Transformação e regeneração de raízes pilosas em Arabidopsis thaliana e Brassica napus

1. Preparação de mídias e soluções Prepare as soluções de estoque de hormônios.Para a preparação de 50 mL de solução estoque de ácido 1-naftalenoacético (ANA), 6-benzilaminopurina (BAP) e ácido indol-3-butírico (AIB) com concentração de 5 mg/mL, dissolver 250 mg do hormônio em pó em 2 mL de hidróxido de sódio (NaOH) 1 M e ajustar o volume para 50 mL com água ultrapura. Para preparar 50 mL de ácido giberélico (GA3) com uma concentração de 1 mg/mL, dissolver 50 mg do hormônio em pó em 2 mL de etanol e ajustar o volume para 50 mL de água ultrapura. Filtrar a solução utilizando um filtro de seringa estéril com poros de 0,22 μm e distribuí-la em tubos estéreis de 2 ml para armazenamento. Conservar a solução a -20 °C ou 4 °C, dependendo da recomendação do fabricante. Preparar soluções estoque de antibióticos. Para 50 mL de cefotaxima e solução estoque dissódica de ticarcilina com concentração de 100 mg/mL, dissolver 0,5 g do antibiótico em pó em 40 mL de água ultrapura e ajustar para um volume final de 50 mL. Filtrar a solução utilizando um filtro de seringa estéril com poros de 0,22 μm e distribuí-la em tubos estéreis de 2 ml para armazenamento. Conservar a solução a -20 °C.NOTA: Antibióticos e hormônios são sempre adicionados ao meio resfriado. Preparar 1 L de meio Luria Broth (LB) adicionando 10 g de bacto-triptona, 5 g de extracto de levedura e 5 g de cloreto de sódio (NaCl) num cilindro de medição de 1 L e ajustar o volume para 1 L com água bidestilada. Ajuste o pH para 7,0 com KOH com um medidor de pH (seguindo as instruções do fabricante). Transferir a solução para um frasco de 1 L e adicionar 15 g de ágar bacteriológico (1,5%), se for preparado um meio sólido e autoclavar o meio. Se necessário, adicione os antibióticos apropriados (a resistência bacteriana é transportada no vetor binário) ao meio resfriado.NOTA: Use uma autoclave para esterilizar a solução. Coloque o frasco no cesto, feche a tampa e esterilize-o por 20 min a 121 °C e 98,9 kPa. Este protocolo é sempre utilizado para soluções de autoclavagem em etapas posteriores. Preparar 1 L de extrato de levedura em meio bovino (YEB) misturando 5 g de extrato bovino, 1 g de extrato de levedura, 5 g de peptona, 5 g de sacarose e 0,5 g de cloreto de magnésio (MgCl2) em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L. Transfira a solução para um frasco de 1 L. Autoclave o meio. Preparar 1 L de meio para germinação das sementes misturando 2,2 g de pó de Murashige e Skoog (MS), 10 g de sacarose (1%) e 0,5 g de sais de sódio do ácido 2-(N-Morpholino)etanossulfônico (MES) em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L, misture e ajuste o pH para 5,8 com KOH. Transferir a solução para um frasco de 1 L e adicionar 8 g de ágar vegetal (0,8%). Autoclave o meio. Preparar 1 L de meio de cultura misturando 2,2 g de pó de MS, 5 g de sacarose (0,5%) e 0,5 g de sais de MES em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L, misture e ajuste o pH para 5,8 com KOH. Transferir a solução para um frasco de 1 L e adicionar 8 g de ágar vegetal (0,8 %). Autoclave o meio. Preparar 1 L de meio de crescimento de raiz pilosa misturando 4,4 g de MS + B5 vitaminas em pó, 30 g de sacarose (3%) e 0,5 g de sais MES em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L, misture e ajuste o pH para 5,8 com KOH e transfira a solução para um frasco de 1 L. Adicionar 3 g de gelificante (0,3%) e autoclavar o meio. Adicionar