Stampa 3D a polimerizzazione a due fotoni di dispositivi di coltura cellulare neuronale su microscala
Summary
La stampa 3D su scala micrometrica consente la prototipazione rapida di dispositivi polimerici per colture cellulari neuronali. Come prova di principio, le connessioni strutturali tra i neuroni sono state vincolate creando barriere e canali che influenzano la crescita dei neuriti, mentre le conseguenze funzionali di tale manipolazione sono state osservate dall’elettrofisiologia extracellulare.
Abstract
Le colture neuronali sono state un modello sperimentale di riferimento per diversi decenni. Tuttavia, mancano la disposizione delle cellule 3D, i vincoli spaziali sulla crescita dei neuriti e la connettività sinaptica realistica. Quest’ultimo limita lo studio della struttura e della funzione nel contesto della compartimentazione e diminuisce l’importanza delle culture nelle neuroscienze. Approssimare ex vivo la disposizione anatomica strutturata della connettività sinaptica non è banale, nonostante sia la chiave per l’emergere dei ritmi, della plasticità sinaptica e, in ultima analisi, della fisiopatologia cerebrale. Qui, la polimerizzazione a due fotoni (2PP) viene impiegata come tecnica di stampa 3D, consentendo la rapida fabbricazione di dispositivi di coltura cellulare polimerica utilizzando polidimetil-silossano (PDMS) su scala micrometrica. Rispetto alle tradizionali tecniche di stampaggio di repliche basate sulla microfotolitografia, la stampa su microscala 2PP consente di realizzare prototipi in modo rapido e conveniente. Questo protocollo illustra la progettazione e la fabbricazione di dispositivi microfluidici basati su PDMS finalizzati alla coltura di reti neuronali modulari. Come prova di principio, viene presentato un dispositivo a due camere per vincolare fisicamente la connettività. In particolare, una crescita assonale asimmetrica durante lo sviluppo ex vivo è favorita e può essere diretta da una camera all’altra. Al fine di sondare le conseguenze funzionali delle interazioni sinaptiche unidirezionali, vengono scelti array di microelettrodi commerciali per monitorare l’attività bioelettrica di moduli neuronali interconnessi. Qui, vengono illustrati i metodi per 1) fabbricare stampi con precisione micrometrica e 2) eseguire registrazioni extracellulari multisito in vitro in colture neuronali corticali di ratto. Diminuendo i costi e la futura accessibilità diffusa della stampa 3D 2PP, questo metodo diventerà sempre più rilevante nei laboratori di ricerca di tutto il mondo. Soprattutto nella neurotecnologia e nella registrazione di dati neurali ad alto rendimento, la facilità e la rapidità della prototipazione di modelli in vitro semplificati miglioreranno il controllo sperimentale e la comprensione teorica dei sistemi neurali in vivo su larga scala.
Introduction
Lo studio dell’attività neuronale negli organismi comportamentali presenta diverse sfide. Ad esempio, l’accesso fisico al tessuto cerebrale è limitato dalla necessità di mantenerne l’integrità, quindi le regioni superficiali del cervello sono più facilmente considerate. Isolare bersagli specifici all’interno del tessuto intatto è spesso un compito arduo e talvolta impossibile. Sebbene le colture neuronali omogenee dissociate offrano un comodo accesso alle proprietà molecolari, biochimiche e biofisiche dei singoli componenti (sub)cellulari di un circuito neurale, si perde una connettività realistica e un’organizzazione anatomica del cervello intatto. Questi vincoli fondamentali hanno ispirato gli sforzi di ricerca per raggiungere una via di mezzo, in cui la complessità in vivo è evitata mentre la struttura può essere costruita in vitro, che è su richiesta 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . In particolare, le colture neuronali modulari sono state oggetto di ricerche approfondite negli ultimi decenni, con l’obiettivo di affrontare le questioni chiave della fisiologia del cervello come descritto di seguito.
Organizzazione: Studi in vivo mostrano che il cervello è strutturato anatomicamente in strati con precisi tipi di cellule e matrici di proiezioni. I saggi funzionali hanno rivelato l’organizzazione delle reti neuronali in assiemi e moduli di nodi, con precisi schemi di connettività10,11. Il ruolo della connettività e dei motivi microcircuitali, tuttavia, non può essere studiato adeguatamente in vivo a causa dell’enorme numero di sinapsi coinvolte, nonché degli effetti intrecciati dello sviluppo e della plasticità dipendente dall’attività.
