ثنائي الفوتون البلمرة 3D الطباعة من أجهزة زراعة الخلايا العصبية على نطاق صغير
Summary
تتيح الطباعة ثلاثية الأبعاد 3D على مقياس الميكرومتر النماذج الأولية السريعة للأجهزة البوليمرية لمزارع الخلايا العصبية. كدليل على المبدأ ، تم تقييد الروابط الهيكلية بين الخلايا العصبية من خلال إنشاء حواجز وقنوات تؤثر على نمو الخلايا العصبية ، في حين لوحظت العواقب الوظيفية لمثل هذا التلاعب من قبل الفيزيولوجيا الكهربية خارج الخلية.
Abstract
كانت الثقافات العصبية نموذجا تجريبيا مرجعيا لعدة عقود. ومع ذلك ، فإن ترتيب الخلايا 3D ، والقيود المكانية على نمو الخلايا العصبية ، والاتصال المشبكي الواقعي مفقود. هذا الأخير يحد من دراسة البنية والوظيفة في سياق التقسيم ويقلل من أهمية الثقافات في علم الأعصاب. إن تقريب الترتيب التشريحي المنظم للاتصال المشبكي خارج الجسم الحي ليس بالأمر الهين ، على الرغم من كونه مفتاحا لظهور الإيقاعات ، واللدونة المشبكية ، وفي النهاية ، الفيزيولوجيا المرضية للدماغ. هنا ، يتم استخدام بلمرة الفوتون (2PP) كتقنية طباعة ثلاثية الأبعاد ، مما يتيح التصنيع السريع لأجهزة زراعة الخلايا البوليمرية باستخدام polydimethyl-siloxane (PDMS) على مقياس ميكرومتر. بالمقارنة مع تقنيات التشكيل المتماثلة التقليدية القائمة على التصوير الضوئي الدقيق ، تتيح الطباعة على نطاق صغير 2PP تحولا سريعا وبأسعار معقولة للنماذج الأولية. يوضح هذا البروتوكول تصميم وتصنيع أجهزة الموائع الدقيقة القائمة على PDMS والتي تهدف إلى زراعة الشبكات العصبية المعيارية. كدليل على المبدأ ، يتم تقديم جهاز من غرفتين لتقييد الاتصال جسديا. على وجه التحديد ، يفضل النمو المحوري غير المتماثل أثناء التطور خارج الجسم الحي ويسمح بتوجيهه من غرفة إلى أخرى. من أجل التحقيق في العواقب الوظيفية للتفاعلات المشبكية أحادية الاتجاه ، يتم اختيار صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة التجارية لمراقبة النشاط الكهربائي الحيوي للوحدات العصبية المترابطة. هنا ، يتم توضيح طرق 1) تصنيع القوالب بدقة ميكرومتر و 2) إجراء تسجيلات خارج الخلية متعددة المواقع في المختبر في الثقافات العصبية القشرية للفئران. من خلال خفض التكاليف وإمكانية الوصول إلى الطباعة ثلاثية الأبعاد 2PP في المستقبل ، ستصبح هذه الطريقة أكثر أهمية عبر مختبرات الأبحاث في جميع أنحاء العالم. خاصة في مجال التكنولوجيا العصبية وتسجيل البيانات العصبية عالية الإنتاجية ، فإن سهولة وسرعة النماذج الأولية المبسطة في النماذج المختبرية ستحسن التحكم التجريبي والفهم النظري للأنظمة العصبية واسعة النطاق في الجسم الحي .
Introduction
يمثل التحقيق في النشاط العصبي في الكائنات الحية التي تتصرف العديد من التحديات. على سبيل المثال ، الوصول المادي إلى أنسجة المخ محدود بالحاجة إلى الحفاظ على سلامتها ، لذلك يتم النظر في المناطق السطحية للدماغ بسهولة أكبر. غالبا ما يكون عزل أهداف محددة داخل الأنسجة السليمة مهمة شاقة وأحيانا مستحيلة. على الرغم من أن الثقافات العصبية المتجانسة المنفصلة توفر وصولا سهلا إلى الخصائص الجزيئية والكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية للمكونات الخلوية الفردية (الفرعية) للدائرة العصبية ، إلا أن الاتصال الواقعي والتنظيم التشريحي للدماغ السليم مفقود. ألهمت هذه القيود الأساسية الجهود البحثية لتحقيق حل وسط ، حيث يتم تجنب التعقيد في الجسم الحي بينما يمكن بناء الهيكل في المختبر ، وهو عند الطلب1،2،3،4،5،6،7،8،9. على وجه الخصوص ، كانت الثقافات العصبية المعيارية موضوع بحث مكثف على مدى العقود الماضية ، بهدف معالجة الأسئلة الرئيسية لفسيولوجيا الدماغ كما هو موضح أدناه.