cefotaxima e ticarcilina dissódica a uma concentração final de 100 – 200 mg/L e 100 – 500 mg/L, respectivamente. Se necessário, adicione os antibióticos apropriados (a resistência é devida ao T-DNA de um vetor binário). Preparar 1 L de meio de crescimento vegetal composto misturando 2,2 g de MS + B5 vitaminas em pó, 10 g de sacarose (1%) e 0,5 g de sais MES em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L, misture e ajuste o pH para 5,8 com KOH e transfira a solução para um frasco de 1 L. Adicionar 6 g de gelificante (0,6%) e autoclavar o meio. Adicionar cefotaxima e ticarcilina dissódica a uma concentração final de 200 mg/L e 500 mg/L, respectivamente. Se necessário, adicione os antibióticos apropriados (a resistência é devida ao T-DNA de um vetor binário). Preparar 1 L de meio de regeneração misturando 4,4 g de MS + B5 vitaminas em pó, 30 g de sacarose (3%) e 0,5 g de sais MES em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L, misture e ajuste o pH para 5,8 com KOH. Transferir a solução para um frasco de 1 L e adicionar 3 g de gelificante (0,3 %). Autoclave o meio. Adicionar NAA e BAP a uma concentração final de 8 mg/L e 5 mg/L, respectivamente, e ticarcilina dissódica a uma concentração final de 100 mg/L. Preparar 1 L de meio de alongamento da parte aérea misturando 4,4 g de MS + B5 vitaminas em pó, 20 g de sacarose (2%) e 0,5 g de sais MES em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L, misture e ajuste o pH para 5,8 com KOH. Transferir a solução para um frasco de 1 L e adicionar 3 g de ágar vegetal (0,3%). Autoclave o meio. Adicionar BAP e GA3 a uma concentração final de 0,5 mg/L e 0,03 mg/L, respectivamente, e cefotaxima a uma concentração final de 100 mg/L. Preparar 1 L de meio de indução radicular misturando 2,2 g de MS + B5 vitaminas em pó, 10 g de sacarose (1%) e 0,5 g de sais MES em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L, misture e ajuste o pH para 5,8 com KOH. Transferir a solução para um frasco de 1 L e adicionar 3 g de gelificante (0,3%). Autoclave o meio. Adicionar AIB e cefotaxima a uma concentração final de 0,5 mg/L e 100 mg/L, respectivamente. Preparar 1 L de tampão brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB) adicionando 20 g de CTAB (2% p/v final), 100 ml de Tris-HCl 1M, pH 8,0 (100 mM final), 40 ml de EDTA 0,5 M, pH 8,0 (20 mM final), 81,8 g de NaCl (1,4 M final) e 5 g de PVP40 (0,5% p/v final). Ajuste para 1 L com água destilada dupla. Autoclave a solução. Conservar a solução até 1 ano à temperatura ambiente. 2. Transformação de Agrobacterium com vetor binário Preparar o DNA de um plasmídeo binário verificado contendo o T-DNA para ser integrado ao genoma da planta. Certifique-se de que o DNA plasmidial contenha baixos sais para evitar faíscas elétricas à medida que a eletroporação é usada. Recomenda-se o uso de um kit de extração de DNA plasmidial de escolha. Preparar células eletrocompetentes de Agrobacterium tumefaciens C58C1 contendo o plasmídeo pRiA4b indutor de raízes pilosas inoculando 200 mL de YEB líquido pré-aquecido (28 °C) com 8 mL de uma cultura fresca durante a noite. Incubar a cultura a 28 °C enquanto agita até que a densidade óptica a 600 nm (OD600) seja de cerca de 0,5, correspondendo à fase logarítmica média. Leva cerca de 4 – 5 h. Divida a cultura de Agrobacterium em quatro tubos de centrífuga estéreis pré-resfriados de 50 mL. Centrifugar durante 15 min a 4 °C a 3.200 x g.NOTA: As células devem ser mantidas frias a partir desta etapa. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet suavemente em (4x) 2,5 mL de glicerol a 10% frio (4 °C). Adicione mais 47,5 mL de glicerol 10% gelado e misture delicadamente. Células pellet a 3.200 x g por 15 min a 4 °C. Eliminar o sobrenadante e ressuspender as células em (4x) 10 mL de glicerol frio a 10%. Pastilhar novamente as células e ressuspendê-las em (4x) 0,75 mL de glicerol frio a 10%. Agrupar o conteúdo dos quatro tubos em um (volume total = 3 mL). Divida a solução agrobacteriana em alíquotas de 50 μL em microtubos estéreis pré-resfriados de 1,5 mL. Congelar as alíquotas em gelo seco ou nitrogênio líquido. Conservar os tubos a -80 °C para utilização futura. Colocar um tubo de células competentes (50 μL) no gelo, misturar com 5 μL de ADN plasmidial (1 μg no total, a partir do passo 2.1), transferir a mistura para uma cubeta de eletroporação (0,2 cm de intervalo) e incubar durante 5 minutos no gelo. Coloque a cubeta no eletroporator e eletropore as células com as seguintes regulagens: capacitância 25 μFD, resistência 400 Ω, tensão elétrica 2,5 kV, duração do pulso 9,7 ms. Adicionar 950 μL de meio líquido LB às células, que são então cultivadas a 28 °C por 2 h a 300 rpm em um termomisturador. Placa de 50 μL da cultura celular em meio LB sólido com antibiótico seletivo apropriado. Cultivar as placas por 2 dias a 28 °C.NOTA: Recomenda-se a placa de uma gama de culturas de células (10 μL – 100 μL) por placa para determinar um volume de cultura adequado e evitar o crescimento excessivo de bactérias. Preparar culturas líquidas de algumas colônias selecionadas em 5 mL de meio líquido LB com antibióticos. Cultivar as bactérias durante a noite a 28 °C com agitação. Use essas culturas para estoques de glicerol misturando 0,5 mL de cultura de bactérias líquidas e 0,5 mL de glicerol a 40%.NOTA: Estas colônias são verificadas quanto à presença do transgene por PCR de colônia. Para este propósito, adicione uma pequena quantidade de uma colônia de uma placa à mistura mestre de PCR contendo tampão, dNTP e Taq polimerase de escolha, juntamente com primers amplificando uma parte do T-DNA de um vetor binário. O inóculo dos estoques de glicerol é utilizado para a transformação das plantas. 3. Transformação da raiz peluda de Brassica napus DH12075 Coloque as sementes de Brassica napus DH12075 em microtubos e esterilize-as em uma caixa de fluxo. Primeiro, desengraxe as sementes usando água e detergente a 0,1% enquanto agita por 60 s. Em seguida, enxaguar as sementes com água seguida de etanol 70%, ambos por 60 s. Esterilizar as sementes com solução a 10% de água sanitária comercial contendo hipoclorito de sódio. Agite as sementes nesta solução durante 20 minutos. Lave as sementes 4x com água estéril por 60 s cada. Colocá-los em placas de Petri contendo o meio de germinação das sementes. Estratificar as sementes a frio a 4 °C durante a noite e mover as placas para uma sala de cultivo (21 °C, 16 h claro/8 h escuro). Transfira mudas de 5 dias de idade para caixas de cultura de plantas contendo um meio de crescimento vegetal.OBS: A melhor eficiência de transformação em DH12075 foi identificada para mudas com 18 dias de idade. A idade das plântulas pode ser otimizada para as condições locais de crescimento ou outras cultivares. Inocular uma cultura líquida de Agrobacterium tumefaciens C58C1 carregando um plasmídeo indutor de raiz pilosa pRiA4b e o vetor binário para transformação (a partir do passo 2.11) com uma alça de inoculação. Use 5 mL de meio LB. Cultivar esta cultura durante a noite a 28 °C até atingir OD600 = 0,9 – 1.NOTA: Agrobacterium contendo apenas o plasmídeo Ri é usado se raízes pilosas selvagens são produzidas. Injetar uma pequena quantidade de cultura (aproximadamente 50 μL) com uma seringa de insulina no hipocótilo de uma plântula com 18 dias de idade (a partir do passo 3.4.). Puncione o hipocótilo com uma agulha 26G montada na seringa a cerca de 1 cm acima da superfície do meio. Injete o líquido na ferida. O tecido na superfície do hipocótilo também pode ser arranhado pela seringa.OBS: O número de mudas inoculadas deve ser adaptado às necessidades do experimentador. Retornar as plantas à sala de cultivo a 21 °C por 2 a 4 semanas até que um calo e raízes pilosas sejam formados no local da ferida. Cortar o calo com as raízes pilosas emergidas do hipocótilo e colocá-lo em uma placa de Petri com o meio de crescimento radicular piloso contendo antibióticos seletivos (transportados pelo T-DNA) e cefotaxima (200 mg/L) e ticarcilina (500 mg/L) para suprimir o crescimento agrobacteriano. Sele as placas de Petri com fita métrica permeável a gás. Cultivar as raízes pilosas a 24 °C no escuro.NOTA: A concentração adequada de antibióticos específicos usados para seleção funcional deve ser testada com raízes peludas selvagens. Para B. napus DH12075 raízes pilosas que carregam resistência à canamicina, uma concentração de 25 mg/L de canamicina é usada.OBS: Nesta etapa, é possível gerar uma planta composta por parte aérea selvagem e raízes peludas transgênicas que sustentam o crescimento dessa planta. Em vez de cortar as raízes peludas de um caule, as raízes nativas da planta são removidas. A planta com raízes pilosas emergentes é transferida para uma caixa de cultura de plantas com um meio de crescimento composto contendo cefotaxima (200 mg/L) e ticarcilina (500 mg/L) para suprimir o crescimento de agrobactérias, e o antibiótico seletivo (carreado pelo T-DNA). Após 1 a 2 semanas, isole as raízes pilosas da placa de Petri do calo e individualize-as em placas com o mesmo meio de cultura. Transfira a cultura para um prato fresco a cada 4 a 5 semanas. Adicionar 0,25 mg/L de AIB para aumentar a ramificação radicular. Reduzir as concentrações de cefotaxima e ticarcilina gradualmente em cada transferência em 100 mg/L (ou seja, o meio para a primeira transferência contém 100 mg/L de cefotaxima e 400 mg/L de ticarcilina; para a segunda transferência, 300 mg/L de ticarcilina, etc.). Após 3 a 4 meses, cultivar as raízes pilosas em meio de crescimento de raízes pilosas com 100 mg/L de ticarcilina e antibiótico seletivo. 4. Regeneração de Brassica napus DH12075 raízes peludas Transfira linhas de raízes pilosas independentes para placas com meio de regeneração em condições estéreis usando pinças, com chama antes do uso. Transferir 5 – 10 raízes por placa de Petri e cultivá-las a 21 °C em um fotoperíodo de dias longos (16 h claro / 8 h escuro). Sele as placas de Petri com fita métrica permeável a gás. A cada 3 a 4 semanas, transfira as raízes pilosas para placas com meio de regeneração fresco. Note que os calos são formados após aproximadamente 2 semanas. O calo começa a disparar após mais 2 semanas até 8 – 9 semanas após a formação do calo. Individualizar os brotos e transferi-los para caixas de cultura de plantas com meio de alongamento da parte aérea por 2 a 3 semanas para promover o alongamento dos brotos. Transfira os brotos alongados para caixas de cultura de plantas com meio de indução radicular. Atualize a cultura a cada 3 – 4 semanas. A eficiência de enraizamento em DH12075 é de 87% aos 30 dias e de até 100% aos 60 dias. Transfira as plantas enraizadas para o solo após remover quaisquer vestígios de agente gelificante para evitar a infecção fúngica. Certifique-se de que as plantas são primeiro aclimatadas nos fitótrons (21 °C, fotoperíodo de dias longos, 150 μE) e, em seguida, transferi-las para uma estufa para floração (21 °C / 18 °C, fotoperíodo de dias longos, 150 μE). 