シロイヌナズナとアブラナ属の毛根の変形と再生

1. 培地と溶液の調製 ホルモンストック溶液を調製します。濃度5 mg/mLの1-ナフタレン酢酸(NAA)、6-ベンジルアミノプリン(BAP)、およびインドール-3-酪酸(IBA)原液50 mLを調製する場合は、粉末ホルモン250 mgを1 M水酸化ナトリウム(NaOH)2 mLに溶解し、超純水で容量を50 mLに調整します。 濃度1 mg/mLのジベレリン酸(GA3)50 mLを調製するには、粉末ホルモン50 mgを2 mLのエタノールに溶解し、容量を50 mLの超純水に調整します。 孔径0.22 μmの滅菌シリンジフィルターを使用して溶液をろ過し、滅菌済み2 mLチューブに分配して保存します。メーカーの推奨に応じて、溶液を-20°Cまたは4°Cで保存してください。 抗生物質ストック溶液を調製します。濃度100 mg/mLのセフォタキシムおよびチカルシリン二ナトリウム原液50 mLの場合、粉末抗生物質0.5 gを40 mLの超純水に溶解し、最終容量50 mLに調整します。孔径0.22 μmの滅菌シリンジフィルターを使用して溶液をろ過し、滅菌済み2 mLチューブに分配して保存します。溶液を-20°Cで保存します。注:抗生物質とホルモン剤は、常に冷却された培地に添加されます。 1Lのメスシリンダーにバクトトリプトン10g、酵母エキス5g、塩化ナトリウム(NaCl)5gを加えてルリアブロス(LB)培地1Lを調製し、二重蒸留水で容量を1Lに調整します。pHメーターを使用してKOHでpHを7.0に調整します(製造元の指示に従ってください)。溶液を1Lボトルに移し、固形培地が調製されている場合は15gの細菌寒天培地(1.5%)を加え、培地をオートクレーブします。必要に応じて、適切な抗生物質(細菌耐性はバイナリーベクターに運ばれます)を冷却培地に加えます。注意: オートクレーブを使用して溶液を滅菌します。ボトルをバスケットに入れ、蓋を閉め、121°C、98.9kPaで20分間殺菌します。このプロトコルは、以降のステップでオートクレーブ溶液に常に使用されます。 牛肉エキス5g、酵母エキス1g、ペプトン5g、ショ糖5g、塩化マグネシウム(MgCl2)0.5gを混合して、酵母エキスビーフ(YEB)培地1Lを調製します。容量を1Lに調整し、溶液を1Lのボトルに移します。培地をオートクレーブします。 2重とスクーグ(MS)粉末2.2g、ショ糖(1%)10g、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)ナトリウム塩0.5gを二重蒸留水に混合して、種子発芽用培地1Lを調製します。容量を1Lに調整し、混合し、KOHでpHを5.8に調整します。溶液を1Lボトルに移し、8gの植物寒天(0.8%)を加えます。培地をオートクレーブします。 2.2gのMS粉末、5gのスクロース(0.5%)、および0.5gのMES塩を二重蒸留水に混合して、1Lの植物成長培地を調製します。容量を1Lに調整し、混合し、KOHでpHを5.8に調整します。溶液を1Lボトルに移し、8gの植物寒天(0.8%)を加えます。培地をオートクレーブします。 4.4 gのMS + B5ビタミン粉末、30 gのスクロース(3%)、および0.5 gのMES塩を二重蒸留水に混合して、1 Lの毛根成長培地を調製します。容量を1Lに調整し、KOHで混合し、pHを5.8に調整し、溶液を1Lのボトルに移します。ゲル化剤3g(0.3%)を加え、培地をオートクレーブします。セフォタキシムとチカルシリン二ナトリウムをそれぞれ100〜200 mg / Lおよび100〜500 mg / Lの最終濃度に添加します。.必要に応じて、適切な抗生物質を添加します(耐性はバイナリーベクターのT-DNAによるものです)。 2.2gのMS + B5ビタミン粉末、10gのスクロース(1%)、および0.5gのMES塩を二重蒸留水に混合して、1Lの複合植物成長培地を調製します。容量を1Lに調整し、KOHで混合し、pHを5.8に調整し、溶液を1Lのボトルに移します。6gのゲル化剤(0.6%)を加え、培地をオートクレーブします。セフォタキシムとチカルシリン二ナトリウムをそれぞれ200 mg / Lと500 mg / Lの最終濃度に添加します。.