التنظيم: تظهر الدراسات في الجسم الحي أن الدماغ منظم تشريحيا في طبقات ذات أنواع خلايا دقيقة ومصفوفات من الإسقاطات. كشفت المقايسات الوظيفية عن تنظيم الشبكات العصبية في مجموعات ووحدات العقد ، مع مخططات اتصال دقيقة10,11. ومع ذلك ، لا يمكن دراسة دور الاتصال وزخارف الدوائر الدقيقة بشكل كاف في الجسم الحي بسبب العدد الهائل من نقاط الاشتباك العصبي المعنية ، فضلا عن التأثيرات المتشابكة للتطور واللدونة المعتمدة على النشاط.
نقل الإشارة: في الثقافات في الجسم الحي أو العشوائي في المختبر ، من الصعب تقييم نقل الإشارة. يتطلب فحص التوصيل المحوري وجهد العمل على طوله توجيه نمو الخلايا العصبية عن طريق وظائف السطح أو الزخرفة الكيميائية ، مما يوفر نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية في قراءات النشاط الكهربائيخارج الخلية 12.
الصلة الانتقالية: يتطلب فك رموز الدور الحصري للعناصر قبل مقابل ما بعد المشبكي عبر الحالات المرضية الوصول إلى هذه العناصر بشكل فردي. الثقافات المعيارية ذات الاتصال المقيد ، والتي تفصل بشكل فعال العناصر قبل وبعد المشبكي ، هي أدوات لا غنى عنها لتحقيق هذه الغاية13.
توجد عدة طرق للحصول على شكل من أشكال البنية في الثقافة العصبية. يمكن تصنيفها على نطاق واسع على أنها معالجة سطحية كيميائية وفيزيائية9. تعتمد الطرق السابقة 14,15 على ميل الخلايا العصبية للالتصاق ببعض المركبات الكيميائية (الحيوية). وهذا يتطلب ترسيب جزيئات لاصقة أو جذابة على سطح بدقة متناهية الصغر واتباع نمط مفصل. في حين أن هذا يسمح بتغطية جزئية لسطح الخلايا ، باتباع النمط المطلوب ، فإن الطرق الكيميائية محدودة بطبيعتها ولها معدل نجاح منخفض نسبيا في توجيه نمو الخلاياالعصبية 16. يتطلب التحكم الكامل في اتجاه المحور إنشاء تدرج مكاني للمواد الكيميائية المخصصة لتشكيل التوجيه المحوري17. تتضمن الطرق الأخيرة معالجة السطح المادي وتستخدم بشكل أكثر شيوعا لهيكلة الشبكات العصبية في المختبر. يتم تقييد الخلايا العصبية جسديا في المواقع المرغوبة من خلال الحدود الهندسية ، مثل الغرف المجهرية والجدران والقنوات وما إلى ذلك ، مما يشكل بوليمر متوافق حيويا مثل polydimethylsiloxane (PDMS) 3،5،6،7،18،19،20 يتم علاجه وتصلبه في جهاز الموائع الدقيقة. الطريقة الفعلية لتصنيع الموائع الدقيقة PDMS هي الطباعة الحجرية الضوئيةالناعمة 21 ، حيث يتم تصميم قناع ثنائي الأبعاد على نطاق صغير ويستخدم لحفر مادة قائمة على السيليكون بشكل انتقائي عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية. باختصار ، يتم طلاء راتنج قابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية (أي مقاوم للضوء) على رقاقة سيليكون من خلال طلاء مغزلي ، يصل إلى ارتفاع معين تحدده لزوجته وسرعة دورانه. بعد ذلك ، يتم وضع القناع المنقوش فوق المقاوم للضوء وتعريضه للأشعة فوق البنفسجية. ستسمح المناطق الشفافة داخل القناع ، المقابلة للمناطق ذات الاهتمام ، للأشعة فوق البنفسجية بتحفيز التشابك الموضعي للجزيئات المقاومة للضوء. يتم غسل مناطق مقاومة الضوء غير المكشوفة باستخدام مذيب ، مما يؤدي إلى تكوين قالب رئيسي. يتم استخدام هذا بشكل متكرر لخبز المطاط الصناعي من الاختيار (أي PDMS) ، والذي يتم نقشه بعد ذلك بالأشكال الهندسية المطلوبة في العديد من النسخ المتماثلة حسب الرغبة. طريقة التصنيع هذه هي الطريقة الأكثر شيوعا لتصنيع أجهزة الموائع الدقيقة22. ربما تكون القيود الرئيسية للطباعة الحجرية الضوئية اللينة هي الشرط الأساسي للاستثمار الرأسمالي الملحوظ وعدم إلمام المختبرات البيولوجية بالتقنيات والخبرات المطلوبة. إن تحضير القناع وخطوات الطباعة الحجرية الضوئية الناعمة المطلوبة لتصميم أشكال هندسية معقدة متعددة الارتفاعات ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية ليست تافهة23 وغالبا ما تتطلب الاستعانة بمصادر خارجية. على الرغم من اقتراح طرق بديلة ومنخفضة الميزانية ، إلا أنها لا تفي دائما بمتطلبات الدقة العالية للنماذج الأوليةالبيولوجية 24.
