2光子重合によるマイクロスケール神経細胞培養装置の3Dプリンティング
Summary
マイクロメートルスケールの3Dプリンティングにより、神経細胞培養用のポリマーデバイスのラピッドプロトタイピングが可能になります。原理証明として、ニューロン間の構造的結合は、神経突起伸長に影響を与える障壁とチャネルを作成することによって制約され、そのような操作の機能的結果は細胞外電気生理学によって観察されました。
Abstract
ニューロン培養は、数十年にわたって参照実験モデルとなってきました。しかし、3D細胞配列、神経突起伸長の空間的制約、および現実的なシナプス接続性が欠落しています。後者は、区画化の文脈における構造と機能の研究を制限し、神経科学における文化の重要性を減少させます。シナプス結合の構造的な解剖学的配置を ex vivo で近似することは、リズム、シナプス可塑性、そして最終的には脳の病態生理学の出現の鍵であるにもかかわらず、自明ではありません。ここでは、3Dプリンティング技術として2光子重合(2PP)が採用されており、ポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いた高分子細胞培養装置をマイクロメートルスケールで迅速に作製することができます。2PPマイクロスケール印刷は、マイクロフォトリソグラフィーに基づく従来のレプリカ成形技術と比較して、プロトタイプの迅速かつ手頃な価格のターンアラウンドを可能にします。このプロトコルは、モジュール式ニューロンネットワークの培養を目的としたPDMSベースのマイクロ流体デバイスの設計と製造を示しています。原理実証として、接続性を物理的に制限するための2チャンバーデバイスを提示します。具体的には、 ex vivo 発生中の非対称軸索伸長が好まれ、一方のチャンバーから他方のチャンバーに向けることができます。単方向シナプス相互作用の機能的影響を調べるために、相互接続されたニューロンモジュールの生体電気的活動を監視するために、市販の微小電極アレイが選択されています。ここでは、1)マイクロメートル精度で金型を作製する方法、および2)ラット皮質神経細胞培養における in vitro マルチサイト細胞外記録を行う方法が例示されている。コストを削減し、将来的に2PP 3Dプリンティングが広く普及することで、この手法は世界中の研究所でますます重要になっていくでしょう。特にニューロテクノロジーやハイスループットな神経データ記録では、 in vitro モデルのプロトタイピングの容易さと迅速さにより、 in vivo 大規模神経システムの実験制御と理論的理解が向上します。
Introduction
行動する生物の神経活動を調べるには、いくつかの課題があります。例えば、脳組織への物理的なアクセスは、その完全性を維持する必要性によって制限されるため、脳の表面領域はより簡単に考慮されます。無傷の組織内で特定のターゲットを単離することは、しばしば困難な作業であり、時には不可能です。解離した均質な神経細胞培養は、神経回路の個々の(サブ)細胞成分の分子的、生化学的、および生物物理学的特性への便利なアクセスを提供しますが、無傷の脳の現実的な接続性と解剖学的構成は失われます。これらの基本的な制約は、in vivoの複雑さを回避しながら、in vitroで構造を構築できるという中間点を達成するための研究努力を促しました1,2,3,4,5,6,7,8,9 .特に、モジュール式神経細胞培養は、以下に述べるような脳生理学の重要な問題に取り組むことを目的として、過去数十年にわたって広範な研究の対象となってきました。
組織:In vivoの研究によると、脳は解剖学的に正確な細胞タイプと突起の配列を持つ層に構造化されています。機能アッセイにより、ノードアセンブリとモジュール内のニューロンネットワークの組織化が、正確な接続スキームで明らかになりました10,11。しかし、コネクティビティとマイクロ回路モチーフの役割は、関与するシナプスの数が非常に多いこと、および発生と活動依存的な可塑性の織り交ぜられた効果のために、in vivoで十分に研究することはできません。
信号転送:in vivoまたは無作為in vitro培養では、シグナル伝達を評価することは困難です。軸索伝導とその長さに沿った活動電位を調べるには、表面機能化または化学的パターニングによって神経突起伸長を誘導する必要があり、電気的活動の細胞外読み出しにおいて高い信号対雑音比を提供する12。