5. Seleção de plantas regenerativas e T1 NOTA: As linhas de raiz peludas podem ser selecionadas antes de entrar no processo de regeneração. O tipo de seleção depende do conteúdo transportado pelo transgene. As raízes pilosas podem ser amostradas para extração de DNA e genotipagem ou detecção de mutação, extração de RNA com subsequente síntese de cDNA e RT-qPCR para análise do nível de expressão do gene de escolha, microscopia para detecção de fluorescência ou tratadas para coloração de GUS. Após a transferência para o solo, genotipar novamente as plantas regeneradoras T0 (e as plântulas T1) para evitar escapes dos procedimentos de seleção. As plantas T0 exibem um fenótipo alterado denominado fenótipo Ri: crescimento extenso das raízes, folhas crespas e brotações anãs causadas pela presença do TL e/ou TR-DNA do plasmídeo Ri inserido no genoma da planta. Para acelerar a seleção de T1, utilizar as sementes contendo embriões verdes maduros (aprox. 21 – 28 dias após a polinização para DH12075 para um embrião de torpedo ou mais velho) de plantas regenerantes T0 para resgate de embriões.Trabalhe na caixa de fluxo estéril. Recolher as sílicas e esterilizá-las superficialmente com etanol 70%. Coloque-os em uma fita dupla face colada em uma tampa de placa ou um slide. Usando um estereobinóculo, corte a silique ao longo das margens da válvula usando uma agulha 26G. Certifique-se de que o corte não danifique as sementes. Para facilitar a aderência, monte a agulha em uma seringa de 1 mL. Abra os carpelos e cole-os na fita. Coletar as sementes imaturas e transferi-las para placas com meio para germinação das sementes. Sele as placas com fita adesiva permeável a gás. Colocar as placas numa sala de cultivo (21 °C, 16 h claro/8 h escuro) até à germinação. Genótipo das plântulas T1 quanto à presença do transgene de interesse e ausência do Ri TR/TL (Figura 1). Coletar material foliar e extrair seu DNA usando o método de escolha. O método CTAB é descrito aqui:Recolher o material foliar num microtubo de 2 mL contendo duas esferas cerâmicas. Congelar o tubo em nitrogênio líquido. Triture o material usando um moinho de bolas. Alternativamente, pilão e argamassa podem ser usados. Depois de uma rotação rápida para baixo, adicione 400 μL de tampão CTAB ao pó. Vórtice brevemente, gire para baixo e incube a 60 °C por pelo menos 50 min. Arrefecer a solução à temperatura ambiente durante 15 minutos. Adicione um volume de clorofórmio e misture delicadamente.CUIDADO: Ao usar clorofórmio, trabalhe sob o fluxo químico e use luvas para proteção. Qualquer solução que contenha clorofórmio deve ser eliminada no contentor de resíduos adequado. Centrifugar por 5 min a 18.400 x g usando uma centrífuga de mesa. Transferir 250 – 350 μL da fase aquosa superior para um novo microtubo. Omitir a interfase. Adicione um volume de isopropanol, misture bem e incube por 5 min à temperatura ambiente. Centrifugar por 40 min a 18.400 x g. Descarte o líquido e adicione 200 μL de etanol 70%. Lave o pellet e a centrífuga por 15 min a 18.400 x g. Descarte o líquido. Seque o pellet ao ar