必要に応じて、適切な抗生物質を添加します(耐性はバイナリーベクターのT-DNAによるものです)。 4.4gのMS + B5ビタミン粉末、30gのスクロース(3%)、および0.5gのMES塩を二重蒸留水に混合して、1Lの再生培地を調製します。容量を1Lに調整し、混合し、KOHでpHを5.8に調整します。溶液を1Lボトルに移し、ゲル化剤3g(0.3%)を加えます。培地をオートクレーブします。NAA と BAP をそれぞれ最終濃度 8 mg/L と 5 mg/L に添加し、チカルシリン二ナトリウムを最終濃度 100 mg/L にします。 4.4gのMS + B5ビタミン粉末、20gのスクロース(2%)、および0.5gのMES塩を二重蒸留水に混合して、1Lのシュート伸長培地を調製します。容量を1Lに調整し、混合し、KOHでpHを5.8に調整します。溶液を1Lのボトルに移し、3gの植物寒天(0.3%)を加えます。培地をオートクレーブします。BAP と GA3 をそれぞれ最終濃度 0.5 mg/L と 0.03 mg/L に添加し、セフォタキシムを最終濃度 100 mg/L にします。 2.2 gのMS + B5ビタミン粉末、10 gのスクロース(1%)、および0.5 gのMES塩を二重蒸留水に混合して、1 Lの根誘導培地を調製します。容量を1Lに調整し、混合し、KOHでpHを5.8に調整します。溶液を1Lボトルに移し、ゲル化剤3g(0.3%)を加えます。培地をオートクレーブします。IBAとセフォタキシムをそれぞれ0.5 mg / Lと100 mg / Lの最終濃度に添加します。 20 g の CTAB(2% w/v final)、100 mL の 1M Tris-HCl、pH 8.0(100 mM 最終)、40 mL の 0.5 M EDTA、pH 8.0(20 mM の最終)、81.8 g の NaCl(1.4 M の最終)、5 g の PVP40(0.5% w/v final)を加えて、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)バッファー 1 L を調製します。二重蒸留水で1Lに調整します。溶液をオートクレーブします。溶液を室温で最長1年間保存します。 2. バイナリーベクターによるアグロバクテリウムの形質転換 植物ゲノムに組み込むT-DNAカセットを含む検証済みのバイナリープラスミドのDNAを調製します。プラスミドDNAには、エレクトロポレーション使用時の電気火花を避けるために、低塩分が含まれていることを確認してください。プラスミドDNA抽出キットの使用を推奨します。 毛根誘導プラスミドpRiA4bを含むエレクトロコンピテントA58C1細胞を、予熱(28°C)した200 mLの液体と8 mLの新鮮な一晩培養液を接種して調製します。600 nm(OD600)での光学濃度が約0.5(中対数相に相当)になるまで振とうしながら、28°Cで培養液をインキュベートします。所要時間は約4〜5時間です。 アグロバクテリウム培養液を、事前に冷やした4本の滅菌済み50 mL遠心チューブに分けます。3,200 x g、4°Cで15分間遠心分離します。注:このステップ以降、セルは冷たく保つ必要があります。 上清を除去し、ペレットを冷(4°C)2.5 mLの冷(4°C)10%グリセロールに穏やかに再懸濁します。さらに47.5 mLの冷たい10%グリセロールを加え、穏やかに混合します。 細胞を3,200 x g で4°Cで15分間ペレット化します。 上清を廃棄し、細胞を(4x)10 mLの冷たい10%グリセロールに再懸濁します。 細胞を再度ペレット化し、0.75 mLの冷たい10%グリセロールに(4x)再懸濁します。4 本のチューブすべての内容物を 1 本にプールします(総量 = 3 mL)。 アグロバクテリア溶液を50 μLのアリコートに分け、事前に冷やした滅菌済みの1.5 mLマイクロチューブに入れます。アリコートをドライアイスまたは液体窒素で凍結します。チューブは、将来の使用のために-80°Cで保管してください。 コンピテントセルチューブ1本(50 μL)を氷上に置き、プラスミドDNA(ステップ2.1から合計1 μg)5 μLと混合し、エレクトロポレーションキュベット(0.2 cmのギャップ)に移し、氷上で5分間インキュベートします。 