Transformación y regeneración de raíces pilosas en Arabidopsis thaliana y Brassica napus

1. Preparación de medios y soluciones Prepara las soluciones madre de hormonas.Para la preparación de 50 ml de solución madre de ácido 1-naftalenacético (NAA), 6-bencilaminopurina (BAP) y ácido indol-3-butírico (IBA) con una concentración de 5 mg/ml, disolver 250 mg de la hormona en polvo en 2 ml de hidróxido de sodio (NaOH) 1 M y ajustar el volumen a 50 ml con agua ultrapura. Para preparar 50 mL de ácido giberélico (GA3) con una concentración de 1 mg/mL, disuelva 50 mg de la hormona en polvo en 2 mL de etanol y ajuste el volumen a 50 mL de agua ultrapura. Filtre la solución con un filtro de jeringa estéril con un tamaño de poro de 0,22 μm y distribúyala en tubos estériles de 2 ml para su almacenamiento. Almacene la solución a -20 °C o 4 °C, según la recomendación del fabricante. Prepare soluciones madre antibióticas. Para 50 ml de solución madre disódica de cefotaxima y ticarcilina con una concentración de 100 mg/ml, disolver 0,5 g del antibiótico en polvo en 40 ml de agua ultrapura y ajustar a un volumen final de 50 ml. Filtre la solución con un filtro de jeringa estéril con un tamaño de poro de 0,22 μm y distribúyala en tubos estériles de 2 ml para su almacenamiento. Almacenar la solución a -20 °C.NOTA: Siempre se agregan antibióticos y hormonas al medio enfriado. Prepare 1 L de medio de Caldo Luria (LB) agregando 10 g de bactotriptona, 5 g de extracto de levadura y 5 g de cloruro de sodio (NaCl) en un cilindro medidor de 1 L y ajuste el volumen a 1 L con agua bidestilada. Ajuste el pH a 7.0 con KOH con un medidor de pH (siguiendo las instrucciones del fabricante). Trasvasar la solución a un frasco de 1 L y añadir 15 g de agar bacteriológico (1,5%), si se prepara un medio sólido y esterilizarlo en autoclave. Si es necesario, agregue los antibióticos apropiados (la resistencia bacteriana se transmite en el vector binario) al medio enfriado.NOTA: Utilice un autoclave para esterilizar la solución. Coloque el frasco en la cesta, cierre la tapa y esterilícelo durante 20 minutos a 121 °C y 98,9 kPa. Este protocolo siempre se utiliza para soluciones de autoclave en pasos posteriores. Prepare 1 litro de extracto de levadura de vacuno medio (YEB) mezclando 5 g de extracto de ternera, 1 g de extracto de levadura, 5 g de peptona, 5 g de sacarosa y 0,5 g de cloruro de magnesio (MgCl2) en agua bidestilada. Ajuste el volumen a 1 L. Transfiera la solución a una botella de 1 L. Autoclave el medio. Prepare 1 litro de medio para la germinación de semillas mezclando 2,2 g de polvo de Murashige y Skoog (MS), 10 g de sacarosa (1%) y 0,5 g de sales sódicas de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) en agua bidestilada. Ajusta el volumen a 1 L, mezcla y ajusta el pH a 5,8 con KOH. Transfiera la solución a una botella de 1 L y agregue 8 g de agar vegetal (0,8%). Autoclave el medio. Prepare 1 litro de medio de crecimiento vegetal mezclando 2,2 g de MS en polvo, 5 g de sacarosa (0,5%) y 0,5 g de sales MES en agua bidestilada. Ajusta el volumen a 1 L, mezcla y ajusta el pH a 5,8 con KOH. Trasvasar la solución a un frasco de 1 litro y añadir 8 g de agar vegetal (0,8 %). Autoclave el medio. Prepare 1 L de medio de crecimiento de raíces pilosas mezclando 4,4 g de polvo de vitaminas MS + B5, 30 g de sacarosa (3%) y 0,5 g de sales MES en agua bidestilada. Ajuste el volumen a 1 L, mezcle y ajuste el pH a 5.8 con KOH y transfiera la solución a una botella de 1 L. Añadir 3 g de gelificante (0,3%) y esterilizar el medio en autoclave. Añadir cefotaxima y ticarcilina disódica hasta una concentración final de 100 – 200 mg/L y 100 – 500 