翻訳の関連性: 病理学的状態におけるシナプス前部要素とシナプス後部要素の排他的な役割を解読するには、これらの要素に個別にアクセスする必要があります。シナプス前部とシナプス後部の要素を効果的に分離する、接続性が制限されたモジュール培養は、この目的に不可欠なツールです13。
神経細胞培養において何らかの構造を得るには、いくつかの方法があります。それらは、化学的および物理的な表面操作として大まかに分類できます9。前者の方法14,15は、神経細胞が特定の(生)化合物に付着する傾向に依存している。これには、接着剤や魅力的な分子をマイクロスケールの精度で、詳細なパターンに従って表面に堆積させる必要があります。これは、所望のパターンに従って、細胞の表面の部分的な被覆を可能にするが、化学的方法は本質的に制限されており、神経突起成長ガイダンスにおける比較的低い成功率を有する16。軸索の方向性を完全に制御するには、軸索誘導を形成するためのアドホック化学物質の空間的勾配を確立する必要があります17。後者の方法は、物理的な表面操作を含み、in vitroでニューロンネットワークを構築するためにより一般的に使用されます。神経細胞は、微細なチャンバー、壁、チャネルなどの幾何学的閉じ込めによって所望の位置に物理的に拘束され、ポリジメチルシロキサン(PDMS)3,5,6,7,18,19,20などの生体適合性ポリマーを成形し、硬化・固化させてマイクロ流体デバイスを形成します。PDMSマイクロ流体製造の事実上の方法は、2次元マスクをマイクロスケールでパターニングし、UV露光時にシリコンベースの材料を選択的にエッチングするために採用されるソフトフォトリソグラフィー21である。簡単に言うと、UV硬化樹脂(フォトレジスト)をスピンコートしてシリコンウェーハ上に塗布し、その粘度と回転速度によって決まる特定の高さに到達します。次に、パターン化されたマスクをフォトレジスト上に配置し、UV光に露光します。マスク内の透明な領域は、関心のある領域に対応し、UV光がフォトレジスト分子の局所的な架橋を誘導できるようにします。露光されていないフォトレジストの領域を溶剤で洗い流し、マスターモールドを形成します。これを繰り返し使用して、選択したエラストマー(PDMS)を焼成し、必要な数のレプリカに目的の形状を彫刻します。このような製造方法は、マイクロ流体デバイス22を製造するための最も一般的な方法である。おそらく、ソフトフォトリソグラフィーの主な限界は、注目すべき設備投資の前提条件と、必要な技術と専門知識を備えた生物学研究室の不慣れです。複雑な複数の高さの高アスペクト比の形状を設計するために必要なマスクの準備とソフトフォトリソグラフィーのステップは、自明ではなく23、しばしばアウトソーシングを必要とします。代替の低予算の方法が提案されているが、それらは必ずしも生物学的プロトタイピングの高精度要件を満たしているわけではない24。
ここでは、2光子重合(2PP)と積層造形に頼った代替製造方法を紹介します。これは簡単で、高度な微細加工やマイクロフォトリソグラフィーの専門知識を必要としません。2PPマイクロマニュファクチャリングの研究分野は90年代後半に登場し25、それ以来、指数関数的な成長を遂げてきました26。この手法の基本原則の詳細については、他の場所 26 を参照してください。簡単に言うと、励起光インパルスを3次元空間に集束させることで、2PPは多光子吸収の強度に対する非線形依存性を利用します。これにより、限られた吸収が可能になり、非常に局所的な領域内で正確かつ選択的な励起が保証されます。要するに、光露光時に溶解度が低下する材料であるネガトーンフォトレジストは、低デューティサイクル27でフェムト秒レーザーパルスの集束ビームを受ける。これにより、低い平均出力で高強度のインパルスが可能になり、材料を傷つけることなく重合が可能になります。光誘起ラジカルモノマーの相互作用は、ラジカルオリゴマーを生じさせ、そのサイズがレーザーパルスの強度および持続時間に依存する明確な体積、すなわちボクセルまでフォトレジスト全体に広がる重合を開始する28。
本研究では、A)使い捨ての高分子神経細胞培養デバイスを製造するために何度も再利用できる3Dプリント金型の設計と迅速な製造(図1)、およびB)平面神経細胞培養基板の表面、または生体電気信号のマルチサイト記録が可能な基板一体型微小電極アレイへの機械的結合の2つのコンポーネントが提示されています。
ここでは、3D機械モデルのコンピューター支援設計について非常に簡単に説明し、3Dプリントされた金型とPDMSデバイスの製造につながる手順についても詳しく説明します。
