 28 °C agitando fino a quando la densità ottica a 600 nm (OD600) è di circa 0,5, corrispondente alla fase logaritmica intermedia. Ci vogliono circa 4 – 5 ore. Dividere la coltura di Agrobacterium in quattro provette da centrifuga sterili da 50 mL pre-raffreddate. Centrifugare per 15 minuti a 4 °C a 3.200 x g.NOTA: Le celle devono essere mantenute fredde da questa fase in poi. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in (4x) 2,5 mL di glicerolo freddo (4 °C) al 10%. Aggiungere altri 47,5 ml di glicerolo freddo al 10% e mescolare delicatamente. Celle a pellet a 3.200 x g per 15 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in (4x) 10 mL di glicerolo freddo al 10%. Pellettare nuovamente le cellule e risospenderle in (4x) 0,75 mL di glicerolo freddo al 10%. Raggruppare il contenuto di tutte e quattro le provette in una (volume totale = 3 ml). Dividere la soluzione agrobatterica in aliquote da 50 μL in microprovette sterili da 1,5 mL pre-raffreddate. Congelare le aliquote su ghiaccio secco o azoto liquido. Conservare le provette a -80 °C per un uso futuro. Mettere una provetta di cellule competenti (50 μL) sul ghiaccio, mescolare con 5 μL di DNA plasmidico (1 μg in totale, dal punto 2.1), trasferire la miscela in una cuvetta per elettroporazione (0,2 cm di spazio) e incubare per 5 minuti su ghiaccio. Posizionare la cuvetta nell’elettroporatore ed elettroporare le celle con le seguenti impostazioni: capacità 25 μFD, resistenza 400 Ω, tensione elettrica 2,5 kV, durata dell’impulso 9,7 ms. Aggiungere 950 μL di terreno liquido LB alle cellule, che vengono poi coltivate a 28 °C per 2 ore a 300 giri/min in un termomiscelatore. Placcare 50 μL della coltura cellulare su un terreno solido LB con l’antibiotico selettivo appropriato. Lasciare in coltura le piastre per 2 giorni a 28 °C.NOTA: Si consiglia di calibrare una serie di colture cellulari (10 μL – 100 μL) per piastra per determinare un volume di coltura adeguato ed evitare la crescita eccessiva di batteri. Preparare colture liquide da alcune colonie selezionate in 5 mL di terreno liquido LB con antibiotici. Far crescere i batteri durante la notte a 28 °C con agitazione. Utilizzare queste colture per le scorte di glicerolo mescolando 0,5 mL di coltura batterica liquida e 0,5 mL di glicerolo al 40%.NOTA: La presenza del transgene in queste colonie viene verificata mediante PCR delle colonie. A tale scopo, aggiungere una piccola quantità di una colonia da una piastra alla miscela master PCR contenente tampone, dNTP e Taq polimerasi a scelta, insieme a primer che amplificano una parte del T-DNA da un vettore binario. L’inoculo proveniente dalle scorte di glicerolo viene utilizzato per la trasformazione delle piante. 3. Trasformazione della radice pelosa di Brassica napus DH12075 Mettere i semi di Brassica napus DH12075 in microprovette e sterilizzarli in una flow box. Per prima cosa, sgrassare i semi con acqua e detersivo allo 0,1% agitando per 60 s. Quindi, sciacquare i semi con acqua seguita da etanolo al 70%, entrambi per 60 s. Sterilizzare i semi utilizzando una soluzione al 10% di candeggina commerciale contenente ipoclorito di sodio. Agitare i semi in questa soluzione per 20 min. Lavare i semi 4 volte con acqua sterile per 60 secondi ciascuno. Mettili su piastre di Petri contenenti il terreno di germinazione del seme. Stratificare a freddo i semi a 4 °C per una notte e spostare le piastre in una stanza di coltivazione (21 °C, 16 h luce / 8 h buio). Trasferisci le piantine di 5 giorni in scatole di coltura contenenti un terreno di coltura per piante .NOTA: La migliore efficienza di trasformazione in DH12075 è stata identificata per le piantine di 18 giorni. L’età della piantina può essere ottimizzata per le condizioni di crescita locali o per altre cultivar. Inoculare una