Trasferimento del segnale: In colture in vivo o casuali in vitro , è difficile valutare il trasferimento del segnale. L’esame della conduzione assonale e del potenziale d’azione lungo la sua lunghezza richiede di guidare la crescita dei neuriti mediante la funzionalizzazione superficiale o il patterning chimico, fornendo un elevato rapporto segnale-rumore nelle letture extracellulari dell’attività elettrica12.
Rilevanza traslazionale: Decifrare il ruolo esclusivo degli elementi pre- e post-sinaptici in condizioni patologiche richiede l’accesso a questi elementi individualmente. Le colture modulari con connettività vincolata, che segregano efficacemente gli elementi pre e post-sinaptici, sono strumenti indispensabili a questo scopo13.
Esistono diversi metodi per ottenere una qualche forma di struttura nella coltura neuronale. Possono essere ampiamente classificati come manipolazione chimica e fisica delle superfici9. I primi metodi 14,15 si basano sulla propensione delle cellule neuronali ad attaccarsi a determinati composti (bio)chimici. Ciò richiede il deposito di adesivo o molecole attraenti su una superficie con precisione su microscala e seguendo uno schema dettagliato. Mentre questo consente una copertura parziale della superficie delle cellule, seguendo il modello desiderato, i metodi chimici sono intrinsecamente limitati e hanno un tasso di successo relativamente basso nella guida alla crescita dei neuriti16. Il pieno controllo sulla direzionalità degli assoni richiede la definizione di un gradiente spaziale di sostanze chimiche ad-hoc per modellare la guida assonale17. Questi ultimi metodi comportano la manipolazione fisica della superficie e sono più comunemente usati per strutturare le reti neuronali in vitro. Le cellule neuronali sono fisicamente vincolate nei punti desiderati da confinamenti geometrici, come camere microscopiche, pareti, canali, ecc., modellando un polimero biocompatibile come il polidimetilsilossano (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 polimerizzato e solidificato in un dispositivo microfluidico. Il metodo de facto per la fabbricazione microfluidica PDMS è la fotolitografia morbida21, in cui una maschera bidimensionale viene modellata su microscala e impiegata per incidere selettivamente un materiale a base di silicio dopo l’esposizione ai raggi UV. In poche parole, una resina polimerizzabile ai raggi UV (cioè fotoresist) viene rivestita su un wafer di silicio attraverso lo spin-coating, raggiungendo un’altezza specifica determinata dalla sua viscosità e velocità di rotazione. Quindi, la maschera modellata viene posizionata sopra il fotoresist ed esposta alla luce UV. Le aree trasparenti all’interno della maschera, corrispondenti alle regioni di interesse, consentiranno alla luce UV di indurre reticolazione localizzata delle molecole di fotoresist. Le aree di fotoresist non esposte vengono lavate via con un solvente, con conseguente formazione di uno stampo principale. Questo viene ripetutamente utilizzato per cuocere un elastomero a scelta (ad esempio, PDMS), che viene poi inciso con le geometrie desiderate in tutte le repliche desiderate. Tale metodo di fabbricazione è il metodo più comune per fabbricare dispositivi microfluidici22. Forse i principali limiti della fotolitografia morbida sono il prerequisito di un notevole investimento di capitale e la scarsa familiarità dei laboratori biologici con le tecniche e le competenze richieste. La preparazione della maschera e le fasi di fotolitografia morbida necessarie per progettare geometrie complesse ad altezza multipla e ad alto rapporto d’aspetto non sono banali23 e spesso richiedono l’outsourcing. Anche se sono stati proposti metodi alternativi e a basso budget, non sempre soddisfano i requisiti di alta precisione della prototipazione biologica24.
Qui, viene presentato un metodo di produzione alternativo, che si basa sulla polimerizzazione a due fotoni (2PP) e sulla produzione additiva. È semplice e non richiede di per sé competenze avanzate di microfabbricazione e microfotolitografia. Il campo di ricerca della microfabbricazione di 2PP è emerso alla fine degli anni ’9025 e da allora ha assistito a una crescita esponenziale26. Maggiori informazioni sui principi fondamentali di questa tecnica possono essere trovate altrove26. In breve, focalizzando l’impulso di luce di eccitazione nello spazio tridimensionale, 2PP sfrutta la dipendenza non lineare dell’assorbimento multifotone dall’intensità. Ciò garantisce la capacità di assorbimento confinato, garantendo un’eccitazione precisa e selettiva all’interno di regioni molto localizzate. In sostanza, un fotoresist a toni negativi, un materiale con una solubilità ridotta in seguito all’esposizione alla luce, è sottoposto a un fascio focalizzato di impulsi laser a femtosecondi a un basso ciclo di lavoro27. Ciò consente impulsi con intensità elevate a basse potenze medie, consentendo la polimerizzazione senza danneggiare il materiale. L’interazione di monomeri radicali fotoindotti dà origine a oligomeri radicalici, dando inizio a una polimerizzazione che si estende in tutto il fotoresist fino a un volume distinto, cioè voxel, la cui dimensione dipende dall’intensità e dalla durata degli impulsi laser28.
