Transformatie en regeneratie van harige wortels bij Arabidopsis thaliana en Brassica napus

1. Voorbereiding van media en oplossingen Bereid de hormoonvoorraadoplossingen voor.Voor de bereiding van 50 ml 1-naftaleenazijnzuur (NAA), 6-benzylaminopurine (BAP) en indol-3-boterzuur (IBA) stockoplossing met een concentratie van 5 mg/ml, lost u 250 mg van het hormoon in poedervorm op in 2 ml 1 M natriumhydroxide (NaOH) en past u het volume aan tot 50 ml met ultrapuur water. Om 50 ml gibberellinezuur (GA3) met een concentratie van 1 mg/ml te bereiden, lost u 50 mg van het poedervormige hormoon op in 2 ml ethanol en past u het volume aan op 50 ml ultrapuur water. Filtreer de oplossing met behulp van een steriel spuitfilter met een poriegrootte van 0,22 μm en verdeel het in steriele buisjes van 2 ml voor opslag. Bewaar de oplossing bij -20 °C of 4 °C, afhankelijk van de aanbeveling van de fabrikant. Bereid antibiotische voorraadoplossingen voor. Los voor 50 ml cefotaxime en ticarcillin-dinatriumoplossing met een concentratie van 100 mg/ml 0,5 g van het antibioticum in poedervorm op in 40 ml ultrapuur water en pas aan tot een eindvolume van 50 ml. Filtreer de oplossing met behulp van een steriel spuitfilter met een poriegrootte van 0,22 μm en verdeel het in steriele buisjes van 2 ml voor opslag. Bewaar de oplossing bij -20 °C.OPMERKING: Antibiotica en hormonen worden altijd toegevoegd aan het gekoelde medium. Bereid 1 L Luria Bouillon (LB) medium door 10 g bacto-trypton, 5 g gistextract en 5 g natriumchloride (NaCl) toe te voegen in een maatcilinder van 1 L en pas het volume aan op 1 L met dubbel gedestilleerd water. Stel de pH in op 7,0 met KOH met een pH-meter (volgens de instructies van de fabrikant). Breng de oplossing over in een fles van 1 L en voeg 15 g bacteriologische agar (1,5%) toe, als er een vast medium is bereid, en autoclaaf het medium. Voeg indien nodig de juiste antibiotica (bacteriële resistentie wordt gedragen op de binaire vector) toe aan het afgekoelde medium.NOTITIE: Gebruik een autoclaaf om de oplossing te steriliseren. Plaats de fles in de mand, sluit het deksel en steriliseer hem gedurende 20 minuten op 121 °C en 98,9 kPa. Dit protocol wordt altijd gebruikt voor autoclaveroplossingen in verdere stappen. Bereid 1 l Yeast Extract Beef (YEB) medium door 5 g rundvleesextract, 1 g gistextract, 5 g pepton, 5 g sucrose en 0,5 g magnesiumchloride (MgCl2) te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L. Breng de oplossing over in een fles van 1 L. Autoclaaf het medium. Bereid 1 L medium voor het ontkiemen van het zaad door 2,2 g Murashige en Skoog (MS) poeder, 10 g sucrose (1%) en 0,5 g 2-(N-Morpholino)ethaansulfonzuur (MES) natriumzouten te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L, meng en pas de pH aan tot 5.8 met KOH. Breng de oplossing over in een fles van 1 liter en voeg 8 g plantaardige agar (0,8%) toe. Autoclaaf het medium. Bereid 1 L plantengroeimedium door 2,2 g MS-poeder, 5 g sucrose (0,5%) en 0,5 g MES-zouten te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L, meng en pas de pH aan tot 5.8 met KOH. Breng de oplossing over in een fles van 1 liter en voeg 8 g plantaardige agar (0,8 %) toe. Autoclaaf het medium. Bereid 1 L harig wortelgroeimedium door 4,4 g MS + B5-vitaminepoeder, 30 g sucrose (3%) en 0,5 g MES-zouten te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L, meng en pas de pH aan tot 5.8 met KOH, en breng de oplossing over in een fles van 1 L. Voeg 3 g geleermiddel (0,3%) toe en autoclaaf het medium. Voeg cefotaxime en ticarcillindinatrium toe tot