coltura liquida di Agrobacterium tumefaciens C58C1 contenente un plasmide peloso che induce le radici pRiA4b e il vettore binario per la trasformazione (dal punto 2.11) con un’ansa di inoculazione. Utilizzare 5 mL di terreno LB. Coltivare questa coltura per una notte a 28 °C fino a raggiungere OD600 = 0,9 – 1.NOTA: L’Agrobacterium contenente solo il plasmide Ri viene utilizzato se vengono prodotte radici pelose di tipo selvatico. Iniettare una piccola quantità di coltura (circa 50 μL) con una siringa da insulina nell’ipocotile di una piantina di 18 giorni (dal punto 3.4.). Perforare l’ipocotile con un ago da 26G montato sulla siringa a circa 1 cm sopra la superficie del mezzo. Iniettare il liquido nella ferita. Anche il tessuto sulla superficie dell’ipocotile può essere graffiato dalla siringa.NOTA: Il numero di piantine inoculate deve essere adattato alle esigenze dello sperimentatore. Rimettere le piante nella stanza di coltivazione a 21 °C per 2-4 settimane fino a quando non si formano un callo e radici pelose nel sito di ferita. Tagliare il callo con le radici pelose emerse dall’ipocotile e posizionarlo su una capsula di Petri con il terreno di crescita della radice pelosa contenente antibiotici selettivi (trasportati dal T-DNA) e cefotaxima (200 mg/L) e ticarcillina (500 mg/L) per sopprimere la crescita agrobatterica. Sigillare le piastre di Petri con nastro adesivo permeabile ai gas. Coltiva le radici pelose a 24 °C al buio.NOTA: La corretta concentrazione di antibiotici specifici utilizzati per la selezione funzionale deve essere testata con radici pelose di tipo selvatico. Per B. napus DH12075 radici pelose resistenti alla kanamicina, viene utilizzata una concentrazione di 25 mg/L di kanamicina.NOTA: In questa fase, è possibile generare una pianta composita costituita dal germoglio selvatico e dalle radici pelose transgeniche che supportano la crescita di tale pianta. Invece di tagliare le radici pelose da uno stelo, le radici native della pianta vengono rimosse. La pianta con radici pelose emergenti viene trasferita in una scatola di coltura vegetale con un terreno di coltura composito contenente cefotaxima (200 mg/L) e ticarcillina (500 mg/L) per sopprimere la crescita agrobatterica e l’antibiotico selettivo (trasportato dal T-DNA). Dopo 1-2 settimane, isolare le radici pelose sulla piastra di Petri dal callo e individualizzarle su piastre con lo stesso terreno di coltura. Trasferisci la coltura in un piatto fresco ogni 4 o 5 settimane. Aggiungere 0,25 mg/L di IBA per aumentare la ramificazione delle radici. Ridurre gradualmente le concentrazioni di cefotaxima e ticarcillina ad ogni trasferimento di 100 mg/L (cioè, il terreno per il primo trasferimento contiene 100 mg/L di cefotaxima e 400 mg/L di ticarcillina; per il secondo trasferimento, 300 mg/L di ticarcillina, ecc.). Dopo 3-4 mesi, coltivare le radici pelose su un terreno di coltura delle radici pelose con 100 mg/L di ticarcillina e l’antibiotico selettivo. 4. Rigenerazione di Brassica napus DH12075 radici pelose Trasferire le linee radicali pelose indipendenti su piastre con terreno di rigenerazione in condizioni sterili utilizzando una pinzetta, fiammata prima dell’uso. Trasferire 5 – 10 radici per capsula di Petri e coltivarle a 21 °C in un fotoperiodo di lunga durata (16 h di luce / 8 h di buio). Sigillare le piastre di Petri con nastro adesivo permeabile ai gas. Ogni 3 o 4 settimane, trasferisci le radici pelose su piastre con terreno di rigenerazione fresco. Si noti che le calli si formano dopo circa 2 settimane. Il callo inizia a sparare dopo altre 2 settimane fino a 8-9 settimane dopo la formazione del callo. Individualizza i germogli e trasferiscili in scatole di coltura per piante con terreno di allungamento dei germogli per 2 o 3 settimane per favorire l’allungamento