هنا ، يتم تقديم طريقة تصنيع بديلة ، تعتمد على بلمرة الفوتون (2PP) والتصنيع المضاف. إنه واضح ومباشر ولا يتطلب في حد ذاته خبرة متقدمة في التصنيع الدقيق والتصوير الضوئي. ظهر مجال البحث في التصنيع الدقيق 2PP في أواخر 9025 ، ومنذ ذلك الحين ، شهد نموا هائلا26. يمكن العثور على المزيد حول المبادئ الأساسية لهذه التقنية في مكان آخر26. باختصار ، من خلال تركيز نبضة ضوء الإثارة في الفضاء ثلاثي الأبعاد ، يستفيد 2PP من الاعتماد غير الخطي لامتصاص الفوتون المتعدد على الشدة. وهذا يمنح القدرة على الامتصاص المحصور ، مما يضمن الإثارة الدقيقة والانتقائية داخل المناطق المحلية للغاية. في جوهرها ، تخضع مادة مقاومة ضوئية ذات نغمة سلبية ، وهي مادة ذات قابلية ذوبان منخفضة عند التعرض للضوء ، لحزمة مركزة من نبضات ليزر الفيمتو ثانية في دورة عمل منخفضة27. وهذا يسمح بنبضات ذات كثافة عالية عند متوسط قوى منخفض ، مما يتيح البلمرة دون الإضرار بالمادة. يؤدي تفاعل المونومرات الجذرية المستحثة بالضوء إلى ظهور أوليغومرات جذرية ، مما يؤدي إلى البلمرة التي تمتد في جميع أنحاء المقاومة الضوئية حتى حجم مميز ، أي فوكسل ، الذي يعتمد حجمه على شدة ومدة نبضات الليزر28.
في هذا العمل ، يتم تقديم مكونين: أ) التصميم والتصنيع السريع لقالب مطبوع 3D ، قابل لإعادة الاستخدام عدة مرات لإنتاج أجهزة زراعة الخلايا العصبية البوليمرية التي يمكن التخلص منها (الشكل 1) ، و ب) اقترانها الميكانيكي على سطح ركائز زراعة الخلايا العصبية المستوية ، أو حتى صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة المدمجة في الركيزة القادرة على تسجيلات متعددة المواقع للإشارات الكهربائية الحيوية.
يتم وصف التصميم بمساعدة الكمبيوتر لنموذج ميكانيكي ثلاثي الأبعاد بإيجاز شديد هنا ويرافقه الخطوات المؤدية إلى قالب مطبوع ثلاثي الأبعاد وتصنيع أجهزة PDMS مفصلة أيضا.
يمكن استخدام مجموعة متنوعة من تطبيقات برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر لإنشاء نموذج كائن 3D للبدء وإنتاج ملف STL للتحكم في عملية طباعة 2PP. ضمن جدول المواد ، يكون التطبيقان الأول والأخير المدرجان مجانيا أو مزودين بترخيص مجاني. يتطلب بناء نموذج 3D دائما إنشاء رسم 2D ، والذي يتم بثقه بعد ذلك في خطوات النمذجة اللاحقة. لإثبات هذا المفهوم ، يتم تمييز عملية تصميم برنامج 3D CAD العامة في قسم البروتوكول ، مما يؤدي إلى هيكل مصنوع من مكعبات متداخلة. للحصول على معلومات أكثر شمولا ، يتوفر عدد من البرامج التعليمية عبر الإنترنت وموارد التدريب المجانية ، كما هو موضح في جدول المواد.
ثم يتم ترجمة ملف STL الناتج إلى سلسلة من الأوامر ليتم تنفيذها بواسطة طابعة 3D (أي إجراء التقطيع). بالنسبة للطابعة 2PP 3D المحددة المستخدمة ، يتم استخدام برنامج DeScribe لاستيراد ملف STL وتحويله إلى تنسيق لغة الكتابة العامة (GWL) الخاص. يتوقف نجاح عملية الطباعة 2PP على معايير مختلفة ، لا سيما طاقة الليزر وسرعة المسح الضوئي والخياطة ومسافات تقطيع الفقس. يعتمد اختيار هذه المعلمات ، إلى جانب اختيار الهدف ومقاومة الضوء ، على أصغر ميزات التصميم ، بالإضافة إلى التطبيق المقصود. وبالتالي ، يصبح تحسين المعلمات ضروريا لتلبية متطلبات سيناريوهات التصميم المختلفة وحالات الاستخدام. لهذا العمل ، تم اعتبار الوصفة الموصى بها IP-S 25x ITO Shell (3D MF) كتكوين لمعلمات الطباعة. في النهاية ، تتم طباعة جزء مطبوع مستقر ميكانيكيا بالدقة اللازمة مع تقليل وقت الطباعة 3D.