In questo lavoro, vengono presentate due componenti: A) la progettazione e la fabbricazione rapida di uno stampo stampato in 3D, riutilizzabile molte volte per produrre dispositivi di coltura cellulare neuronale polimerica monouso (Figura 1), e B) il loro accoppiamento meccanico sulla superficie di substrati planari di colture cellulari neuronali, o anche di array di microelettrodi integrati nel substrato in grado di registrazioni multisito di segnali bioelettrici.
La progettazione assistita da computer di un modello meccanico 3D è descritta molto brevemente qui e accompagnata dai passaggi che portano a uno stampo stampato in 3D e alla fabbricazione di dispositivi PDMS è anche dettagliata.
È possibile utilizzare una varietà di applicazioni software di progettazione assistita da computer per generare il modello di oggetto 3D di partenza e produrre un file STL per controllare il processo di stampa 2PP. All’interno della Tabella dei Materiali, la prima e l’ultima applicazione elencate sono gratuite o fornite con una licenza gratuita. La costruzione di un modello 3D richiede sempre la creazione di uno schizzo 2D, che viene poi estruso nelle successive fasi di modellazione. Per dimostrare questo concetto, un generico processo di progettazione di software CAD 3D è evidenziato nella sezione del protocollo, che porta a una struttura composta da cubi sovrapposti. Per informazioni più complete, sono disponibili una serie di tutorial online e risorse di formazione gratuite, come indicato nella Tabella dei materiali.
Il file STL risultante viene quindi tradotto in una serie di comandi che devono essere eseguiti dalla stampante 3D (ad esempio, la procedura di slicing). Per la specifica stampante 3D 2PP in uso, il software DeScribe viene utilizzato per importare il file STL e convertirlo nel formato proprietario General Writing Language (GWL). Il successo del processo di stampa 2PP dipende da vari parametri, in particolare la potenza del laser e la sua velocità di scansione, la cucitura e le distanze di tratteggio-affettatura. La scelta di questi parametri, insieme alla scelta dell’obiettivo e del fotoresist, dipende dalle caratteristiche più piccole del progetto, nonché dall’applicazione prevista. Pertanto, l’ottimizzazione dei parametri diventa essenziale per soddisfare i requisiti di diversi scenari di progettazione e casi d’uso. Per questo lavoro, la ricetta consigliata IP-S 25x ITO Shell (3D MF) è stata considerata come configurazione per i parametri di stampa. In definitiva, una parte stampata meccanicamente stabile viene stampata con la risoluzione necessaria, riducendo al minimo il tempo di stampa 3D.
Il progetto dello stampo e il relativo file STL, dimostrato in questo lavoro, comprendono un telaio quadrato per separare lo spazio di una coltura cellulare in due compartimenti: un’area esterna (ad esempio, denominata Source in seguito) e un’area interna (ad esempio, denominata Target successivamente). Questi due compartimenti sono collegati attraverso insiemi di microcanali, ciascuno caratterizzato da bordi ad angolo acuto, progettati per ostacolare specificamente la crescita dei neuriti dal Target alla Sorgente, ma non viceversa, e come tali promuovere una connettività sinaptica direzionale tra i neuroni che crescono sulle due aree.