een eindconcentratie van respectievelijk 100 – 200 mg/l en 100 – 500 mg/l. Voeg indien nodig de juiste antibiotica toe (resistentie is te wijten aan het T-DNA van een binaire vector). Bereid 1 L samengesteld plantengroeimedium door 2,2 g MS + B5-vitaminepoeder, 10 g sucrose (1%) en 0,5 g MES-zouten te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L, meng en pas de pH aan tot 5.8 met KOH en breng de oplossing over in een fles van 1 L. Voeg 6 g geleermiddel (0,6%) toe en autoclaaf het medium. Voeg cefotaxime en ticarcillindinatrium toe tot een eindconcentratie van respectievelijk 200 mg/l en 500 mg/l. Voeg indien nodig de juiste antibiotica toe (resistentie is te wijten aan het T-DNA van een binaire vector). Bereid 1 L regeneratiemedium door 4,4 g MS + B5-vitaminepoeder, 30 g sucrose (3%) en 0,5 g MES-zouten te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L, meng en pas de pH aan tot 5.8 met KOH. Breng de oplossing over in een fles van 1 l en voeg 3 g geleermiddel (0,3 %) toe. Autoclaaf het medium. Voeg NAA en BAP toe tot een eindconcentratie van respectievelijk 8 mg/l en 5 mg/l, en ticarcillindinatrium tot een eindconcentratie van 100 mg/l. Bereid 1 L scheutverlengingsmedium door 4,4 g MS + B5-vitaminepoeder, 20 g sucrose (2%) en 0,5 g MES-zouten te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L, meng en pas de pH aan tot 5.8 met KOH. Breng de oplossing over in een fles van 1 liter en voeg 3 g plantenagar (0,3%) toe. Autoclaaf het medium. Voeg BAP en GA3 toe tot een eindconcentratie van respectievelijk 0,5 mg/l en 0,03 mg/l en cefotaxime tot een eindconcentratie van 100 mg/l. Bereid 1 L wortelinductiemedium door 2,2 g MS + B5-vitaminepoeder, 10 g sucrose (1%) en 0,5 g MES-zouten te mengen in dubbel gedestilleerd water. Stel het volume in op 1 L, meng en pas de pH aan tot 5.8 met KOH. Breng de oplossing over in een fles van 1 L en voeg 3 g geleermiddel (0,3%) toe. Autoclaaf het medium. Voeg IBA en cefotaxime toe tot een eindconcentratie van respectievelijk 0,5 mg/l en 100 mg/l. Bereid 1 l cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB)-buffer door toevoeging van 20 g CTAB (2% m/v definitief), 100 ml 1M Tris-HCl, pH 8,0 (100 mM definitief), 40 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 (20 mM definitief), 81,8 g NaCl (1,4 M definitief) en 5 g PVP40 (0,5% m/v definitief). Stel in op 1 L met dubbel gedestilleerd water. Autoclaaf de oplossing. Bewaar de oplossing maximaal 1 jaar bij kamertemperatuur. 2. Transformatie van Agrobacterium met een binaire vector Bereid het DNA van een geverifieerd binair plasmide met de T-DNA-cassette voor om in het plantengenoom te worden geïntegreerd. Zorg ervoor dat het plasmide-DNA weinig zouten bevat om elektrische vonken te voorkomen, aangezien elektroporatie wordt gebruikt. Het gebruik van een plasmide-DNA-extractiekit naar keuze wordt aanbevolen. Bereid elektrocompetente Agrobacterium tumefaciens C58C1-cellen die het harige wortelinducerende plasmide pRiA4b bevatten door 200 ml voorverwarmde (28 °C) YEB te inoculeren met 8 ml verse nachtkweek. Incubeer de cultuur bij 28 °C tijdens het schudden tot de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) ongeveer 0,5 bedraagt, wat overeenkomt met de mid-log-fase. Het duurt ongeveer 4 – 5 uur. Verdeel de Agrobacterium-cultuur over vier voorgekoelde steriele centrifugebuisjes van 50 ml. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 3.200 x g.NOTITIE: De cellen moeten vanaf deze stap koud worden gehouden. Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet voorzichtig in (4x) 2,5 ml koude (4 °C) 10% glycerol. Voeg nog eens 47,5 ml koude 10% glycerol toe en meng voorzichtig. Pelletcellen bij 3.200 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in (4x) 10 ml koude 10% glycerol. Pelleteer de cellen opnieuw en resuspendeer ze in (4x) 0,75 ml koude 10% glycerol. Bundel de inhoud van alle vier de buisjes in één (totaal volume = 3 ml). Verdeel de agrobacteriële oplossing in aliquots van 50 μl in voorgekoelde steriele microbuisjes van 1,5 ml. Vries de aliquots in op droogijs of vloeibare stikstof. Bewaar de buizen bij -80 °C voor toekomstig gebruik. Plaats een buisje competente cellen (50 μL) op ijs, meng met 5 μL plasmide-DNA (1 μg in totaal, uit stap 2.1), breng het mengsel over in een elektroporatiecuvet (0,2 cm opening) en incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Plaats de cuvet in de elektroporator en elektropoleer de cellen met de volgende instellingen: capaciteit 25 μFD, weerstand 400 Ω, elektrische spanning 2,5 kV, pulsduur 9,7 ms. Voeg 950 μL LB vloeibaar medium toe aan de cellen, die vervolgens gedurende 2 uur bij 300 tpm bij 28 °C in een thermomixer worden gekweekt. Plaats 50 μL van de celkweek op een vast LB-medium met het juiste selectieve antibioticum. Kweek de platen gedurende 2 dagen bij 28 °C.OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een reeks celculturen (10 μL – 100 μL) per plaat te plaatsen om een goed kweekvolume te bepalen en overgroei van bacteriën te voorkomen. Bereid vloeibare culturen van een paar geselecteerde kolonies in 5 ml LB vloeibaar medium met antibiotica. Laat de bacteriën een nacht groeien bij 28 °C door te schudden. Gebruik deze culturen voor glycerolvoorraden door 0,5 ml vloeibare bacteriecultuur en 0,5 ml 40% glycerol te mengen.OPMERKING: Deze kolonies worden geverifieerd op de aanwezigheid van het transgen door middel van kolonie-PCR. Voeg hiervoor een kleine hoeveelheid van een kolonie van een plaat toe aan de PCR-mastermix met buffer, dNTP en Taq-polymerase naar keuze, samen met primers die een deel van het T-DNA van een binaire vector amplificeren. Inoculum uit de glycerolvoorraden wordt gebruikt voor de transformatie van de planten. 3. Harige worteltransformatie van Brassica napus DH12075 Plaats zaden van Brassica napus DH12075 in microbuisjes en steriliseer ze in een stroomdoos. Ontvet eerst de zaden met water en 0,1% afwasmiddel terwijl je 60 s schudt. Spoel de zaden vervolgens af met water, gevolgd door 70% ethanol, beide gedurende 60 seconden. Steriliseer de zaden met een 10% -oplossing van commercieel bleekmiddel dat natriumhypochloriet bevat. Schud de zaden in deze oplossing gedurende 20 min. Was de zaden 4x met steriel water gedurende 60 s per stuk. Leg ze op petrischaaltjes met daarin het kiemmedium van het zaad. Stratificeer de zaden ‘s nachts bij 4 °C en verplaats de platen naar een kweekruimte (21 °C, 16 uur licht / 8 uur donker). Breng zaailingen van 5 dagen oud over naar plantenkweekdozen met een plantengroeimedium.OPMERKING: De beste transformatie-efficiëntie in DH12075 werd geïdentificeerd voor zaailingen van 18 dagen oud. De leeftijd van de zaailingen kan worden geoptimaliseerd voor de lokale groeiomstandigheden of andere cultivars. Inoculeer een vloeibare cultuur van Agrobacterium tumefaciens C58C1 met een harige wortelinducerende plasmide pRiA4b en de binaire vector voor transformatie (uit stap 2.11) met een inoculatielus. Gebruik 5 ml LB-medium. Kweek deze cultuur ‘s nachts bij 28 °C tot OD600 = 0,9 – 1.OPMERKING: Agrobacterium dat alleen het Ri-plasmide bevat, wordt gebruikt als wildtype harige