Impresión 3D de polimerización de dos fotones de dispositivos de cultivo de células neuronales a microescala
Summary
La impresión 3D a escala micrométrica permite la creación rápida de prototipos de dispositivos poliméricos para cultivos de células neuronales. Como prueba de principio, las conexiones estructurales entre las neuronas se vieron limitadas por la creación de barreras y canales que influyen en el crecimiento de las neuritas, mientras que las consecuencias funcionales de dicha manipulación fueron observadas por la electrofisiología extracelular.
Abstract
Los cultivos neuronales han sido un modelo experimental de referencia durante varias décadas. Sin embargo, falta la disposición celular en 3D, las limitaciones espaciales en el crecimiento de las neuritas y la conectividad sináptica realista. Esto último limita el estudio de la estructura y la función en el contexto de la compartimentación y disminuye la importancia de las culturas en la neurociencia. Aproximarse ex vivo a la disposición anatómica estructurada de la conectividad sináptica no es trivial, a pesar de ser clave para la aparición de los ritmos, la plasticidad sináptica y, en última instancia, la fisiopatología cerebral. Aquí, la polimerización de dos fotones (2PP) se emplea como técnica de impresión 3D, lo que permite la fabricación rápida de dispositivos de cultivo celular polimérico utilizando polidimetil-siloxano (PDMS) a escala micrométrica. En comparación con las técnicas convencionales de moldeo de réplicas basadas en microfotolitografía, la impresión a microescala de 2PP permite una entrega rápida y asequible de prototipos. Este protocolo ilustra el diseño y la fabricación de dispositivos microfluídicos basados en PDMS destinados a cultivar redes neuronales modulares. Como prueba de principio, se presenta un dispositivo de dos cámaras para restringir físicamente la conectividad. Específicamente, se favorece un crecimiento axonal asimétrico durante el desarrollo ex vivo y se permite que se dirija de una cámara a otra. Con el fin de sondear las consecuencias funcionales de las interacciones sinápticas unidireccionales, se eligen matrices de microelectrodos comerciales para monitorizar la actividad bioeléctrica de los módulos neuronales interconectados. Aquí, se ilustran los métodos para 1) fabricar moldes con precisión micrométrica y 2) realizar registros extracelulares multisitio in vitro en cultivos neuronales corticales de rata. Al disminuir los costes y la futura accesibilidad generalizada de la impresión 3D 2PP, este método será cada vez más relevante en los laboratorios de investigación de todo el mundo. Especialmente en neurotecnología y registro de datos neuronales de alto rendimiento, la facilidad y rapidez de la creación de prototipos simplificados de modelos in vitro mejorará el control experimental y la comprensión teórica de los sistemas neuronales in vivo a gran escala.
Introduction
La investigación de la actividad neuronal en organismos que se comportan presenta varios desafíos. Por ejemplo, el acceso físico al tejido cerebral está limitado por la necesidad de mantener su integridad, por lo que las regiones superficiales del cerebro son más fáciles de considerar. Aislar objetivos específicos dentro del tejido intacto es a menudo una tarea desalentadora y, a veces, imposible. Aunque los cultivos neuronales homogéneos disociados ofrecen un acceso conveniente a las propiedades moleculares, bioquímicas y biofísicas de los componentes (sub)celulares individuales de un circuito neuronal, se pierde una conectividad realista y una organización anatómica del cerebro intacto. Estas limitaciones fundamentales inspiraron los esfuerzos de investigación para lograr un término medio, donde se evita la complejidad in vivo mientras que la estructura se puede construir in vitro, lo que está bajo demanda 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . En particular, los cultivos neuronales modulares han sido objeto de una amplia investigación en las últimas décadas, con el objetivo de abordar cuestiones clave de la fisiología del cerebro, como se describe a continuación.
Organización: Los estudios in vivo muestran que el cerebro está estructurado anatómicamente en capas con tipos celulares precisos y matrices de proyecciones. Los ensayos funcionales revelaron la organización de las redes neuronales en ensamblajes de nodos y módulos, con esquemas de conectividad precisos10,11. Sin embargo, el papel de la conectividad y los motivos de microcircuitos no puede estudiarse adecuadamente in vivo debido al gran número de sinapsis implicadas, así como a los efectos entrelazados del desarrollo y la plasticidad dependiente de la actividad.