mg/L, respectivamente. Si es necesario, añadir los antibióticos adecuados (la resistencia se debe al ADN-T de un vector binario). Prepare 1 litro de medio compuesto para el crecimiento de plantas mezclando 2,2 g de polvo de vitaminas MS + B5, 10 g de sacarosa (1%) y 0,5 g de sales MES en agua bidestilada. Ajuste el volumen a 1 L, mezcle y ajuste el pH a 5.8 con KOH y transfiera la solución a una botella de 1 L. Añadir 6 g de gelificante (0,6%) y esterilizar el medio en autoclave. Añadir cefotaxima y ticarcilina disódica hasta una concentración final de 200 mg/L y 500 mg/L, respectivamente. Si es necesario, añadir los antibióticos adecuados (la resistencia se debe al ADN-T de un vector binario). Prepare 1 L de medio de regeneración mezclando 4,4 g de vitaminas MS + B5 en polvo, 30 g de sacarosa (3%) y 0,5 g de sales MES en agua bidestilada. Ajusta el volumen a 1 L, mezcla y ajusta el pH a 5,8 con KOH. Trasvasar la solución a un frasco de 1 litro y añadir 3 g de gelificante (0,3 %). Autoclave el medio. Añadir NAA y BAP a una concentración final de 8 mg/L y 5 mg/L, respectivamente, y ticarcilina disódica a una concentración final de 100 mg/L. Prepare 1 L de medio de elongación de brotes mezclando 4,4 g de polvo de vitaminas MS + B5, 20 g de sacarosa (2%) y 0,5 g de sales MES en agua bidestilada. Ajusta el volumen a 1 L, mezcla y ajusta el pH a 5,8 con KOH. Transfiera la solución a una botella de 1 L y agregue 3 g de agar vegetal (0,3%). Autoclave el medio. Añadir BAP y GA3 a una concentración final de 0,5 mg/L y 0,03 mg/L, respectivamente, y cefotaxima a una concentración final de 100 mg/L. Prepare 1 L de medio de inducción radicular mezclando 2,2 g de polvo de vitaminas MS + B5, 10 g de sacarosa (1%) y 0,5 g de sales MES en agua bidestilada. Ajusta el volumen a 1 L, mezcla y ajusta el pH a 5,8 con KOH. Traspasar la solución a un frasco de 1 litro y añadir 3 g de gelificante (0,3%). Autoclave el medio. Añadir IBA y cefotaxima hasta una concentración final de 0,5 mg/L y 100 mg/L, respectivamente. Prepare 1 L de tampón de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) añadiendo 20 g de CTAB (2% p/v final), 100 mL de Tris-HCl 1M, pH 8,0 (100 mM final), 40 mL de EDTA 0,5 M, pH 8,0 (20 mM final), 81,8 g de NaCl (1,4 M final) y 5 g de PVP40 (0,5% p/v final). Ajustar a 1 L con agua bidestilada. Esterilizar la solución en autoclave. Almacene la solución hasta por 1 año a temperatura ambiente. 2. Transformación de Agrobacterium con un vector binario Preparar el ADN de un plásmido binario verificado que contenga el casete de ADN-T para integrarlo en el genoma de la planta. Asegúrese de que el ADN plasmídico contenga bajas sales para evitar chispas eléctricas cuando se utiliza la electroporación. Se recomienda utilizar un kit de extracción de ADN plasmídico de su elección. Prepare células electrocompetentes de Agrobacterium tumefaciens C58C1 que contengan el plásmido pRiA4b inductor de raíces pilosas inoculando 200 mL de YEB líquido precalentado (28 °C) con 8 mL de un cultivo fresco durante la noche. Incubar el cultivo a 28 °C mientras se agita hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD600) sea de aproximadamente 0,5, correspondiente a la fase logarítmica media. Se tarda unas 4 – 5 h. Divida el cultivo de Agrobacterium en cuatro tubos de centrífuga estériles de 50 ml preenfriados. Centrifugar durante 15 min a 4 °C a 3.200 x g.NOTA: Las celdas deben mantenerse frías a partir de este paso. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet suavemente en (4x) 2,5 mL de glicerol frío (4 °C) al 10%. Agregue otros 47,5 ml de glicerol frío al 10% y mezcle suavemente. Células de pellets a 3.200 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en (4x) 10 ml de glicerol frío al 10%. Vuelva a granular las células y vuelva a suspenderlas en (4x) 0,75 ml de glicerol frío al 10%. Agrupe el contenido de los cuatro tubos en uno (volumen total = 3 ml). Divida la solución agrobacteriana en alícuotas de 50 μL en microtubos estériles de 1,5 ml preenfriados. Congele las alícuotas en hielo seco o nitrógeno líquido. Guarde los tubos a -80 °C para su uso futuro. Colocar un tubo de células competentes (50 μL) en hielo, mezclar con 5 μL de ADN plasmídico (1 μg en total, a partir del paso 2.1), transferir la mezcla a una cubeta de electroporación (espacio de 0,2 cm) e incubar durante 5 min en hielo. Coloque la cubeta en el electroporador y electropore las celdas con los siguientes ajustes: capacitancia 25 μFD, resistencia 400 Ω, tensión eléctrica 2,5 kV, duración del pulso 9,7 ms. Añadir 950 μL de medio líquido LB a las células, que luego se cultivan a 28 °C durante 2 h a 300 rpm en una termomezcladora. Colocar 50 μL del cultivo celular en un medio sólido LB con el antibiótico selectivo adecuado. Cultivar las placas durante 2 días a 28 °C.NOTA: Se recomienda sembrar una variedad de cultivos celulares (10 μL – 100 μL) por placa para determinar un volumen de cultivo adecuado y evitar el crecimiento excesivo de bacterias. Preparar cultivos líquidos de unas pocas colonias seleccionadas en 5 mL de medio líquido LB con antibióticos. Cultivar las bacterias durante la noche a 28 °C agitándolas. Utilice estos cultivos para las reservas de glicerol mezclando 0,5 ml de cultivo de bacterias líquidas y 0,5 ml de glicerol al 40%.NOTA: Estas colonias se verifican para detectar la presencia del transgén mediante PCR de colonias. Para ello, se añade una pequeña cantidad de una colonia de una placa a la mezcla maestra de PCR que contiene tampón, dNTP y Taq polimerasa de elección, junto con cebadores que amplifican una parte del ADN-T de un vector binario. El inóculo de las reservas de glicerol se utiliza para la transformación de las plantas. 3. Transformación de la raíz pilosa de Brassica napus DH12075 Coloque las semillas de Brassica napus DH12075 en microtubos y esterilícelas en una caja de flujo. En primer lugar, desengrasar las semillas con agua y detergente al 0,1% mientras se agitan durante 60 s. Luego, enjuague las semillas con agua seguida de etanol al 70%, ambos durante 60 s. Esterilizar las semillas con una solución al 10% de lejía comercial que contenga hipoclorito de sodio. Agita las semillas en esta solución durante 20 min. Lave las semillas 4 veces con agua estéril durante 60 s cada una. Colóquelos en placas de Petri que contengan el medio de germinación de semillas. Estratificar las semillas en frío a 4 °C durante la noche y trasladar las placas a una sala de cultivo (21 °C, 16 h luz / 8 h oscuridad). Transfiera las plántulas de 5 días a cajas de cultivo de plantas que contengan un medio de crecimiento de plantas.NOTA: La mejor eficiencia de transformación en DH12075 se identificó para plántulas de 18 días de edad. La edad de las plántulas puede optimizarse para las condiciones de crecimiento locales u otros cultivares. Inocular un cultivo líquido de Agrobacterium tumefaciens C58C1 portador de un plásmido inductor de raíces pilosas pRiA4b y el vector binario para su transformación (a partir del paso 2.11) con un bucle de inoculación. Utilice 5 ml de medio LB. Cultive este cultivo durante la noche a 28 °C hasta que alcance OD600 = 0,9 – 1.NOTA: Se utiliza agrobacteria que contiene solo el plásmido Ri si se producen raíces peludas de tipo salvaje. Inyecte una pequeña cantidad de cultivo (aproximadamente 50 μL) con