wortels worden geproduceerd. Injecteer een kleine hoeveelheid kweek (ongeveer 50 μL) met een insulinespuit in het hypocotyl van een zaailing van 18 dagen oud (vanaf stap 3.4.). Prik het hypocotyl door met een naald van 26 G die op de spuit is gemonteerd op ongeveer 1 cm boven het oppervlak van het medium. Injecteer de vloeistof in de wond. Het weefsel op het oppervlak van het hypocotyl kan ook door de spuit worden bekrast.OPMERKING: Het aantal geïnoculeerde zaailingen moet worden aangepast aan de behoeften van de onderzoeker. Zet de planten 2 tot 4 weken terug in de kweekruimte bij 21 °C totdat er eelt en harige wortels zijn gevormd op de plaats waar de verwonding plaatsvindt. Snijd het eelt met de ontstane harige wortels van het hypocotyl af en plaats het op een petrischaal met het harige wortelgroeimedium met selectieve antibiotica (gedragen door het T-DNA) en cefotaxime (200 mg/L) en ticarcilline (500 mg/L) om de groei van agrobacteriën te onderdrukken. Sluit de petrischaaltjes af met gasdoorlatende tape. Kweek de harige wortels bij 24 °C in het donker.OPMERKING: De juiste concentratie van specifieke antibiotica die worden gebruikt voor functionele selectie moet worden getest met wildtype harige wortels. Voor B. napus DH12075 harige wortels die resistent zijn tegen kanamycine, wordt een concentratie van 25 mg/L kanamycine gebruikt.OPMERKING: In deze stap is het mogelijk om een samengestelde plant te genereren die bestaat uit de wildtype scheut en transgene harige wortels die de groei van een dergelijke plant ondersteunen. In plaats van de harige wortels van een stengel af te snijden, worden de inheemse wortels van de plant verwijderd. De plant met opkomende harige wortels wordt overgebracht naar een plantenkweekdoos met een samengesteld plantengroeimedium dat cefotaxime (200 mg/L) en ticarcilline (500 mg/L) bevat om de groei van agrobacteriën te onderdrukken, en het selectieve antibioticum (gedragen door het T-DNA). Isoleer na 1 – 2 weken de harige wortels op de petrischaal van het eelt en individualiseer ze op borden met hetzelfde kweekmedium. Breng de cultuur elke 4 tot 5 weken over op een vers bord. Voeg 0,25 mg/L IBA toe om de wortelvertakking te vergroten. Verlaag de concentraties cefotaxime en ticarcillin geleidelijk bij elke overdracht met 100 mg/l (d.w.z. het medium voor de eerste overdracht bevat 100 mg/l cefotaxime en 400 mg/l ticarcilline; voor de tweede overdracht, 300 mg/l ticarcilline, enz.). Kweek na 3 – 4 maanden de harige wortels op een harig wortelgroeimedium met 100 mg/L ticarcilline en het selectieve antibioticum. 4. Regeneratie van Brassica napus DH12075 harige wortels Breng onafhankelijke harige wortellijnen over naar platen met regeneratiemedium in steriele omstandigheden met behulp van een pincet, gevlamd voor gebruik. Breng 5 – 10 wortels per petrischaaltje over en kweek ze op bij 21 °C in een lange fotoperiode (16 uur licht / 8 uur donker). Sluit de petrischaaltjes af met gasdoorlatende tape. Breng de harige wortels elke 3 tot 4 weken over naar platen met vers regeneratiemedium. Merk op dat calli na ongeveer 2 weken worden gevormd. Het eelt begint na nog eens 2 weken te schieten tot 8 – 9 weken na eeltvorming. Individualiseer de scheuten en breng ze gedurende 2 tot 3 weken over in plantenkweekdozen met scheutverlengingsmedium om de verlenging van de scheuten te bevorderen. Breng de langwerpige scheuten over naar plantenkweekdozen met een wortelinductiemedium. Ververs de cultuur elke 3 – 4 weken. De bewortelingsefficiëntie in DH12075 is 87% na 30 dagen en tot 100% na 60 dagen. Breng de gewortelde planten over naar de grond na het verwijderen van eventuele sporen van geleermiddel om schimmelinfectie te voorkomen. Zorg ervoor dat de planten eerst worden geacclimatiseerd in de fytotrons (21 °C, lange dag fotoperiode, 150 μE) en breng ze vervolgens over naar een kas voor bloei (21 °C / 18 °C, lange dag fotoperiode, 150 μE). 