キュベットをエレクトロポレーターに入れ、静電容量25μFD、抵抗400 Ω、電圧2.5kV、パルス幅9.7msの設定でセルをエレクトロポレーションします。 950 μLのLB液体培地を細胞に加え、サーモミキサーで28°C、300rpmで2時間培養します。細胞培養物50 μLを、適切な選択的抗生物質を含む固体LB培地に播種します。プレートを28°Cで2日間培養します。注:適切な培養量を決定し、細菌の異常増殖を避けるために、プレートごとにさまざまな細胞培養(10 μL – 100 μL)をプレーティングすることをお勧めします。 抗生物質を含む5 mLのLB液体培地で、選択したいくつかのコロニーから液体培養物を調製します。28°Cで一晩振とうしながらバクテリアを増殖させます。0.5 mLの液体細菌培養物と0.5 mLの40%グリセロールを混合して、これらの培養物をグリセロールストックに使用します。注:これらのコロニーは、コロニーPCRによって導入遺伝子の存在について検証されます。この目的のために、プレートから少量のコロニーを、バイナリーベクターからT-DNAの一部を増幅するプライマーとともに、選択したバッファー、dNTP、およびTaqポリメラーゼを含むPCRマスターミックスに添加します。グリセロールストックからの接種物は、植物の形質転換に使用されます。 3. アブラナ属の毛根形質転換 DH12075 アブラナ属の種子をマイクロチューブに入れDH12075フローボックスで滅菌します。まず、水と0.1%洗剤を使用して、60秒間振とうしながら種子を脱脂します。次に、種子を水で洗い流し、続いて70%エタノールで60秒間すすぎます。 次亜塩素酸ナトリウムを含む市販の漂白剤の10%溶液を使用して種子を殺菌します。この溶液で種子を20分間振る。 種子を滅菌水で4回ずつ60秒間洗浄します。種子発芽培地を含むペトリ皿に置きます。種子を4°Cで一晩低温成層し、プレートを栽培室(21°C、16時間明/8時間暗)に移します。 生後5日の苗を植物成長培地が入った植物培養ボックスに移します。注:DH12075における最高の形質転換効率は、生後18日の苗木で特定されました。苗の年齢は、地域の生育条件や他の品種に合わせて最適化することができます。 毛むくじゃらの根誘導プラスミドpRiA4bと形質転換用バイナリーベクター(ステップ2.11から)を担持したAgrobacterium tumefaciens C58C1の液体培養液に接種ループを接種します。5 mL の LB 培地を使用します。この培養液を28°Cで一晩、OD600 = 0.9 – 1になるまで増殖させます。注: Ri プラスミドのみを含むアグロバクテリウムは、野生型の毛根が生成される場合に使用されます。 少量(約50μL)をインスリン注射器とともに、生後18日齢の胚軸に注入します(ステップ3.4から)。培地の表面から約1cm上のシリンジに取り付けられた26Gの針で胚軸に穿刺します。.傷口に液体を注入します。胚軸の表面の組織も注射器で引っ掻くことができます。注:接種する苗木の数は、実験者のニーズに合わせる必要があります。 植物を21°Cの栽培室に2〜4週間戻し、傷口にカルスと毛根が形成されるまで加熱します。 胚軸から毛根が出てきたカルスを切り取り、選択的抗生物質(T-DNAが運搬)とセフォタキシム(200 mg/L)とチカルシリン(500 mg/L)を含む毛根成長培地を入れたペトリ皿に置き、アグロバクテリアの増殖を抑制します。ペトリ皿をガス透過性テープで密封します。毛むくじゃらの根を暗所で24°Cで培養します。注:機能選択に使用される特定の抗生物質の適切な濃度は、野生型の毛根でテストする必要があります。カナマイシンに対する耐性を持つ毛むくじゃらの根DH12075 B. napus には、25 mg/L の濃度のカナマイシンが使用されます。注:この工程では、野生型シュートと、そのような植物の成長を支持するトランスジェニック毛根からなる複合植物体を生成することができる。茎から毛むくじゃらの根を切り落とす代わりに、植物の本来の根を取り除きます。毛むくじゃらの根が出現した植物は、アグロバクテリアの増殖を抑制するセフォタキシム(200 mg/L)とチカルシリン(500 mg/L)を含む複合植物成長培地と、選択的抗生物質(T-DNAによって運ばれる)を含む植物培養ボックスに移されます。 