さまざまなコンピューター支援設計ソフトウェアアプリケーションを使用して、開始3Dオブジェクトモデルを生成し、2PP印刷プロセスを制御するSTLファイルを生成できます。 材料表では、最初と最後のアプリケーションが無料または無料ライセンスで提供されています。3D モデルを構築するには、常に 2D スケッチを作成する必要があり、その後のモデリング手順で押し出されます。この概念を示すために、一般的な3D CADソフトウェアの設計プロセスがプロトコルセクションで強調表示され、重なり合う立方体で構成された構造が導かれます。より包括的な情報については、 材料表に示されているように、多数のオンラインチュートリアルと無料のトレーニングリソースが利用可能です。
結果のSTLファイルは、3Dプリンターによって実行される一連のコマンド(つまり、スライス手順)に変換されます。使用している特定の2PP 3Dプリンターでは、ソフトウェアDeScribeを使用してSTLファイルをインポートし、独自のGeneral Writing Language(GWL)形式に変換します。2PP印刷プロセスの成功は、レーザー出力とそのスキャン速度、ステッチング、ハッチングスライス距離など、さまざまなパラメータにかかっています。これらのパラメータの選択は、対物レンズとフォトレジストの選択とともに、設計の最小機能と意図されたアプリケーションによって異なります。したがって、さまざまな設計シナリオやユースケースの要件を満たすために、パラメータの最適化が不可欠になります。この作業では、印刷パラメータの構成として、推奨レシピIP-S 25x ITO Shell(3D MF)を検討しました。最終的に、機械的に安定したプリント部品は、3Dプリント時間を最小限に抑えながら、必要な解像度でプリントされます。
本研究で実証された金型設計および関連するSTLファイルは、細胞培養の空間を2つのコンパートメントに分離するための正方形のフレームで構成されています:外側の領域(つまり、その後、ソースと呼ぶ)と内側の領域(つまり、ターゲットと呼ぶ)。これらの2つの区画は、それぞれが鋭角の境界を特徴とするマイクロチャネルのセットを介して接続されており、ターゲットからソースへの神経突起の成長を特に妨げるように設計されていますが、その逆はないため、2つの領域で成長するニューロン間の方向性のあるシナプス接続を促進します。
初期の研究では、神経突起の方向性のある成長を促進するために、マイクロチャネルのさまざまな形状が採用されていました。例としては、三角形形状18、チャネル有刺鉄線構造19、およびテーパーチャネル20が含まれる。ここでは、マイクロチャネルの境界を横切る鋭角の障壁を特徴とするデザインが採用されており、非対称の入り口も特徴です。これらのマイクロチャネルは、密閉された内部(ターゲット・コンパートメント)と外部領域(ソース・コンパートメント)の間の連続性を確立する役割を果たします。マイクロチャネルの最初の部分の漏斗形状は、ソース側から見て、ソースとターゲットを結ぶ最短の経路、すなわち直線に沿った軸索束の形成とその成長を促進するように設計されています。鋭角を向いて実現される三角形の空間は、ターゲット側の体積が大きくなり、神経突起の経路探索を効果的に遅らせることを狙いとし、ソースから発生する束の迅速な発射と利用可能な空間の占有を有利に進めます。マイクロチャネルの長さに対する540μmの選択は、一般的に短い樹枝状突起伸長を効果的に濾過する39。さらに、高さが5μmであるため、細胞体細胞がマイクロチャネルを貫通するのを防ぎます。全体として、この構成は、外部(ソース)モジュールと内部(ターゲット)モジュール間の単方向接続を促進することが証明されており、ここでは、多くの代替選択肢の原理実証として提示します。
2PPモールドで作製されたPDMSデバイスは、ガラスカバーガラスやペトリ皿などの一般的な細胞培養基板の表面に取り付けることができますが、この研究では、市販の基板一体型微小電極アレイを使用しました。3D設計を微小電極アレイのレイアウトに最適化する努力は行われておらず、機械的結合は、アレイ全体にデバイスを配置することのみを目的とした実体顕微鏡ガイダンスの下で行われ、ソースとターゲットの両側にいくつかの微小電極が露出したままになりました。これにより、神経細胞培養における接続性の制限による機能的影響の予備的評価が可能になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