يتألف تصميم القالب وملف STL ذي الصلة ، الموضح في هذا العمل ، من إطار مربع لفصل مساحة زراعة الخلايا في جزأين: منطقة خارجية (أي يشار إليها باسم المصدر لاحقا) ومنطقة داخلية (أي يشار إليها باسم الهدف لاحقا). ترتبط هاتان الحجرتان من خلال مجموعات من القنوات الدقيقة ، تتميز كل منها بحدود حادة الزاوية ، مصممة خصيصا لإعاقة نمو الخلايا العصبية من الهدف إلى المصدر ، ولكن ليس العكس ، وبالتالي تعزيز الاتصال المشبكي الاتجاهي بين الخلايا العصبية التي تنمو في المنطقتين.
استخدمت الدراسات السابقة أشكال هندسية مختلفة من القنوات الدقيقة لتشجيع النمو الاتجاهي للخلايا العصبية. ومن الأمثلة على ذلك الأشكال المثلثة18 ، والهياكل الشائكة للقناة19 ، والقنوات المستدقة20. هنا ، يتم استخدام تصميم يتميز بحواجز زاوية حادة عبر حدود القناة الصغيرة ، والتي تتميز أيضا بمداخل غير متماثلة. تعمل هذه القنوات الدقيقة على إنشاء استمرارية بين الجزء الداخلي المغلق ، والمقصورة المستهدفة ، والمنطقة الخارجية ، حجرة المصدر. تم تصميم شكل القمع للجزء الأولي من القنوات الدقيقة ، من جانب المصدر ، لتعزيز تكوين الحزم المحورية ونموها على طول أقصر مسار ، أي خط مستقيم ، يربط المصدر بالهدف. المساحة المثلثة التي تتحقق من خلال مواجهة الزوايا الحادة لها حجم أكبر في الجانب المستهدف بهدف تأخير مسار الأعصاب بشكل فعال مع تفضيل التصوير السريع للحزم الناشئة من المصدر واحتلال المساحة المتاحة. إن اختيار 540 ميكرومتر لطول القنوات الدقيقة يرشح بشكل فعال النمو الشجيري الأقصر بشكل عام39. بالإضافة إلى ذلك ، يمنع ارتفاعها البالغ 5 ميكرومتر الخلية الجسدية من اختراق القنوات الدقيقة. بشكل عام ، أثبت هذا التكوين أنه يعزز الاتصال أحادي الاتجاه بين الوحدات الخارجية والمصدر والداخلية والوحدات المستهدفة ، ويتم تقديمه هنا كدليل على المبدأ من بين العديد من الخيارات البديلة.
في حين أن أجهزة PDMS ، المصنعة بواسطة قالب 2PP ، يمكن توصيلها بسطح ركائز زراعة الخلايا الشائعة ، مثل أغطية الزجاج أو أطباق بتري ، في هذا العمل تم استخدام صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة المدمجة في الركيزة المتاحة تجاريا. لم يتم بذل أي جهد لتحسين تصميم 3D لتخطيط صفيف microelectrode ، وتم إجراء اقتران ميكانيكي تحت توجيه المجهر المجسم يهدف فقط إلى وضع الجهاز عبر الصفيف ، وترك بعض microelectrode مكشوفة في كلا الجانبين ، المصدر والهدف. وهذا يتيح التقييم الأولي للعواقب الوظيفية للاتصال المقيد في مزارع الخلايا العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من كونه عمره عقودا ، إلا أن تطبيق تقنية 2PP في قولبة النسخ المتماثلة القائمة على PDMS على نطاق ميكرومتر هو تطور حديث43,44. وفي هذا السياق، تناقش أدناه سلسلة من النقاط لمساعدة المستخدمين على استنساخ هذا العمل بفعالية.
لتصميم نموذج 3D ، تأكد من أن النموذج لا يحتوي على ثقوب أو تقاطعات ذاتية. قم بامتياز تنسيق الملف الثنائي عند الحفظ بتنسيق STL ، لحجم ملفه الأصغر من ترميز ASCII. هذا مفيد بشكل خاص للتصميمات ذات الأشكال الهندسية المعقدة وللكائنات ذات العرض المليلتر. استخدام ملفات STL الثنائية يعني أيضا انخفاض تحميل وحدة المعالجة المركزية، في وقت لاحق في عملية إعداد الجزء الميكانيكي ليتم طباعتها 3D. يتم تمثيل الأبعاد المادية للميزات داخل ملف STL في وحدات بلا أبعاد. أثناء المعالجة اللاحقة لملف STL ، يتم تفسير الوحدات على أنها ميكرومتر. لذلك ، يوصى باعتماد وحدة الاهتمام مقدما ، أي ميكرومتر ، عند إعداد الملف. يتم تحديد دقة النموذج المطبوع من خلال عدد الأسطح التي تقترب من المثلثات الفسيفسائية. بالنسبة لعدد غير كاف من الأسطح ، ستظهر خشونة سطح غير مرغوب فيها. ومع ذلك ، فإن استهداف الدقة العالية بشكل مفرط من قبل عدد كبير جدا من الأسطح يأتي على حساب تحميل حسابي مرتفع ، مما يتسبب في بطء معالجة الملفات.