1〜2週間後、ペトリ皿の毛むくじゃらの根をカルスから分離し、同じ培地でプレート上で個別化します。4〜5週間ごとに培養液を新しいプレートに移します。0.25 mg/L IBAを添加して、根の分岐を増やします。 各転写でセフォタキシムとチカルシリンの濃度を100 mg / Lずつ徐々に減らします(つまり、最初の転写の培地には100 mg / Lのセフォタキシムと400 mg / Lのチカルシリンが含まれ、2回目の転写には300 mg / Lのチカルシリンなどが含まれています)。3〜4ヶ月後、100 mg / Lのチカルシリンと選択的抗生物質を使用して、毛むくじゃらの根の成長培地で毛むくじゃらの根を培養します。 4. 毛むくじゃらの根DH12075アブラナ属の再生 ピンセットを使用して無菌状態で再生培地のあるプレートに独立した毛根を移し、使用前に炎上させます。ペトリ皿ごとに5〜10本の根を移し、21°Cで長日日長(16時間の明/8時間の暗)で培養します。ペトリ皿をガス透過性テープで密封します。 3〜4週間ごとに、毛むくじゃらの根を新鮮な再生培地でプレートに移します。カリは約2週間後に形成されることに注意してください。カルスは、カルス形成後8〜9週間まで、さらに2週間後に撮影を開始します。 新芽を個別化し、新芽伸長培地を入れた植物培養ボックスに2〜3週間移し、新芽の伸長を促進します。 細長いシュートを根誘導培地で植物培養ボックスに移します。3〜4週間ごとに文化を更新します。DH12075の発根効率は、30日で87%、60日後には最大100%です。 真菌感染を防ぐために、ゲル化剤の痕跡を取り除いた後、根付いた植物を土壌に移します。植物を最初にファイトトロン(21°C、長日日長、150μE)に順応させ、次に開花のために温室に移します(21°C/18°C、長日日長、150μE)。 5. 再生剤とT1植物の選択 注:毛むくじゃらの根元は、再生プロセスに入る前に選択できます。選択の種類は、導入遺伝子によって運ばれる内容によって異なります。毛むくじゃらの根は、DNA抽出とジェノタイピングまたは突然変異検出、RNA抽出とその後のcDNA合成、RT-qPCRによる選択した遺伝子の発現レベル分析、蛍光検出のための顕微鏡検査、またはGUS染色のための処理のためにサンプリングできます。 土壌に移した後、T0再生植物(およびT1苗木)を再度遺伝子型決定して、選択手順からの脱出を回避します。T0植物は、Ri表現型と呼ばれる変化した表現型を示します:植物ゲノムに挿入された Ri プラスミドのTLおよび/またはTR-DNAの存在によって引き起こされる広範な根の成長、巻き毛の葉、および矮性シュート。 T1の選択をスピードアップするには、T0再生植物の緑色の成熟胚を含む種子(魚雷胚以上の場合は受粉後約21〜28日)をDH12075して胚の救助に使用します。滅菌フローボックスで作業します。珪石を回収し、70%エタノールで表面殺菌します。 プレートの蓋またはスライドにテープで貼り付けた両面テープの上に置きます。 実体双眼鏡を使用して、26G針を使用して弁の縁に沿って珪片をスリットします。切り口が種子を傷つけないようにしてください。握りやすいように、ニードルを1 mLのシリンジに取り付けます。 心皮を開き、テープに貼り付けます。未熟な種子を集め、種子発芽用の培地を入れたプレートに移します。プレートをガス透過性テープで密封します。 発芽するまで培養室(21°C、明度16時間/暗度8時間)にプレートを置きます。 T1苗木の遺伝子型を決定し、目的の導入遺伝子の存在と Ri TR/TLの不在を確認します(図1)。葉の材料を収集し、選択した方法を使用してそれらのDNAを抽出します。CTABメソッドについては、以下で説明します。2つのセラミックビーズが入った2 mLのマイクロチューブに葉の材料を回収します。チューブを液体窒素で凍結します。 ボールミルで材料を粉砕します。或いは、乳棒及び乳鉢を用いてもよい。 素早くスピンダウンした後、400 μLのCTABバッファーを粉末に添加します。短時間ボルテックスし、スピンダウンし、60°Cで少なくとも50分間インキュベートします。 溶液を室温まで15分間冷却します。クロロホルムを1体分加え、穏やかに混ぜます。注意: クロロホルムを使用するときは、薬液の流れの下で作業し、保護のために手袋を使用してください。