Transferencia de señal: En cultivos in vivo o aleatorios in vitro , es difícil evaluar la transferencia de señales. El examen de la conducción axonal y el potencial de acción a lo largo de su longitud requiere guiar el crecimiento de las neuritas mediante la funcionalización de la superficie o el patrón químico, proporcionando una alta relación señal-ruido en las lecturas extracelulares de la actividad eléctrica12.
Relevancia traslacional: Descifrar el papel exclusivo de los elementos presinápticos frente a los postsinápticos en condiciones patológicas requiere tener acceso a estos elementos individualmente. Las culturas modulares con conectividad restringida, que segregan efectivamente los elementos presinápticos y postsinápticos, son herramientas indispensables para este fin13.
Existen varios métodos para obtener algún tipo de estructura en el cultivo neuronal. A grandes rasgos, se pueden clasificar como manipulación química y física de la superficie9. Los primeros métodos 14,15 se basan en la propensión de las células neuronales a unirse a ciertos compuestos (bio)químicos. Para ello es necesario depositar adhesivo o moléculas atractivas sobre una superficie con precisión a microescala y siguiendo un patrón detallado. Si bien esto permite una cobertura parcial de la superficie de las células, siguiendo el patrón deseado, los métodos químicos son inherentemente limitados y tienen una tasa de éxito relativamente baja en la guía del crecimiento de neuritas16. El control total sobre la direccionalidad de los axones requiere el establecimiento de un gradiente espacial de sustancias químicas ad-hoc para dar forma a la guía axonal17. Estos últimos métodos implican la manipulación de la superficie física y se utilizan más comúnmente para estructurar las redes neuronales in vitro. Las células neuronales están físicamente constreñidas en los lugares deseados por confinamientos geométricos, como cámaras microscópicas, paredes, canales, etc., dando forma a un polímero biocompatible como el polidimetilsiloxano (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 curado y solidificado en un dispositivo microfluídico. El método de facto para la fabricación microfluídica de PDMS es la fotolitografía blanda21, en la que se modela una máscara bidimensional a microescala y se emplea para grabar selectivamente un material a base de silicio tras la exposición a los rayos UV. En pocas palabras, una resina curable por UV (es decir, fotorresistente) se recubre sobre una oblea de silicio a través de un recubrimiento por centrifugación, alcanzando una altura específica determinada por su viscosidad y velocidad de centrifugado. A continuación, la máscara estampada se coloca sobre la fotorresistencia y se expone a la luz ultravioleta. Las áreas transparentes dentro de la máscara, correspondientes a las regiones de interés, permitirán que la luz ultravioleta induzca la reticulación localizada de las moléculas fotorresistentes. Las áreas de fotorresistencia no expuestas se lavan con un solvente, lo que da como resultado la formación de un molde maestro. Esto se usa repetidamente para hornear un elastómero de la elección (es decir, PDMS), que luego se graba con las geometrías deseadas en tantas réplicas como se desee. Este método de fabricación es el método más común para fabricar dispositivos microfluídicos22. Quizás las principales limitaciones de la fotolitografía blanda son el requisito previo de una notable inversión de capital y la falta de familiaridad de los laboratorios biológicos con las técnicas y la experiencia requeridas. La preparación de la máscara y los pasos de fotolitografía blanda necesarios para diseñar geometrías complejas de alta relación de aspecto de múltiples alturas no son triviales23 y, a menudo, requieren subcontratación. A pesar de que se han propuesto métodos alternativos y de bajo presupuesto, no siempre satisfacen los requisitos de alta precisión de la creación de prototipos biológicos24.