dei germogli. Trasferisci i germogli allungati in scatole di coltura per piante con un terreno di induzione radicale. Aggiorna la coltura ogni 3-4 settimane. L’efficienza di radicazione in DH12075 è dell’87% a 30 giorni e fino al 100% dopo 60 giorni. Trasferisci le piante radicate nel terreno dopo aver rimosso eventuali tracce di gelificante per prevenire l’infezione fungina. Assicurarsi che le piante siano prima acclimatate nei fitotroni (21 °C, fotoperiodo a giorno lungo, 150 μE) e poi trasferirle in una serra per la fioritura (21 °C / 18 °C, fotoperiodo a giorno lungo, 150 μE). 5. Selezione del rigenerante e della pianta T1 NOTA: Le linee radicali pelose possono essere selezionate prima di entrare nel processo di rigenerazione. Il tipo di selezione dipende dal contenuto trasportato dal transgene. Le radici pelose possono essere campionate per l’estrazione del DNA e la genotipizzazione o il rilevamento di mutazioni, l’estrazione dell’RNA con successiva sintesi di cDNA e la RT-qPCR per l’analisi del livello di espressione del gene scelto, la microscopia per il rilevamento della fluorescenza o il trattamento per la colorazione GUS. Dopo il trasferimento in terra, genotipizzare nuovamente le piante rigeneranti T0 (e le piantine T1) per evitare fughe dalle procedure di selezione. Le piante T0 presentano un fenotipo alterato chiamato fenotipo Ri: crescita estesa delle radici, foglie arricciate e germogli nani causati dalla presenza del TL e/o del TR-DNA del plasmide Ri inserito nel genoma della pianta. Per accelerare la selezione T1, utilizzare i semi contenenti embrioni verdi maturi (circa 21 – 28 giorni dopo l’impollinazione per DH12075 per un embrione siluro o più vecchio) da piante rigeneranti T0 per il salvataggio degli embrioni.Lavorare nella scatola di flusso sterile. Raccogliere le silique e sterilizzarle in superficie con etanolo al 70%. Posizionali su un nastro biadesivo fissato con nastro adesivo su un coperchio di piatto o su un vetrino. Utilizzando uno stereo-binocolo, tagliare la silique lungo i margini della valvola utilizzando un ago da 26G. Assicurati che il taglio non danneggi i semi. Per una facile presa, montare l’ago su una siringa da 1 ml. Aprite i carpelli e incollateli al nastro. Raccogli i semi immaturi e trasferiscili in piastre con terreno per la germinazione dei semi. Sigillare le piastre con nastro adesivo permeabile ai gas. Posizionare le piastre in una stanza di coltivazione (21 °C, 16 h di luce / 8 h di buio) fino alla germinazione. Genotipizzare le piantine T1 per la presenza del transgene di interesse e l’assenza del Ri TR/TL (Figura 1). Raccogli il materiale fogliare ed estrai il loro DNA utilizzando il metodo scelto. Il metodo CTAB è descritto di seguito:Raccogliere il materiale fogliare in una microprovetta da 2 mL contenente due perle di ceramica. Congelare il tubo in azoto liquido. Macinare il materiale utilizzando un mulino a sfere. In alternativa, si possono usare pestello e mortaio. Dopo una rapida centrifugazione, aggiungere 400 μL di tampone CTAB alla polvere. Vorticare brevemente, centrifugare e incubare a 60 °C per almeno 50 minuti. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente per 15 min. Aggiungere un volume di cloroformio e mescolare delicatamente.ATTENZIONE: Quando si utilizza il cloroformio, lavorare sotto il flusso chimico e utilizzare guanti per proteggersi. Qualsiasi soluzione contenente cloroformio deve essere gettata nell’apposito cestino. Centrifugare per 5 minuti a 18.400 x g utilizzando una centrifuga da tavolo. Trasferire 250 – 350 μL della fase acquosa superiore in una nuova microprovetta. Omettete l’interfase. Aggiungere un volume di isopropanolo, mescolare bene e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare per 40 minuti a 18.400 x g. Scartare il liquido