للطباعة ثلاثية الأبعاد ، أثناء الطباعة ، يتم تشكيل الكائن المادي ثلاثي الأبعاد باستخدام مسح galvo السريع في المستوى x-y وحركة بيزو في الاتجاه z. هذا يركز شعاع ليزر الفيمتو ثانية داخل أي فوكسل 3D معين. ومع ذلك ، عندما تكون هياكل الطباعة أكبر من نطاقات التغطية المكانية ل galvo و piezo ، يجب تقسيم الكائن برمجيا إلى كتل. في حين أن هذا مطلب للأجزاء المطبوعة بحجم المليمتر ، فإن التقاطعات بين الكتل مرتبطة بخطوط خياطة (غير كاملة). يعد التحسين الدقيق لعدد الكتل ووضع خطوط الخياطة في اتجاهات x و y و z أمرا بالغ الأهمية لتجنب تعطيل الميزات الهندسية الحرجة للكائن النهائي بخطوط خياطة. قد تتشكل الفقاعات في واجهة الطباعة لأسباب مختلفة (على سبيل المثال ، شوائب الركائز المقاومة للضوء وعدم التجانس) ، وتؤثر سلبا على جودة وسلامة الهيكل المطبوع. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي طاقة الليزر العالية إلى زيادة حدوثها. سيؤدي تقليل طاقة الليزر ، عند أدنى طبقة من الجزء المطبوع ، إلى تقليل فرص تكوين الفقاعة. كبديل لطباعة الجزء بأكمله كهيكل صلب ، يمكن النظر في طريقة الصدفة والسقالة. يتضمن طباعة السطح الخارجي للجزء (الغلاف) فقط بالإضافة إلى عناصر المنشور الثلاثي بداخله. يتم فصل هذه العناصر بواسطة طبقات أفقية (سقالة) ، تحمل الراتنج غير المبلمر في جيوب صغيرة. تعمل هذه الطريقة على تقصير وقت الطباعة بشكل كبير ، وهو مناسب بشكل خاص للهياكل بحجم المليمتر. ومع ذلك ، نظرا لبقاء راتنج غير مبلمر ، فإن التعرض للأشعة فوق البنفسجية بعد الطباعة أمر ضروري لضمان الاستقرار الميكانيكي الكامل ، على الرغم من أنه يجب تنفيذ هذه الخطوة برفق لتجنب أي تشوه في الجزء المطبوع. يعتمد وقت ما بعد المعالجة على الراتنج المختار وسمك الجزء وطاقة الأشعة فوق البنفسجية40. للحصول على أفضل النتائج ، يوصى بإجراء تجربة أولية لتقدير الوقت اللازم للمعالجة الكاملة العمق ، باستخدام قطرة من مقاومة الضوء وتقييم قطعها المقطعي ، بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية. تتراوح فترة المعالجة المعتادة بين 5 إلى 20 دقيقة.
بالنسبة لقولبة النسخ المتماثلة PDMS ، قد يكون التصنيع النظيف لجهاز PDMS بميزات مقياس ميكرومتر ، مع عدم وجود مرافق غرفة نظيفة ، أمرا صعبا: يمكن أن تتواجد الجسيمات الدقيقة المحمولة بالهواء على السطح شديد الالتصاق لنظام PDMS وتعيق الختم بين الجهاز والركيزة ، أو تسد قسم القنوات الدقيقة الفردية. إن تنفيذ خطوات البروتوكول تحت غطاء التدفق الصفحي وحماية سطح PDMS باستمرار باستخدام الأيزوبروبانول يقلل بشكل كبير من مخاطر التلوث. تؤثر درجة حرارة المعالجة ومدتها بشكل مباشر على الربط المتقاطع PDMS والخصائص الفيزيائية الناتجة. على وجه الخصوص ، يعد التصاق PDMS المعالج عاملا حاسما. من ناحية ، يلزم وجود ختم محكم بين جهاز PDMS ، والسطح المستخدم لزراعة الخلايا العصبية (على سبيل المثال ، غطاء زجاجي أو MEA) ، لتقييد مرور الخلايا العصبية بشكل فعال. من ناحية أخرى ، يجب أن يتم توصيل جهاز PDMS بالسطح بشكل عكسي ، بحيث لا تتلف الطبقة العازلة الحساسة MEAs بعد إزالة الجهاز. بينما يحدث انكماش PDMS أثناء المعالجة ويمكن تصحيحه عن طريق إعادة قياس القالب مقدما ، بالنسبة لدرجات الحرارة وفترات المعالجة المشار إليها هنا ، سيكون الانكماش أقل من 2٪ 42 ولن يؤثر بشكل كبير على أجهزة PDMS أحادية الطبقة. بشكل عام ، اتبع بدقة قيم درجة حرارة المعالجة ومدتها الموصى بها ، للحصول على أفضل النتائج.