Aquí, se presenta un método de fabricación alternativo, basado en la polimerización de dos fotones (2PP) y la fabricación aditiva. Es sencillo y no requiere per se experiencia avanzada en microfabricación y microfotolitografía. El campo de investigación de la microfabricación de 2PP surgió a finales de los años 9025 y, desde entonces, ha experimentado un crecimiento exponencial26. Se puede encontrar más información sobre los principios fundamentales de esta técnica en otro lugar26. Brevemente, al enfocar el impulso de luz de excitación en el espacio tridimensional, 2PP aprovecha la dependencia no lineal de la absorción multifotónica de la intensidad. Esto otorga la capacidad de absorción confinada, asegurando una excitación precisa y selectiva dentro de regiones muy localizadas. En esencia, un fotorresistente de tono negativo, un material con solubilidad disminuida tras la exposición a la luz, se somete a un haz enfocado de pulsos de láser de femtosegundos a un ciclo de trabajo bajo27. Esto permite impulsos con altas intensidades a bajas potencias medias, lo que permite la polimerización sin dañar el material. La interacción de los monómeros radicales fotoinducidos da lugar a oligómeros radicales, iniciando una polimerización que se extiende por todo el fotorresistente hasta un volumen distinto, es decir, vóxel, cuyo tamaño depende de la intensidad y duración de los pulsos láser28.
En este trabajo se presentan dos componentes: A) el diseño y fabricación rápida de un molde impreso en 3D, reutilizable muchas veces para producir dispositivos de cultivo celular neuronal polimérico desechables (Figura 1), y B) su acoplamiento mecánico sobre la superficie de sustratos de cultivo celular neuronal plano, o incluso de matrices de microelectrodos integradas en sustratos capaces de registros multisitio de señales bioeléctricas.
Aquí se describe muy brevemente el diseño asistido por ordenador de un modelo mecánico en 3D y, acompañado de los pasos que conducen a un molde impreso en 3D y a la fabricación de dispositivos PDMS.
Se puede utilizar una variedad de aplicaciones de software de diseño asistido por computadora para generar el modelo de objeto 3D inicial y producir un archivo STL para controlar el proceso de impresión 2PP. Dentro de la Tabla de Materiales, la primera y la última aplicación enumeradas son gratuitas o se proporcionan con una licencia gratuita. La construcción de un modelo 3D siempre requiere la creación de un boceto 2D, que luego se extruye en los pasos de modelado posteriores. Para demostrar este concepto, se destaca un proceso genérico de diseño de software CAD 3D en la sección de protocolo, que conduce a una estructura hecha de cubos superpuestos. Para obtener información más completa, hay disponibles una serie de tutoriales en línea y recursos de capacitación gratuitos, como se indica en la Tabla de materiales.
El archivo STL resultante se traduce en una serie de comandos que debe ejecutar la impresora 3D (es decir, el procedimiento de corte). Para la impresora 3D 2PP específica en uso, se utiliza el software DeScribe para importar el archivo STL y convertirlo al formato propietario General Writing Language (GWL). El éxito del proceso de impresión 2PP depende de varios parámetros, en particular, la potencia del láser y su velocidad de escaneo, las distancias de costura y corte de sombreado. La elección de estos parámetros, junto con la selección del objetivo y la fotorresistencia, depende de las características más pequeñas del diseño, así como de la aplicación prevista. Por lo tanto, la optimización de parámetros se vuelve esencial para cumplir con los requisitos de diferentes escenarios de diseño y casos de uso. Para este trabajo, se ha considerado la receta recomendada IP-S 25x ITO Shell (3D MF) como configuración para los parámetros de impresión. En última instancia, una pieza impresa mecánicamente estable se imprime con la resolución necesaria al tiempo que se minimiza su tiempo de impresión 3D.
El diseño del molde y el archivo STL relacionado, demostrado en este trabajo, comprende un marco cuadrado para segregar el espacio de un cultivo celular en dos compartimentos: un área exterior (es decir, denominada Fuente posteriormente) y un área interior (es decir, denominada Objetivo posteriormente). Estos dos compartimentos están conectados a través de conjuntos de microcanales, cada uno caracterizado por bordes de ángulo agudo, diseñados para obstaculizar específicamente el crecimiento de las neuritas desde el Objetivo hasta la Fuente, pero no al revés, y como tal promueven una conectividad sináptica direccional entre las neuronas que crecen en las dos áreas.