何十年も前のものであるにもかかわらず、マイクロメートルスケールのPDMSベースのレプリカ成形における2PP技術の応用は最近の開発です43,44。これに関連して、ユーザーがこの作業を効果的に再現するのを支援するために、一連のポイントを以下で説明します。
3D モデル設計では、モデルに穴や自己交差がないことを確認します。STLとして保存するときにバイナリファイル形式を特権化することで、ASCIIエンコードよりもファイルサイズのフットプリントが小さくなります。これは、複雑な形状の設計やミリリットル幅のオブジェクトに特に有益です。バイナリSTLファイルを使用すると、プロセスの後半で機械部品を3Dプリントする準備を行うため、CPU負荷が低くなります。 STL ファイル内のフィーチャの物理寸法は、無次元単位で表されます。STLファイルの後処理では、単位はマイクロメートルとして解釈されます。したがって、ファイルを準備する際には、対象の単位、つまりマイクロメートルを事前に採用することをお勧めします。印刷されたモデルの精度は、テッセレーションされた三角形を近似するサーフェスの数によって決まります。表面の数が不十分な場合、望ましくない表面粗さが発生します。しかし、非常に多くの面で過度に高い精度を目指すと、計算負荷が高くなり、ファイルの処理が遅くなります。
PDMSレプリカ成形では、クリーンルーム設備を持たずにマイクロメートルスケールの機能を持つPDMSデバイスをクリーンに製造することは困難であり、空気中の微粒子がPDMSの高接着性表面に存在し、デバイスと基板の間のシールを妨げたり、個々のマイクロチャネルのセクションをブロックしたりする可能性があります。層流フードの下でプロトコルステップを実行し、PDMS表面をイソプロパノールで一貫して遮蔽することで、汚染リスクを大幅に最小限に抑えることができます。硬化温度とその持続時間は、PDMSの架橋と結果として生じる物理的特性に直接影響します。特に、硬化したPDMSの密着性は重要な要素です。一方では、神経突起の通過を効果的に制限するために、PDMSデバイスと神経細胞培養に使用される表面(ガラスカバーガラスやMEAなど)との間にしっかりと密閉する必要があります。一方、PDMSデバイスは、デバイスを取り外した後に繊細な絶縁層MEAが損傷しないように、可逆的に表面に取り付ける必要があります。硬化中のPDMS収縮は発生し、金型を事前に再スケーリングすることで修正できますが、ここに示されている温度と硬化間隔では、収縮は2%42 未満であり、単層PDMSデバイスに大きな影響を与えません。全体として、最良の結果を得るには、推奨される硬化温度と期間の値に正確に従ってください。
従来の方法と比較して、2PP 3Dプリンティングは明らかな利点を誇っており、これは、重要なアスペクト比、厳しい解像度要件、および複雑な3次元形状の金型の製造に関して最も顕著です。標準的なUVリソグラフィーを用いたマスターモールドの作製は、約200μmのレジスト厚に制約されます。より大きな高さおよびアスペクト比を達成するためには、スピンコーティングおよび露光サイクル35、コストのかかるLIGA(リソグラフィー、電気めっき、および成形)、または深部反応性イオンエッチング(DRIE)プロセス36 の複雑なシーケンスが必要である。これとは対照的に、2010年のKumiらの先駆的な研究で実証されたように37、2PP技術は、サブミクロンからミリメートルに及ぶプリント部品のアスペクト比に本質的に無限の範囲を提供する。ここでは、部品の高さに大きな差がある金型の微細製造プロセスを例示し、マイクロ流路の高さ(5μm)と最大金型の高さ(545μm、 図2参照)の間に100倍以上の差があることを特徴としています。
また、サブミクロン分解能は、概説されているプロトコル仕様に従うことで容易に達成できます。それに比べて、UVフォトリソグラフィーによる金型の解像度の向上には設備投資が必要です。公称分解能600nmの石英へのクロム堆積を利用した最高解像度のマスクは、250μmの解像度を持つレーザー印刷されたオーバーヘッド透明マスクよりも数桁高い価格で販売されています35、ただし、Pirloらの研究を参照してください41。社内での使用を可能にするには、選択した方法が費用対効果が高い必要があります。多くの生物学研究室では、従来のソフトフォトリソグラフィーや直接レーザー描画に関連する全体的な費用が障壁となっています。重要なコンポーネントを購入して組み立てることで、両方のテクノロジーをより利用しやすくすることは可能ですが、このアプローチには追加の専門知識が必要であり、それでもかなりの投資が必要です。