una jeringa de insulina en el hipocótilo de una plántula de 18 días de edad (a partir del paso 3.4.). Perfore el hipocótilo con una aguja de 26G montada en la jeringa a aproximadamente 1 cm por encima de la superficie del medio. Inyecte el líquido en la herida. El tejido de la superficie del hipocótilo también puede ser rayado por la jeringa.NOTA: El número de plántulas inoculadas debe adaptarse a las necesidades del experimentador. Regrese las plantas a la sala de cultivo a 21 °C durante 2 a 4 semanas hasta que se forme un callo y raíces pilosas en el sitio de la herida. Cortar el callo con las raíces pilosas emergidas del hipocótilo y colocarlo en una placa de Petri con el medio de crecimiento de la raíz pilosa que contenga antibióticos selectivos (transportados por el ADN-T) y cefotaxima (200 mg/L) y ticarcilina (500 mg/L) para suprimir el crecimiento agrobacteriano. Selle las placas de Petri con cinta adhesiva permeable al gas. Cultivar las raíces pilosas a 24 °C en la oscuridad.NOTA: La concentración adecuada de antibióticos específicos utilizados para la selección funcional debe probarse con raíces peludas de tipo salvaje. Para B. napus DH12075 raíces pilosas resistentes a la kanamicina, se utiliza una concentración de 25 mg/L de kanamicina.NOTA: En este paso, es posible generar una planta compuesta que consiste en el brote de tipo silvestre y raíces peludas transgénicas que soportan el crecimiento de dicha planta. En lugar de cortar las raíces peludas de un tallo, se eliminan las raíces nativas de la planta. La planta con raíces pilosas emergentes se transfiere a una caja de cultivo de plantas con un medio de crecimiento vegetal compuesto que contiene cefotaxima (200 mg/L) y ticarcilina (500 mg/L) para suprimir el crecimiento agrobacteriano, y el antibiótico selectivo (transportado por el ADN-T). Después de 1 a 2 semanas, aísle las raíces pilosas en la placa de Petri del callo e individualícelas en placas con el mismo medio de cultivo. Transfiera el cultivo a un plato nuevo cada 4 a 5 semanas. Añadir 0,25 mg/L de IBA para aumentar la ramificación de las raíces. Reducir las concentraciones de cefotaxima y ticarcilina gradualmente en cada transferencia en 100 mg/L (es decir, el medio para la primera transferencia contiene 100 mg/L de cefotaxima y 400 mg/L de ticarcilina; para la segunda transferencia, 300 mg/L de ticarcilina, etc.). Después de 3 a 4 meses, cultive las raíces pilosas en un medio de crecimiento de raíces pilosas con 100 mg/L de ticarcilina y el antibiótico selectivo. 4. Regeneración de Brassica napus DH12075 raíces pilosas Transfiera las líneas radiculares pilosas independientes a placas con medio de regeneración en condiciones estériles con pinzas, flameadas antes de su uso. Transfiera de 5 a 10 raíces por placa de Petri y cultívelas a 21 °C en un fotoperíodo de día largo (16 h de luz / 8 h de oscuridad). Selle las placas de Petri con cinta adhesiva permeable al gas. Cada 3 a 4 semanas, transfiera las raíces pilosas a placas con medio de regeneración fresco. Tenga en cuenta que los callos se forman después de aproximadamente 2 semanas. El callo comienza a dispararse después de 2 semanas más hasta 8 a 9 semanas después de la formación del callo. Individualice los brotes y transfiéralos a cajas de cultivo de plantas con medio de elongación de brotes durante 2 a 3 semanas para promover el alargamiento de los brotes. Transfiera los brotes alargados a cajas de cultivo de plantas con un medio de inducción de raíces. Refresque el cultivo cada 3 o 4 semanas. La eficiencia de enraizamiento en DH12075 es del 87% a los 30 días y hasta el 100% a los 60 días. Transfiera las plantas enraizadas al suelo después de eliminar cualquier rastro de agente gelificante para prevenir infecciones por hongos. Asegúrese de que las plantas se aclimaten primero en los fitotrones (21 °C, fotoperíodo de día largo, 150 μE) y luego transfiéralas a un invernadero para su floración (21 °C / 18 °C, fotoperíodo de día largo, 150 μE). 