Estudios anteriores emplearon diferentes geometrías de microcanales para estimular el crecimiento direccional de las neuritas. Algunos ejemplos son las formas triangulares18, las estructuras de púas de canal19 y los canales cónicos20. Aquí, se emplea un diseño con barreras de ángulo agudo a través de los bordes del microcanal, caracterizado también por entradas asimétricas. Estos microcanales sirven para establecer la continuidad entre un interior cerrado, el compartimento de destino, y el área externa, el compartimento de origen. La forma de embudo de la parte inicial de los microcanales, desde el lado de la fuente, está diseñada para promover la formación de haces axonales y su crecimiento a lo largo del camino más corto, es decir, en línea recta, que conecta la fuente con el objetivo. El espacio triangular realizado al enfrentar ángulos agudos tiene un mayor volumen en el lado del objetivo para tratar de retrasar efectivamente la búsqueda del camino de las neuritas, al tiempo que favorece el disparo rápido de los haces que se originan en la fuente y la ocupación del espacio disponible. La elección de 540 μm para la longitud de los microcanales filtra eficazmente la excrecencia dendrítica, generalmente más corta,39. Además, su altura de 5 μm evita que los somas celulares penetren a través de los microcanales. En general, esta configuración demostró promover la conectividad unidireccional entre los módulos externos, de origen, e internos, de destino, y se presenta aquí como una prueba de principio entre las muchas opciones alternativas.
Mientras que los dispositivos PDMS, fabricados por el molde de 2PP, se pueden unir a la superficie de sustratos comunes de cultivo celular, como cubreobjetos de vidrio o placas de Petri, en este trabajo se utilizaron matrices de microelectrodos integradas en sustrato disponibles comercialmente. No se ha hecho ningún esfuerzo para optimizar el diseño 3D a la disposición de la matriz de microelectrodos, y el acoplamiento mecánico se realizó bajo la guía de microscopía estereoscópica con el único objetivo de posicionar el dispositivo a través de la matriz, dejando algunos microelectrodos descubiertos en ambos lados, la fuente y el objetivo. Esto permite la evaluación preliminar de las consecuencias funcionales de la conectividad restringida en cultivos celulares neuronales.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar de tener décadas de antigüedad, la aplicación de la tecnología 2PP en el moldeo de réplicas basadas en PDMS a escala micrométrica es un desarrollo reciente43,44. En este contexto, a continuación se analizan una serie de puntos para ayudar a los usuarios a reproducir eficazmente esta obra.
Para el diseño de modelos 3D, asegúrese de que el modelo no tenga agujeros ni autointersecciones. Privilegie el formato de archivo binario al guardar como STL, por su tamaño de archivo más pequeño que el codificado en ASCII. Esto es especialmente beneficioso para diseños con geometrías intrincadas y para objetos de mililitros de ancho. El uso de archivos STL binarios también implica una baja carga de CPU, más adelante en el proceso de preparación de la pieza mecánica para ser impresa en 3D. Las dimensiones físicas de las entidades dentro del archivo STL se representan en unidades adimensionales. Durante el posprocesamiento del archivo STL, las unidades se interpretan como micrómetros. Por lo tanto, se recomienda adoptar por adelantado la unidad de interés, es decir, micrómetro, al preparar el archivo. La precisión del modelo impreso viene determinada por el número de superficies que se aproximan a los triángulos teselados. Para un número insuficiente de superficies, surgirá una rugosidad superficial no deseada. No obstante, apuntar a una precisión excesivamente alta por parte de un gran número de superficies tiene el precio de una alta carga computacional, lo que hace que el procesamiento del archivo sea lento.