نظرة عامة على مزايا وقيود الطريقة
تم اقتراح تقنية تعتمد على الكتابة بالليزر المباشر 2 فوتون للتصنيع السريع للأجهزة البوليمرية الصغيرة الحجم للدراسة التجريبية للشبكات العصبية المعيارية. على عكس الطباعة الحجرية الضوئية اللينة ، لا يتطلب النهج المقترح مستوى عال من الخبرة الفنية ، بشرط أن يكون إعداد الطباعة الوظيفية 2PP 3D متاحا وعمليا. ومن اللافت للنظر أن هذه الطريقة تمكن من الانتقال من نموذج 3D المصمم من قبل CAD إلى جهاز PDMS وظيفي في غضون يوم واحد ، وبالتالي توفير مسار مباشر وفعال من المفهوم إلى الإدراك الملموس. على وجه التحديد ، فإن اختيار وضع الطباعة بالصدفة والسقالة يقلل بشكل كبير من الوقت اللازم لإنشاء القالب ، حيث تتم طباعة جزء صغير فقط من حجمه. تضمن المعالجة اللاحقة بالأشعة فوق البنفسجية للمكون المطبوع استقراره الميكانيكي ومتانته ، كما تم التحقق منه هنا على مدار 50 دورة صب باستخدام PDMS.
بالمقارنة مع الطرق التقليدية ، تتميز الطباعة 2PP 3D بميزة واضحة ، والتي تكون أكثر وضوحا عندما يتعلق الأمر بتصنيع القوالب ذات نسبة العرض إلى الارتفاع الكبيرة ، ومتطلبات الدقة الصعبة ، والهندسة ثلاثية الأبعاد المعقدة. إن إنتاج القوالب الرئيسية باستخدام الطباعة الحجرية القياسية للأشعة فوق البنفسجية مقيد بسمك مقاوم يبلغ حوالي 200 ميكرومتر. مطلوب تسلسلات معقدة من دورات الطلاء المغزلي والتعرض35 ، أو LIGA المكلفة (الطباعة الحجرية ، والطلاء الكهربائي ، والقولبة) ، أو عمليات النقش الأيوني التفاعلي العميق (DRIE)36 لتحقيق نسب ارتفاع وعرض إلى ارتفاع أكبر. في تناقض حاد ، كما هو موضح في العمل الرائد ل Kumi et al. في 201037 ، توفر تقنية 2PP نطاقا غير محدود بشكل أساسي لنسبة العرض إلى الارتفاع للأجزاء المطبوعة ، والتي تمتد من دون ميكرومتر إلى ملليمتر. هنا ، تم توضيح عملية التصنيع الدقيق للقالب مع اختلاف كبير في ارتفاع أجزائه ، والتي تتميز بتمييز يزيد عن 100 ضعف بين ارتفاع القنوات الدقيقة (5 ميكرومتر والحد الأقصى لارتفاع القالب (545 ميكرومتر ؛ انظر الشكل 2).
أيضا ، يمكن تحقيق استبانة الميكرومتر الفرعي بسهولة باتباع مواصفات البروتوكول الموضحة. وبالمقارنة ، فإن تحقيق دقة محسنة للقالب من خلال الطباعة الحجرية الضوئية للأشعة فوق البنفسجية يتطلب استثمار رأس المال. يتم تسعير الأقنعة ذات الدقة الأفضل ، باستخدام ترسب الكروم على الكوارتز بدقة اسمية تبلغ 600 نانومتر ، بعدة أوامر من حيث الحجم أعلى من أقنعة الشفافية العلوية المطبوعة بالليزر ، والتي تمتلك دقة 250 ميكرومتر35 ، ومع ذلك انظر عمل Pirlo et al.41. لكي تكون قابلة للتطبيق للاستخدام الداخلي ، يجب أن تكون الطريقة المختارة فعالة من حيث التكلفة. بالنسبة للعديد من المختبرات البيولوجية ، فإن التكلفة الإجمالية المرتبطة بالطباعة الحجرية الضوئية اللينة التقليدية أو الكتابة بالليزر المباشر تمثل حاجزا. في حين أنه من الممكن جعل كلتا التقنيتين أكثر سهولة من خلال شراء وتجميع المكونات الأساسية ، فإن هذا النهج يتطلب خبرة إضافية ولا يزال يتطلب استثمارا ملحوظا. في هذا السياق ، هناك نقطة أساسية يجب مراعاتها وهي الطيف الأوسع للتطبيقات التي يمكن تحقيقها من خلال الكتابة بالليزر المباشر. على عكس الطباعة الحجرية الضوئية اللينة التقليدية ، التي تقتصر في المقام الأول على التصنيع الدقيق للقوالب ، فإن الطباعة 2PP 3D تعرض تنوعا ملحوظا. تمتد تطبيقاته المحتملة من الموائع الدقيقة والبصريات الدقيقة إلى الضوئيات المتكاملة والميكانيكا الدقيقة. وهذا يجعل الاستثمار في هذه التكنولوجيا جذابا كمرفق مشترك لمجالات علمية متعددة ومتنوعة. على سبيل المثال ، المنهجية القائمة على 2PP المصممة في هذا البروتوكول هي نتيجة تعاون متعدد التخصصات بين أقسام علم الأعصاب والرياضيات داخل مؤسستنا. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تطوير مقاومة الضوء مجالا نشطا للبحث ، ويمكن أن يوسع نطاق تطبيقات الطباعة 2PP 3D. ومن الأمثلة على ذلك إدخال راتنج IP-PDMS مؤخرا. من خلال البلمرة في هياكل ذات خصائص مثل PDMS38 ، يفتح هذا الراتنج إمكانية التصنيع الدقيق المباشر للمكونات المتوافقة حيويا التي لها سطح معقد أو تحتوي على مساحات مجوفة. تقف هذه التعقيدات كحواجز أمام تحقيق نتائج مماثلة من خلال إجراءات صب النسخ المتماثلة التقليدية.