Studi precedenti hanno impiegato diverse geometrie di microcanali per incoraggiare la crescita direzionale dei neuriti. Gli esempi includono le forme triangolari18, le strutture spinate a canale19 e i canali rastremati20. Qui viene utilizzato un design caratterizzato da barriere ad angolo acuto lungo i bordi del microcanale, caratterizzato anche da ingressi asimmetrici. Questi microcanali servono a stabilire una continuità tra un interno chiuso, il compartimento Target, e l’area esterna, il compartimento Source. La forma ad imbuto della parte iniziale dei microcanali, dal lato Sorgente, è progettata per favorire la formazione di fasci assonali e la loro crescita lungo il percorso più breve, cioè rettilineo, che collega la Sorgente al Target. Lo spazio triangolare realizzato affrontando angoli acuti ha un volume maggiore sul lato del bersaglio per mirare a ritardare efficacemente il pathfinding dei neuriti favorendo il rapido sparo di fasci provenienti dalla Sorgente e l’occupazione dello spazio disponibile. La scelta di 540 μm per la lunghezza dei microcanali filtra efficacemente la crescita dendritica generalmente più corta39. Inoltre, la loro altezza di 5 μm impedisce ai somata cellulari di penetrare attraverso i microcanali. Nel complesso, questa configurazione ha dimostrato di promuovere la connettività unidirezionale tra i moduli di destinazione esterni di origine e interni ed è presentata qui come una prova di principio tra le molte scelte alternative.
Mentre i dispositivi PDMS, fabbricati con lo stampo 2PP, possono essere fissati alla superficie di comuni substrati di coltura cellulare, come vetrini coprioggetti o piastre di Petri, in questo lavoro sono stati utilizzati array di microelettrodi integrati nel substrato disponibili in commercio. Non è stato fatto alcuno sforzo per ottimizzare il design 3D in base al layout dell’array di microelettrodi e l’accoppiamento meccanico è stato eseguito sotto la guida della stereomicroscopia con l’obiettivo di posizionare il dispositivo attraverso l’array, lasciando alcuni microelettrodi scoperti su entrambi i lati, la sorgente e il target. Ciò consente la valutazione preliminare delle conseguenze funzionali della connettività vincolata nelle colture cellulari neuronali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nonostante sia vecchia di decenni, l’applicazione della tecnologia 2PP nello stampaggio di repliche basate su PDMS su scala micrometrica è uno sviluppo recente43,44. In questo contesto, una serie di punti sono discussi di seguito per aiutare gli utenti a riprodurre efficacemente questo lavoro.
Per la progettazione di modelli 3D, assicurarsi che il modello non contenga fori o autointersezioni. Privilegia il formato di file binario quando si salva come STL, per il suo ingombro di dimensioni del file inferiore rispetto alla codifica ASCII. Ciò è particolarmente vantaggioso per i progetti con geometrie intricate e per oggetti larghi millilitri. L’utilizzo di file STL binari implica anche un basso carico della CPU, in una fase successiva del processo di preparazione della parte meccanica per la stampa 3D. Le dimensioni fisiche degli elementi all’interno del file STL sono rappresentate in unità adimensionali. Durante la post-elaborazione del file STL, le unità vengono interpretate come micrometri. Pertanto, si consiglia di adottare in anticipo l’unità di interesse, cioè il micrometro, durante la preparazione del file. La precisione del modello stampato è determinata dal numero di superfici che si avvicinano ai triangoli tassellati. Per un numero insufficiente di superfici, emergerà una rugosità superficiale indesiderata. Ciononostante, puntare a una precisione eccessivamente elevata da un numero molto elevato di superfici comporta un elevato carico computazionale, che rallenta l’elaborazione dei file.
Per la stampa 3D, durante la stampa, l’oggetto fisico 3D viene formato utilizzando la scansione galvo veloce nel piano x-y e il movimento piezoelettrico nella direzione z. Questo focalizza il raggio laser a femtosecondi all’interno di un determinato voxel 3D. Tuttavia, quando le strutture di stampa sono più grandi degli intervalli di copertura spaziale del galvo e del piezo, l’oggetto deve essere suddiviso a livello di codice in blocchi. Sebbene questo sia un requisito per le parti stampate di dimensioni millimetriche, le giunzioni tra i blocchi sono associate a linee di cucitura (imperfette). Un’attenta ottimizzazione del numero di blocchi e il posizionamento delle linee di cucitura nelle direzioni x, y e z sono fondamentali per evitare di interrompere le caratteristiche geometriche critiche dell’oggetto finale con le linee di cucitura. Le bolle possono formarsi sull’interfaccia di stampa per vari motivi (ad esempio, impurità e disomogeneità dei substrati del fotoresist) e influire negativamente sulla qualità e sull’integrità della struttura stampata. Inoltre, una maggiore potenza del laser può portare a un aumento della loro presenza. Riducendo la potenza del laser, nello strato più basso della parte stampata, si riducono al minimo le possibilità di formazione di bolle. In alternativa alla stampa dell’intera parte come struttura solida, è possibile prendere in considerazione il metodo shell-and-scaffold. Prevede la stampa solo della superficie esterna della parte (guscio) e degli elementi prismatici triangolari al suo interno. Questi elementi sono separati da strati orizzontali (scaffold), che trattengono la resina non polimerizzata in piccole tasche. Questo metodo riduce significativamente i tempi di stampa, in particolare per le strutture di dimensioni millimetriche. Tuttavia, poiché la resina non polimerizzata rimane, l’esposizione ai raggi UV post-stampa è indispensabile per garantire la piena stabilità meccanica, anche se questo passaggio deve essere eseguito delicatamente per evitare qualsiasi deformazione della parte stampata. Il tempo di polimerizzazione post-stampa dipende dalla resina scelta, dallo spessore del pezzo e dalla potenza UV40. Per ottenere risultati ottimali, si consiglia di condurre una prova iniziale per stimare il tempo necessario per l’indurimento a piena profondità, utilizzando una goccia di fotoresist e valutando il suo taglio in sezione, dopo l’esposizione ai raggi UV. Il periodo di stagionatura abituale varia da 5 a 20 minuti.