クロロホルムを含む溶液は、適切なゴミ箱に廃棄する必要があります。 卓上遠心分離機を使用して、18,400 x g で5分間遠心分離します。250〜350μLの上層水相を新しいマイクロチューブに移します。間相を省略します。 1容量のイソプロパノールを加え、よく混合し、室温で5分間インキュベートします。18,400 x gで40分間遠心分離します。 液体を捨て、200μLの70%エタノールを加えます。ペレットを洗浄し、18,400 x gで15分間遠心分離します。 液体を捨てます。ペレットを風乾し、50〜100μLの超純水を加えます。DNAを冷蔵庫で1時間から一晩溶かします。 rolA遺伝子(TL)、aux1遺伝子(TR)、およびvirC遺伝子座(Agrobacterium)のPCRによるジェノタイピングを行います。調製したDNA(ステップ5.3で作成)、プライマー、バッファー、dNTP、およびTaqポリメラーゼを使用して、メーカーのプロトコルに従ってPCR反応を調製します。増幅された断片の長さは200〜500bpです。rolAに特異的なプライマー:フォワード: GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAG裏面:TGCGTATTAATCCCGTAGGTCaux1に特異的なプライマー:フォワード: CATAGGATCGCCTCACAGGTリバース:CGTTGCTTGATGTCAGGAGAvirCに特異的なプライマー:フォワード: AATGCGTCTCTCTCGTGCAT裏面:AAACCGACCACTAACGCGAT注:T-DNAの転移と統合は部分的であり、TLおよび/またはTRの一部のみがゲノムに組み込まれる可能性があります。したがって、T1苗木におけるTL( rolB や rolCなど)やTR(aux2、 mas1、 ags1)の他のORFの存在を分析することが推奨されます。これらの遺伝子座に特異的なプライマー配列は、Jedličková et al.9にリストされている。 ゲル電気泳動によるPCR反応の評価注:PCRグレードのDNAを確実に取得するために、この分析にポジティブコントロールを含めることをお勧めします。 導入遺伝子の有無は、この導入遺伝子の内容に基づいてプロトコルに従って選択します。 選択した苗木を土に移します。 6. シロイヌナズナCol-0の毛根の形質転換と再生 A. thalianaの種子は、任意の方法(漂白剤、エタノール、または塩素ガス)で表面殺菌します。 種子の発芽のために培地に滅菌種子をプレーティングします。2日間の低温成層後、プレートを培養室(21°C、長日長、湿度50%)に移します。 生後1週間の苗木を植物成長培地の入った植物培養ボックスに移します。 ステップ3.5に示すようにア グロバクテリウム 培養物を調製します。 生後1ヶ月の シロイヌナズナ 植物の一次花序茎の基部(ロゼットから約1〜2cm上)のインスリン注射器に取り付けた針で少量の培養液(約50μL)を注入します。一次ステムの表面の組織もシリンジで引っ掻くことができます。 注入後2〜4週間で、出現する毛根を切除し、選択的抗生物質(T-DNAによって運ばれる)とセフォタキシム(200 mg / L)とチカルシリン(500 mg / L)を添加した毛根成長培地を使用してペトリ皿で栽培し、アグロバクテリアの増殖を抑制します。プレートを暗所で24°Cでインキュベートします。 1〜2週間後、同じ培地でプレート上の毛根を個別化します。選択した毛むくじゃらの根を4〜5週間ごとに新鮮な培地に移します。注: A. thaliana の毛根は B. napus の根よりも細いため、新鮮な培地に移す場合は注意が必要です。 毛むくじゃらの根を再生培地でプレートに移し、カルスの形成を誘導します。プレートを21°Cで長日日長(16時間明るい/8時間暗い)で培養します。 新芽は、栽培の18〜21日後にカルスから出てきます。芽を切り取り、2〜3週間芽伸長培地に移して、成長と伸長を促進します。 細長いシュートを根誘導培地に移します。 根付いた植物を土に移します。T0植物もRi表現型を示します。 B. napus DH12075(ステップ5)について説明したように、トランスジェニック選択を行います。