كدليل على هذه الطريقة ، تم تقديم أدلة تشير إلى تطوير اتصال أحادي الاتجاه بين وحدتين في شبكة عصبية معيارية. كان للقالب الصغير ، الذي تم تصنيعه بواسطة تقنية 2PP ، قدرة تحمل كافية للخضوع لصب PDMS متعدد ، ولديه الدقة المطلوبة على نطاق صغير. وفي الختام، فإن نطاق تطبيق البروتوكول الموصوف في هذا العمل يتجاوز الحالة الموضحة. مع انتشار الوصول إلى تقنية الطباعة 2PP بشكل متزايد ، سينخفض الاستثمار الأولي المطلوب لتنفيذها بينما سيتوسع نطاق تطبيقاتها المحتملة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر M.G. بالدعم المالي من برنامج إطار عمل H2020 التابع للاتحاد الأوروبي من خلال مجلس الابتكار الأوروبي (مشروع IN-FET ، GA n. 862882 ، مشروع Arbor-IO ، FLAG-ERA ومشروع الدماغ البشري ، ID 650003) ومن SISSA (منطقة علم الأعصاب). تعترف G.N. بالدعم المالي من وزارة الجامعات والبحوث الإيطالية (MUR) من خلال منحة Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (مجال الرياضيات). نشكر M. Gigante و B. Pastore و M. Grandolfo على مساعدتهم في الطباعة ثلاثية الأبعاد 3D ، وزراعة الخلايا ، والتصوير الحي ، وكذلك Drs. P. Massobrio و P. Heppenstall و L. Ballerini و Di Clemente و HC Schultheiss على المناقشات. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
| BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). ————————————– Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
| CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-AP5 | Tocris | #0106 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
| Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
| in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
| NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
| Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
| Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
| Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |
References
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Dual-compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front Neuroeng. 4, 13 (2011).
- Maeda, E., Robinson, H. P. C., Kawana, A. The mechanisms of generation and propagation of synchronized bursting in developing networks of cortical neurons. J Neurosci. 15 (10), 6834-6845 (1995).
- Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Designing neural networks in culture. Proc IEEE Inst Electr Electron Eng. 98 (3), 398-406 (2010).
- DeMarse, T. B., Pan, L., Alagapan, S., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Feed-forward propagation of temporal and rate information between cortical populations during coherent activation in engineered in vitro networks. Front Neural Circuits. 10, 32 (2016).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J Neural Eng. 9 (3), 036010 (2012).
- Brofiga, M., Pisano, M., Tedesco, M., Raiteri, R., Massobrio, P. Three-dimensionality shapes the dynamics of cortical interconnected to hippocampal networks. J Neural Eng. 15 (5), 056044 (2020).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PLoS One. 9 (9), e107400 (2014).
- Hasan, M. F., Berdichevsky, Y. Neural circuits on a chip. Micromachines. 7 (9), 157 (2016).
- Aebersold, M. J., et al. 34;Brains on a chip": Towards engineered neural networks. TrAC Tren Anal Chem. 78, 60-69 (2016).
- Zamora-López, G., Chen, Y., Deco, G., Kringelbach, M. L., Zhou, C. Functional complexity emerging from anatomical constraints in the brain: The significance of network modularity and rich-clubs. Sci Rep. 6, 38424 (2016).