Per lo stampaggio di repliche PDMS, la fabbricazione pulita di un dispositivo PDMS con caratteristiche su scala micrometrica, senza strutture per camere bianche, può essere impegnativa: le microparticelle sospese nell’aria possono risiedere sulla superficie altamente adesiva del PDMS e ostacolare la tenuta tra il dispositivo e il substrato o bloccare la sezione dei singoli microcanali. L’esecuzione delle fasi del protocollo sotto una cappa a flusso laminare e la schermatura costante della superficie del PDMS con isopropanolo riducono sostanzialmente al minimo i rischi di contaminazione. La temperatura di polimerizzazione e la sua durata influenzano direttamente la reticolazione PDMS e le proprietà fisiche risultanti. In particolare, l’adesività del PDMS polimerizzato è un fattore critico. Da un lato, è necessaria una tenuta ermetica tra il dispositivo PDMS e la superficie utilizzata per la coltura delle cellule neuronali (ad esempio, un vetrino coprioggetti o un MEA), per limitare efficacemente il passaggio dei neuriti. D’altra parte, il dispositivo PDMS dovrebbe attaccarsi alla superficie in modo reversibile, in modo che il delicato strato isolante MEA non venga danneggiato dopo aver rimosso il dispositivo. Mentre il restringimento del PDMS durante l’indurimento si verifica e potrebbe essere corretto ridimensionando in anticipo lo stampo, per le temperature e gli intervalli di polimerizzazione qui indicati il restringimento sarà inferiore al 2%42 e non influirà in modo significativo sui dispositivi PDMS a strato singolo. Nel complesso, seguire con precisione i valori di temperatura e durata di polimerizzazione consigliati, per ottenere i migliori risultati.
Panoramica dei vantaggi e dei limiti del metodo
Viene proposta una tecnica basata sulla scrittura laser diretta a 2 fotoni per la fabbricazione rapida di dispositivi polimerici su micro-scala per lo studio sperimentale di reti neurali modulari. A differenza della fotolitografia soft, l’approccio proposto non richiede un alto livello di competenza tecnica, a condizione che una configurazione di stampa 3D 2PP funzionale sia accessibile e operativa. Sorprendentemente, il metodo consente di passare da un modello 3D progettato da CAD a un dispositivo PDMS funzionale in un solo giorno, fornendo così un percorso diretto ed efficiente dall’ideazione alla realizzazione tangibile. In particolare, optando per la modalità di stampa shell-and-scaffold si riduce notevolmente il tempo necessario per creare lo stampo, poiché viene stampata solo una frazione del suo volume. La successiva polimerizzazione UV del componente stampato ne garantisce la stabilità meccanica e la robustezza, come qui verificato su 50 cicli di fusione con PDMS.
Rispetto ai metodi tradizionali, la stampa 3D 2PP vanta un chiaro vantaggio, che è più pronunciato quando si tratta di fabbricazione di stampi con un rapporto d’aspetto significativo, requisiti di risoluzione impegnativi e geometrie tridimensionali complesse. La produzione di stampi master utilizzando la litografia UV standard è vincolata da uno spessore di resistenza di circa 200 μm. Per ottenere un’altezza e un rapporto d’aspetto maggiori sono necessari intricati processi di spin-coating e di esposizione35, costosi processi LIGA (litografia, galvanica e stampaggio) o incisione ionica reattiva profonda (DRIE)36 . In netto contrasto, come dimostrato nel lavoro pionieristico di Kumi et al. nel 201037, la tecnica 2PP offre una portata essenzialmente illimitata per il rapporto d’aspetto delle parti stampate, che va dal sub-micrometro al millimetro. Qui, è stato esemplificato il processo di microfabbricazione di uno stampo con una significativa differenza di altezza delle sue porzioni, con una differenza di oltre 100 volte tra l’altezza dei microcanali (5 μm) e l’altezza massima dello stampo (545 μm; vedi Figura 2).