e aggiungere 200 μL di etanolo al 70%. Lavare il pellet e centrifugare per 15 minuti a 18.400 x g. Scartare il liquido. Asciugare il pellet all’aria e aggiungere 50 – 100 μL di acqua ultrapura. Lasciare sciogliere il DNA per 1 ora o tutta la notte in frigorifero. Eseguire una genotipizzazione mediante PCR per il gene rolA (TL), il gene aux1 (TR) e il locus virC (Agrobacterium). Preparare la reazione PCR utilizzando il DNA preparato (dal passaggio 5.3.), primer, tampone, dNTP e Taq polimerasi secondo il protocollo del produttore. I frammenti amplificati sono lunghi 200 – 500 bp.Primer specifici per rolA:Attaccante: GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAGRetromarcia: TGCGTATTAATCCCGTAGGTCPrimer specifici per aux1:Attaccante: CATAGGATCGCCTCACAGGTRovescio: CGTTGCTTGATGTCAGGAGAPrimer specifici per virC:Avanti: AATGCGTCTCTCTCTCGTGCATRovescio: AAACCGACCACTAACGCGATNOTA: Il trasferimento e l’integrazione del T-DNA potrebbero essere parziali e solo parti di TL e/o TR potrebbero integrarsi nel genoma. Pertanto, si raccomanda di analizzare la presenza di altri ORF di TL (ad esempio, rolB e rolC) e TR (aux2, mas1, ags1) nelle piantine T1. Le sequenze di primer specifiche per questi loci sono elencate in Jedličková et al.9. Valutare le reazioni di PCR mediante elettroforesi su gel.NOTA: Si raccomanda di includere un controllo positivo in questa analisi per garantire la presenza di DNA di grado PCR. Selezionare la presenza (o l’assenza) del transgene secondo i protocolli in base al contenuto di questo transgene. Trasferisci le piantine selezionate sul terreno. 6. Trasformazione e rigenerazione delle radici pelose in Arabidopsis thaliana Col-0 Sterilizzare in superficie i semi di A. thaliana con un metodo a scelta (candeggina, etanolo o cloro gassoso). Piastra i semi sterili su un terreno per la germinazione dei semi. Dopo 2 giorni di stratificazione a freddo, spostare le piastre in una stanza di coltivazione (21 °C con fotoperiodo a giorno lungo e 50% di umidità). Trasferisci le piantine di 1 settimana in una scatola di coltura vegetale con terreno di coltura per piante. Preparare le colture di Agrobacterium come indicato al punto 3.5. Iniettare una piccola quantità di coltura (circa 50 μL) con un ago montato su una siringa da insulina alla base del gambo dell’infiorescenza primaria (circa 1-2 cm sopra la rosetta) di piantine di Arabidopsis di 1 mese. Anche il tessuto sulla superficie dello stelo primario può essere graffiato dalla siringa. A 2-4 settimane dall’iniezione, asportare le radici pelose emergenti e coltivarle su piastre di Petri con il terreno di crescita delle radici pelose integrato con l’antibiotico selettivo (trasportato dal T-DNA) e cefotaxima (200 mg/L) e ticarcillina (500 mg/L) per sopprimere la crescita agrobatterica. Incubare le piastre a 24 °C al buio. Dopo 1-2 settimane, individuare le radici pelose su piastre con lo stesso terreno di coltura. Trasferire le linee radicali pelose selezionate su un terreno fresco ogni 4-5 settimane.NOTA: Le radici pelose di A. thaliana sono più sottili di quelle di B. napus e bisogna prestare attenzione quando si trasferiscono su terreni freschi. Trasferire le radici pelose in piastre con terreno di rigenerazione per indurre la formazione di calli. Coltivare le piastre a 21 °C in un fotoperiodo a giorno lungo (16 ore di luce / 8 ore di buio). I germogli emergono dal callo dopo 18-21 giorni di coltivazione. Tagliare i germogli e trasferirli in un terreno di allungamento dei germogli per 2-3 settimane per favorire la crescita e l’allungamento. Trasferisci i germogli allungati nel mezzo di induzione della radice. Trasferisci le piante radicate nel terreno. Le piante T0 presentano anche un fenotipo Ri. Eseguire la selezione transgenica, come descritto per B. napus DH12075 (fase 5).