- Eytan, D., Marom, S. Dynamics and effective topology underlying synchronization in networks of cortical neurons. J Neurosci. 26 (33), 8465-8476 (2006).
- Pan, L., Alagapan, S., Franca, E., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Propagation of action potential activity in a predefined microtunnel neural network. J Neural Eng. 8 (4), 046031 (2011).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting corticostriatal network on-a-chip reveals the contribution of the presynaptic compartment to Huntington’s disease. Cell Rep. 22 (1), 110-122 (2018).
- Kleinfeld, D., Kahler, K., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
- Vogt, A. K., Wrobel, G., Meyer, W., Knoll, W., Offenhäusser, A. Synaptic plasticity in micropatterned neuronal networks. Biomaterials. 26 (15), 2549-2557 (2005).
- Staii, C., et al. Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy. Biomaterials. 30 (20), 3397-3404 (2009).
- Fricke, R., et al. Axon guidance of rat cortical neurons by microcontact printed gradients. Biomaterials. 32 (8), 2070-2076 (2011).
- Gladkov, A., et al. Design of cultured neuron networks in vitro with predefined connectivity using asymmetric microfluidic channels. Sci Rep. 7 (1), 15625 (2017).
- le Feber, J., Postma, W., de Weerd, E., Weusthof, M., Rutten, W. L. Barbed channels enhance unidirectional connectivity between neuronal networks cultured on multi electrode arrays. Front Neurosci. 9, 412 (2015).
- Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie – International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. Eur Phys J Spec Top. 204, 85-101 (2012).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. J Vis Exp. (119), e55276 (2017).
- Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. (153), e60307 (2019).
- Maruo, S., Nakamura, O., Kawata, S. Three-dimensional microfabrication with two-photon-absorbed photopolymerization. Opt Lett. 22 (2), 132-134 (1997).
- Baldacchini, T. . Three-dimensional microfabrication using two-photon polymerization: Fundamentals, technology, and applications. , (2015).
- Madou, M. J. . Fundamentals of Microfabrication. , (2018).
- Sun, H. B., Kawata, S. Two-photon photopolymerization and 3D lithographic microfabrication. NMR, 3D Anal, Photopolymeriz. Adv Poly Sci. 170, 169-273 (2004).
- Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: Lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
- Kamioka, H., Maeda, E., Jimbo, Y., Robinson, H. P. C., Kawana, A. Spontaneous periodic synchronized bursting during formation of mature patterns of connections in cortical cultures. Neurosci Lett. 206 (2-3), 109-112 (1996).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). J Vis Exp. (39), e2056 (2010).
- Mahmud, M., Pulizzi, R., Vasilaki, E., Giugliano, M. QSPIKE tools: A generic framework for parallel batch preprocessing of extracellular neuronal signals recorded by substrate microelectrode arrays. Front Neuroinform. 8, 26 (2014).
- Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6 (1), 24701 (2016).
- Scarsi, F., Tessadori, J., Chiappalone, M., Pasquale, V. Investigating the impact of electrical stimulation temporal distribution on cortical network responses. BMC Neurosci. 18 (1), 49 (2017).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Kim, K., et al. Rapid replication of polymeric and metallic high aspect ratio microstructures using PDMS and liga technology. Microsystem Technologies. 9 (1-2), 5-10 (2002).
- Kumi, G., Yanez, C. O., Belfield, K. D., Fourkas, J. T. High-speed multiphoton absorption polymerization: Fabrication of microfluidic channels with arbitrary cross-sections and high aspect ratios. Lab Chip. 10 (8), 1057-1060 (2010).
- Bunea, A. I., et al. et al.Micro 3D printing by two-photon polymerization: Configurations and parameters for the nanoscribe system. Micro. 1 (2), 164-180 (2021).
- Taylor, A., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Oakdale, J. S., Ye, J., Smith, W. L., Biener, J. Post-print UV curing method for improving the mechanical properties of prototypes derived from two-photon lithography. Opt. Express. 24 (24), 27077-27086 (2016).
- Pirlo, R. K., Sweeney, A. J., Ringeisen, B. R., Kindy, M., Gao, B. Z. Biochip/laser cell deposition system to assess polarized axonal growth from single neurons and neuron/glia pairs in microchannels with novel asymmetrical geometries. Biomicrofluidics. 5 (1), 13408 (2011).
- Madsen, M. H., Feidenhans’l, N. A., Hansen, P. E., Garnæs, J., Dirscherl, K. Accounting for PDMS shrinkage when replicating structures. J Micromech Microeng. 24 (12), 127002 (2014).
- Comina, G., Suskaa, A., Filippini, D. PDMS lab-on-a-chip fabrication using 3D printed templates. Lab Chip. 14 (2), 424-430 (2013).
- Chan, H. N., et al. one-step molding of 3D-printed structures for convenient fabrication of truly 3D PDMS microfluidic chips. Microfluid Nanofluid. 19, 9-18 (2015).