5. Selección de plantas regeneradoras y T1 NOTA: Las líneas de raíz pilosas se pueden seleccionar antes de entrar en el proceso de regeneración. El tipo de selección depende del contenido que porta el transgén. Las raíces pilosas pueden ser muestreadas para la extracción de ADN y genotipado o detección de mutaciones, extracción de ARN con posterior síntesis de ADNc y RT-qPCR para el análisis del nivel de expresión del gen de elección, microscopía para la detección de fluorescencia o tratamiento para tinción de GUS. Después de la transferencia al suelo, genotipar las plantas regenerantes T0 (y las plántulas T1) nuevamente para evitar escapes de los procedimientos de selección. Las plantas T0 exhiben un fenotipo alterado llamado fenotipo Ri: crecimiento extenso de raíces, hojas rizadas y brotes enanos causados por la presencia del TL y/o TR-DNA del plásmido Ri insertado en el genoma de la planta. Para acelerar la selección de T1, utilice las semillas que contienen embriones maduros verdes (aprox. 21 – 28 días después de la polinización para DH12075 para un embrión torpedo o más antiguo) de plantas regeneradoras T0 para el rescate de embriones.Trabajar en la caja de flujo estéril. Recoger las silicuas y esterilizarlas en la superficie con etanol al 70%. Colóquelos en una cinta adhesiva de doble cara pegada con cinta adhesiva en la tapa de un plato o en un portaobjetos. Con un binocular estereoscópico, corte la sílice a lo largo de los márgenes de la válvula con una aguja de 26G. Asegúrese de que el corte no dañe las semillas. Para facilitar el agarre, monte la aguja en una jeringa de 1 ml. Abre los carpelos y pégalos a la cinta. Recoja las semillas inmaduras y transfiéralas a placas con medio para la germinación de las semillas. Selle las placas con cinta adhesiva permeable al gas. Colocar las placas en una sala de cultivo (21 °C, 16 h luz / 8 h oscuridad) hasta la germinación. Genotipar las plántulas T1 para determinar la presencia del transgén de interés y la ausencia del Ri TR/TL (Figura 1). Recolectar material foliar y extraer su ADN utilizando el método de su elección. El método CTAB se describe aquí:Recoja el material de la hoja en un microtubo de 2 ml que contenga dos perlas de cerámica. Congele el tubo en nitrógeno líquido. Muele el material con un molino de bolas. Alternativamente, se puede usar un mortero. Después de un centrifugado rápido, agregue 400 μL de tampón CTAB al polvo. Agitar brevemente, girar hacia abajo e incubar a 60 °C durante al menos 50 min. Enfríe la solución a temperatura ambiente durante 15 min. Agregue un volumen de cloroformo y mezcle suavemente.PRECAUCIÓN: Cuando use cloroformo, trabaje bajo el flujo químico y use guantes para protegerse. Cualquier solución que contenga cloroformo debe desecharse en el contenedor de basura apropiado. Centrifugar durante 5 min a 18.400 x g utilizando una centrífuga de mesa. Transferir 250 – 350 μL de la fase acuosa superior a un nuevo microtubo. Omita la interfase. Agregue un volumen de isopropanol, mezcle bien e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Centrífuga durante 40 min a 18.400 x g. Deseche el líquido y agregue 200 μL de etanol al 70%. Lavar el pellet y la centrífuga durante 15 min a 18.400 x g. Deseche el líquido. Secar al aire el pellet y añadir 50 – 100 μL de agua ultrapura. Deje que el ADN se disuelva