5. Selectie van regeneratie- en T1-planten OPMERKING: De harige wortellijnen kunnen worden geselecteerd voordat u het regeneratieproces ingaat. Het type selectie hangt af van de inhoud die door het transgen wordt gedragen. De harige wortels kunnen worden bemonsterd voor DNA-extractie en genotypering of mutatiedetectie, RNA-extractie met daaropvolgende cDNA-synthese en RT-qPCR voor expressieniveau-analyse van het gen naar keuze, microscopie voor fluorescentiedetectie of behandeld voor GUS-kleuring. Na overdracht in de bodem moet de T0-regeneratieve planten (en T1-zaailingen) opnieuw worden gegenotypeerd om te voorkomen dat ze ontsnappen aan de selectieprocedures. T0-planten vertonen een veranderd fenotype dat Ri-fenotype wordt genoemd: uitgebreide wortelgroei, gekrulde bladeren en dwergscheuten veroorzaakt door de aanwezigheid van het TL en/of TR-DNA van het Ri-plasmide dat in het plantengenoom is ingebracht. Om de T1-selectie te versnellen, gebruikt u de zaden met groene rijpe embryo’s (ca. 21 – 28 dagen na bestuiving voor DH12075 voor een torpedo-embryo of ouder) van T0-regeneratieve planten voor het redden van embryo’s.Werk in de steriele flowbox. Verzamel de siliques en steriliseer ze aan de oppervlakte met 70% ethanol. Plaats ze op een dubbelzijdige tape die op een plaatdeksel of een dia is geplakt. Snijd met een stereo-verrekijker de silique langs de klepranden door met een 26G-naald. Zorg ervoor dat de snede de zaden niet beschadigt. Voor een gemakkelijke grip monteert u de naald op een spuit van 1 ml. Open de vruchtbladen en plak ze op de tape. Verzamel de onrijpe zaden en breng ze over naar borden met medium voor het ontkiemen van zaden. Sluit de platen af met gasdoorlatende tape. Plaats de platen in een kweekruimte (21 °C, 16 uur licht / 8 uur donker) tot ze ontkiemen. Genotypeer de T1-zaailingen op de aanwezigheid van het betreffende transgen en de afwezigheid van de Ri TR/TL (figuur 1). Verzamel bladmateriaal en extraheer hun DNA met behulp van de methode naar keuze. De CTAB methode wordt hier beschreven:Vang het bladmateriaal op in een microbuisje van 2 ml met daarin twee keramische kralen. Vries de buis in vloeibare stikstof in. Maal het materiaal met behulp van een kogelmolen. Als alternatief kan stamper en vijzel worden gebruikt. Voeg na een snelle centrifuge 400 μL CTAB-buffer toe aan het poeder. Draai kort, draai naar beneden en incubeer bij 60 °C gedurende ten minste 50 minuten. Koel de oplossing gedurende 15 minuten af tot kamertemperatuur. Voeg een deel chloroform toe en meng voorzichtig.LET OP: Werk bij het gebruik van chloroform onder de chemische stroom en gebruik handschoenen ter bescherming. Elke oplossing die chloroform bevat, moet in de daarvoor bestemde afvalbak worden weggegooid. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 18.400 x g met behulp van een tafelcentrifuge. Breng 250 – 350 μL van de bovenste waterige fase over naar een nieuwe microbuis. Laat de interfase weg. Voeg een deel isopropanol toe, meng goed en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 40 minuten op 18.400 x g. Gooi de vloeistof weg en voeg 200 μL 70% ethanol toe. Was de pellet en centrifugeer gedurende 15 minuten op 18.400 x g. Gooi de vloeistof weg. Laat de pellet aan de lucht drogen en voeg 50 – 100 μL ultrapuur water toe. Laat het DNA 1 uur tot een nacht oplossen in de koelkast. Voer een genotypering uit door middel van PCR voor het rolA-gen (TL), het aux1-gen (TR) en de virC-locus (Agrobacterium). Bereid de PCR-reactie voor met behulp van het geprepareerde DNA (uit stap 5.3.), primers, buffer, dNTP en Taq-polymerase volgens het protocol van de fabrikant. De versterkte fragmenten zijn 200 – 500 bp lang.Primers specifiek voor rolA:Vooruit: GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAGKeerzijde: TGCGTATTAATCCCGTAGGTCPrimers specifiek voor aux1:Vooruit: CATAGGATCGCCTCACAGGTKeerzijde: CGTTGCTTGATGTCAGGAGAPrimers specifiek voor virC:Vooruit: AATGCGTCTCTCTCGTGCATKeerzijde: AAACCGACCACTAACGCGATOPMERKING: T-DNA-overdracht en -integratie kunnen gedeeltelijk zijn en slechts delen van TL en/of TR kunnen in het genoom worden geïntegreerd. Het wordt dus aanbevolen om de aanwezigheid van andere ORF’s van TL (bijv. rolB en rolC) en TR (aux2, mas1, ags1) in T1-zaailingen te analyseren. Primersequenties die specifiek zijn voor deze loci zijn vermeld in Jedličková et al.9. Evalueer PCR-reacties door gelelektroforese.OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een positieve controle in deze analyse op te nemen om er zeker van te zijn dat u DNA van PCR-kwaliteit heeft. Selecteer op de aan- (of afwezigheid) van het transgen volgens de protocollen op basis van de inhoud van dit transgen. Breng geselecteerde zaailingen over naar de grond. 6. Transformatie en regeneratie van harige wortels bij Arabidopsis thaliana Col-0 Steriliseer A. thaliana zaden met een methode naar keuze (bleekmiddel, ethanol of chloorgas). Leg steriele zaden op een medium voor het ontkiemen van zaden. Verplaats de platen na 2 dagen koude stratificatie naar een kweekruimte (21 °C met lange fotoperiode en 50% luchtvochtigheid). Breng zaailingen van 1 week oud over naar een plantenkweekdoos met plantengroeimedium. Bereid Agrobacterium-culturen voor zoals aangegeven in stap 3.5. Injecteer een kleine hoeveelheid kweek (ongeveer 50 μL) met een naald op een insulinespuit aan de basis van de primaire bloeiwijzestengel (ongeveer 1 – 2 cm boven de rozet) van 1 maand oude Arabidopsis-plantjes . Het weefsel op het oppervlak van de primaire stengel kan ook door de spuit worden bekrast. Snijd 2-4 weken na de injectie de opkomende harige wortels weg en kweek ze op petrischalen met het harige wortelgroeimedium aangevuld met het selectieve antibioticum (gedragen door het T-DNA) en cefotaxime (200 mg/L) en ticarcillin (500 mg/L) om de groei van agrobacteriën te onderdrukken. Incubeer de platen bij 24 °C in het donker. Individualiseer na 1 – 2 weken de harige wortels op platen met hetzelfde kweekmedium. Breng de geselecteerde harige wortellijnen elke 4 – 5 weken over naar een vers medium.OPMERKING: De harige wortels van A. thaliana zijn dunner dan die van B. napus en voorzichtigheid is geboden bij het overbrengen naar verse media. Breng de harige wortels over naar platen met regeneratiemedium om eeltvorming te induceren. Kweek de platen bij 21 °C in een lange fotoperiode (16 uur licht / 8 uur donker). Scheuten komen na 18 – 21 dagen cultivatie uit het eelt. Snijd de scheuten af en breng ze 2 – 3 weken over op een scheutverlengingsmedium om groei en rek te bevorderen. Breng de langwerpige scheuten over naar het wortelinductiemedium. Breng de gewortelde planten over naar de grond. T0-planten vertonen ook een Ri-fenotype. Voer de transgene selectie uit, zoals beschreven voor B. napus DH12075 (stap 5).