e adicione 50 – 100 μL de água ultrapura. Deixe o DNA dissolver por 1 h para passar a noite na geladeira. Realizar uma genotipagem por PCR para o gene rolA (TL), o gene aux1 (TR) e o locus virC (Agrobacterium). Preparar a reação de PCR usando o DNA preparado (da etapa 5.3.), primers, tampão, dNTP e Taq polimerase de acordo com o protocolo do fabricante. Os fragmentos amplificados têm de 200 a 500 pb de comprimento.Primers específicos para rolA:Avante: GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAGReverso: TGCGTATTAATCCCGTAGGTCPrimers específicos para aux1:Avante: CATAGGATCGCCTCACAGGTReverso: CGTTGCTTGATGTCAGGAGAPrimers específicos para virC:Avante: AATGCGTCTCTCTCGTGCATReverso: AAACCGACCACTAACGCGATNOTA: A transferência e integração do DNA-T podem ser parciais, e apenas partes de TL e/ou TR podem se integrar ao genoma. Assim, recomenda-se analisar a presença de outras ORFs de CT (e.g., rolB e rolC) e TR (aux2, mas1, ags1) em plântulas T1. Sequências de primers específicas para esses loci estão listadas em Jedličková et al.9. Avaliar reações de PCR por eletroforese em gel.NOTA: Recomenda-se incluir um controle positivo nesta análise para garantir ter DNA de grau PCR. Selecionar para a presença (ou ausência) do transgene de acordo com os protocolos baseados no conteúdo deste transgene. Transfira mudas selecionadas para o solo. 6. Transformação e regeneração de raízes pilosas em Arabidopsis thaliana Col-0 Esterilizar superficialmente sementes de A. thaliana com um método de escolha (água sanitária, etanol ou gás cloro). Sementes estéreis em placa em meio para germinação das sementes. Após 2 dias de estratificação fria, mover as placas para uma sala de cultivo (21 °C com fotoperíodo de dias longos e 50% de umidade). Transfira as mudas com 1 semana de idade para uma caixa de cultura de plantas com meio de crescimento vegetal. Preparar culturas de Agrobacterium conforme indicado na etapa 3.5. Injetar uma pequena quantidade de cultura (aproximadamente 50 μL) com uma agulha montada em uma seringa de insulina na base do caule primário da inflorescência (aproximadamente 1 – 2 cm acima da roseta) de plântulas de Arabidopsis com 1 mês de idade. O tecido na superfície da haste primária também pode ser riscado pela seringa. Em 2-4 semanas após a injeção, excisar as raízes pilosas emergentes e cultivá-las em placas de Petri com o meio de crescimento da raiz pilosa suplementado com o antibiótico seletivo (transportado pelo T-DNA) e cefotaxima (200 mg/L) e ticarcilina (500 mg/L) para suprimir o crescimento agrobacteriano. Incubar as placas a 24 °C no escuro. Após 1 a 2 semanas, individualizar as raízes pilosas em placas com o mesmo meio de cultura. Transfira as linhas de raiz peludas selecionadas para um meio fresco a cada 4 – 5 semanas.NOTA: As raízes pilosas de A. thaliana são mais finas que as de B. napus, e deve-se ter cautela ao transferir para meios frescos. Transfira as raízes pilosas para placas com meio de regeneração para induzir a formação de calos. Cultivar as placas a 21 °C em fotoperíodo de dias longos (16 h claro / 8 h escuro). Os brotos emergem do calo após 18 – 21 dias de cultivo. Corte os brotos e transfira-os para um meio de alongamento dos brotos por 2 a 3 semanas para promover o crescimento e alongamento. Transfira os brotos alongados para o meio de indução radicular. Transfira as plantas enraizadas para o solo. As plantas T0 também apresentam fenótipo de Ri. Realizar a seleção transgênica, conforme descrito para B. napus DH12075 (etapa 5).