durante 1 h o toda la noche en el refrigerador. Realizar un genotipado por PCR para el gen rolA (TL), el gen aux1 (TR) y el locus virC (Agrobacterium). Prepare la reacción de PCR utilizando el ADN preparado (del paso 5.3.), cebadores, tampón, dNTP y Taq polimerasa de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los fragmentos amplificados tienen una longitud de 200 a 500 pb.Imprimaciones específicas para rolA:Adelante: GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAGReverso: TGCGTATTAATCCCGTAGGTCImprimaciones específicas para aux1:Adelante: CATAGGATCGCCTCACAGGTReverso: CGTTGCTTGATGTCAGGAGAImprimaciones específicas para virC:Adelante: AATGCGTCTCTCTCGTGCATReverso: AAACCGACCACTAACGCGATNOTA: La transferencia e integración del ADN-T puede ser parcial, y solo partes de TL y/o TR pueden integrarse en el genoma. Por lo tanto, se recomienda analizar la presencia de otros ORF de TL (p. ej., rolB y rolC) y TR (aux2, mas1, ags1) en plántulas T1. Las secuencias de cebadores específicas de estos loci se enumeran en Jedličková et al.9. Evaluar las reacciones de PCR mediante electroforesis en gel.NOTA: Se recomienda incluir un control positivo en este análisis para garantizar que tenga ADN de grado PCR. Seleccionar la presencia (o ausencia) del transgén de acuerdo con los protocolos basados en el contenido de este transgén. Transfiera las plántulas seleccionadas al suelo. 6. Transformación y regeneración de la raíz pilosa en Arabidopsis thaliana Col-0 Esterilizar las semillas de A. thaliana en la superficie con un método de elección (lejía, etanol o cloro gaseoso). Coloque las semillas estériles en un medio para la germinación de las semillas. Después de 2 días de estratificación en frío, traslade las placas a una sala de cultivo (21 °C con fotoperiodo de día largo y 50% de humedad). Transfiera las plántulas de 1 semana a una caja de cultivo de plantas con medio de crecimiento de plantas. Prepare los cultivos de Agrobacterium como se indica en el paso 3.5. Inyecte una pequeña cantidad de cultivo (aproximadamente 50 μL) con una aguja montada en una jeringa de insulina en la base del tallo de la inflorescencia primaria (aproximadamente 1 – 2 cm por encima de la roseta) de plántulas de Arabidopsis de 1 mes de edad. El tejido de la superficie del tallo primario también puede ser rayado por la jeringa. A las 2-4 semanas después de la inyección, extirpe las raíces pilosas emergentes y cultívelas en placas de Petri con el medio de crecimiento de raíces pilosas suplementado con el antibiótico selectivo (transportado por el ADN-T) y cefotaxima (200 mg/L) y ticarcilina (500 mg/L) para suprimir el crecimiento agrobacteriano. Incubar las placas a 24 °C en la oscuridad. Después de 1 a 2 semanas, individualice las raíces pilosas en placas con el mismo medio de cultivo. Transfiera las líneas de raíz pilosas seleccionadas a un medio fresco cada 4 a 5 semanas.NOTA: Las raíces pilosas de A. thaliana son más delgadas que las de B. napus, y se debe tener precaución al transferirlas a medios frescos. Transfiera las raíces pilosas a placas con medio de regeneración para inducir la formación de callos. Cultivar las placas a 21 °C en un fotoperiodo de día largo (16 h luz / 8 h oscuridad). Los brotes emergen del callo después de 18 a 21 días de cultivo. Corte los brotes y transfiéralos a un medio de elongación de brotes durante 2 a 3 semanas para promover el crecimiento y el alargamiento. Transfiera los brotes alargados al medio de inducción de la raíz. Transfiera las plantas enraizadas al suelo. Las plantas T0 también presentan un fenotipo Ri. Realice la selección transgénica, como se describe para B. napus DH12075 (paso 5).