この文脈において、考慮すべき重要な点は、直接レーザー描画によって達成可能な幅広いアプリケーションです。主に金型の微細製造に限定された従来のソフトフォトリソグラフィーとは異なり、2PP 3Dプリンティングは驚くべき汎用性を示します。その潜在的な用途は、マイクロ流体工学やマイクロ光学から、統合されたフォトニクスやマイクロメカニクスまで多岐にわたります。そのため、この技術への投資は、複数の多様な科学分野の共有施設として魅力的です。たとえば、このプロトコルで考案された2PPベースの方法論は、私たちの機関内の神経科学と数学部門の間の学際的なコラボレーションの結果です。さらに、フォトレジストの開発は活発な研究分野であり、2PP 3Dプリントの応用範囲を広げる可能性があります。その好例が、近年のIP-PDMS樹脂の導入です。この樹脂は、PDMS38のような特性を持つ構造に重合することで、表面が入り組んだ、または中空空間を含む生体適合性コンポーネントの直接微細加工の可能性を解き放ちます。これらの複雑さは、従来のレプリカ成形手順で同様の結果を達成するための障壁となっています。
この方法の実証として、モジュラーニューロンネットワークにおける2つのモジュール間の単方向接続の発達を示唆する証拠が提供されました。2PP技術で製造されたマイクロスケール金型は、複数のPDMS鋳造を受けるのに十分な耐久性を持ち、必要なマイクロスケールの精度を備えています。結論として、本作業で記載されたプロトコルの適用範囲は、図示されたケースを超えて拡張される。2PPプリンティング技術へのアクセスがますます広まるにつれて、その実装に必要な初期投資は減少し、潜在的なアプリケーションの範囲が広がります。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.G.は、欧州連合(EU)のH2020フレームワークプログラム(IN-FETプロジェクト、GA n. 862882、Arbor-IOプロジェクト、FLAG-ERAおよびHuman Brain Project、ID 650003)およびSISSA(Neuroscience Area)からの資金援助に感謝する。G.N.は、Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022(数学分野)の助成金を通じて、イタリア大学研究省(MUR)からの財政支援を認めています。3Dプリンティング、細胞培養、ライブイメージングの支援をしてくれたM. Gigante、B. Pastore、M. Grandolfo、議論をしてくれたP. Massobrio博士、P. Heppenstall博士、L. Ballerini博士、Di Clemente博士、H.C. Schultheiss博士に感謝します。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。
Materials
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
| BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). ————————————– Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
| CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-AP5 | Tocris | #0106 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
| Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
| in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
| NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
| Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
| Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
| Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |
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