Inoltre, la risoluzione sub-micrometrica potrebbe essere facilmente raggiunta seguendo le specifiche del protocollo delineate. In confronto, ottenere migliori risoluzioni degli stampi attraverso la fotolitografia UV richiede investimenti di capitale. Le maschere con la migliore risoluzione, che utilizzano la deposizione di cromo su quarzo ad una risoluzione nominale di 600 nm, hanno un prezzo di diversi ordini di grandezza superiore rispetto alle maschere di trasparenza sopraelevate stampate al laser, che possiedono una risoluzione di 250 μm35, tuttavia si veda il lavoro di Pirlo et al.41. Per essere praticabile per l’uso interno, un metodo scelto deve essere conveniente. Per molti laboratori biologici, la spesa complessiva associata alla fotolitografia morbida convenzionale o alla scrittura laser diretta rappresenta un ostacolo. Sebbene sia possibile rendere entrambe le tecnologie più accessibili acquistando e assemblando i componenti essenziali, questo approccio richiede competenze aggiuntive e richiede comunque un investimento notevole. In questo contesto, un punto essenziale da considerare è il più ampio spettro di applicazioni realizzabili attraverso la scrittura laser diretta. A differenza della fotolitografia morbida convenzionale, principalmente limitata alla microproduzione di stampi, la stampa 3D 2PP presenta una notevole versatilità. Le sue potenziali applicazioni spaziano dalla microfluidica e microottica alla fotonica integrata e alla micromeccanica. Ciò rende l’investimento in questa tecnologia attraente come struttura condivisa per molteplici e diversi campi scientifici. Ad esempio, la metodologia basata su 2PP ideata in questo protocollo è il risultato di una collaborazione interdisciplinare tra i dipartimenti di neuroscienze e matematica all’interno della nostra istituzione. Inoltre, lo sviluppo del fotoresist è un campo di ricerca attivo e può potenzialmente espandere la gamma di applicazioni della stampa 3D 2PP. Un esempio calzante è la recente introduzione della resina IP-PDMS. Polimerizzando in strutture con proprietà come PDMS38, questa resina sblocca il potenziale per la microfabbricazione diretta di componenti biocompatibili che hanno una superficie contorta o contengono spazi cavi. Queste complessità rappresentano un ostacolo al raggiungimento di risultati simili attraverso le procedure convenzionali di stampaggio delle repliche.
Come dimostrazione di questo metodo, sono state fornite prove che suggeriscono lo sviluppo di connettività unidirezionale tra due moduli in una rete neuronale modulare. Lo stampo su microscala, prodotto con la tecnica 2PP, ha avuto una resistenza sufficiente per essere sottoposto a più fusioni PDMS e ha la precisione su microscala richiesta. In conclusione, l’ambito di applicazione del protocollo descritto in questo lavoro si estende oltre il caso illustrato. Man mano che l’accesso alla tecnologia di stampa 2PP diventa sempre più diffuso, l’investimento iniziale richiesto per la sua implementazione diminuirà, mentre la sua gamma di potenziali applicazioni si espanderà.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.G. riconosce il sostegno finanziario del Programma Quadro H2020 dell’Unione Europea attraverso l’European Innovation Council (progetto IN-FET, GA n. 862882, progetto Arbor-IO, FLAG-ERA e Human Brain Project, ID 650003) e della SISSA (Area Neuroscienze). G.N. riconosce il sostegno finanziario del Ministero dell’Università e della Ricerca (MUR) attraverso il bando Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (Area Matematica). Ringraziamo M. Gigante, B. Pastore e M. Grandolfo per la loro assistenza con la stampa 3D, la coltura cellulare e l’imaging dal vivo, nonché i dottori P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente e H.C. Schultheiss per le discussioni. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
| BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). ————————————– Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
| CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-AP5 | Tocris | #0106 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
| Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
| in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
| NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
| Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
| Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
| Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |
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