Para la impresión 3D, durante la impresión, el objeto físico 3D se forma mediante un escaneo galvo rápido en el plano x-y y un movimiento piezoeléctrico en la dirección z. Esto enfoca el rayo láser de femtosegundos dentro de cualquier vóxel 3D dado. Sin embargo, cuando las estructuras de impresión son más grandes que los rangos de cobertura espacial de galvo y piezoeléctrico, el objeto debe dividirse mediante programación en bloques. Si bien este es un requisito para las piezas impresas de tamaño milimétrico, las uniones entre bloques están asociadas a líneas de costura (imperfectas). La optimización cuidadosa del recuento de bloques y la colocación de las líneas de costura en las direcciones x, y y z son cruciales para evitar la interrupción de las características geométricas críticas del objeto final con las líneas de unión. Las burbujas pueden formarse en la interfaz de impresión por varias razones (por ejemplo, las impurezas e inhomogeneidades de los sustratos fotorresistentes) y afectar negativamente a la calidad e integridad de la estructura impresa. Además, una mayor potencia del láser puede conducir a un aumento en su aparición. La reducción de la potencia del láser, en la capa más baja de la pieza impresa, minimizará las posibilidades de formación de burbujas. Como alternativa a la impresión de toda la pieza como una estructura sólida, se puede considerar el método de carcasa y andamio. Consiste en imprimir solo la superficie exterior de la pieza (carcasa), así como los elementos de prisma triangular dentro de ella. Estos elementos están separados por capas horizontales (andamio), sosteniendo la resina no polimerizada en pequeñas bolsas. Este método acorta significativamente el tiempo de impresión, especialmente para estructuras de tamaño milimétrico. Sin embargo, como la resina no polimerizada permanece, la exposición a los rayos UV posterior a la impresión es imprescindible para garantizar una estabilidad mecánica completa, aunque este paso debe realizarse con suavidad para evitar cualquier deformación de la pieza impresa. El tiempo de poscurado depende de la resina elegida, el grosor de la pieza y la potencia UV40. Para obtener resultados óptimos, se recomienda realizar un ensayo inicial para estimar el tiempo necesario para el curado en profundidad completa, utilizando una gota de fotorresistencia y evaluando su corte en sección, después de la exposición a los rayos UV. El período de curación habitual oscila entre 5 y 20 min.
Para el moldeo de réplicas de PDMS, la fabricación limpia de un dispositivo PDMS con características de escala micrométrica, sin instalaciones de sala limpia, puede ser un desafío: las micropartículas transportadas por el aire pueden residir en la superficie altamente adhesiva del PDMS y dificultar el sellado entre el dispositivo y el sustrato, o bloquear la sección de microcanales individuales. Realizar los pasos del protocolo bajo una campana de flujo laminar y proteger constantemente la superficie del PDMS con isopropanol minimiza sustancialmente los riesgos de contaminación. La temperatura de curado y su duración afectan directamente a la reticulación del PDMS y a las propiedades físicas resultantes. En particular, la adhesividad del PDMS curado es un factor crítico. Por un lado, se requiere un sello hermético entre el dispositivo PDMS y la superficie utilizada para el cultivo de células neuronales (por ejemplo, un cubreobjetos de vidrio o un MEA), para restringir eficazmente el paso de las neuritas. Por otro lado, el dispositivo PDMS debe adherirse a la superficie de forma reversible, de modo que la delicada capa aislante MEA no se dañe después de retirar el dispositivo. Si bien se produce una contracción de PDMS durante el curado y puede corregirse volviendo a escalar el molde por adelantado, para las temperaturas y los intervalos de curado indicados aquí, la contracción será inferior al 2%42 y no afectará significativamente a los dispositivos de PDMS de una sola capa. En general, siga con precisión los valores recomendados de temperatura y duración de curado, para obtener los mejores resultados.
Resumen de las ventajas y limitaciones del método
Se propone una técnica basada en la escritura láser directa de 2 fotones para la fabricación rápida de dispositivos poliméricos a microescala para el estudio experimental de redes neuronales modulares. A diferencia de la fotolitografía blanda, el enfoque propuesto no requiere un alto nivel de experiencia técnica, siempre que se pueda acceder y operar una configuración funcional de impresión 3D de 2PP. Sorprendentemente, el método permite pasar de un modelo 3D diseñado por CAD a un dispositivo PDMS funcional en un solo día, proporcionando así un camino directo y eficiente desde el concepto hasta la realización tangible. En concreto, optar por el modo de impresión de carcasa y andamio reduce significativamente el tiempo necesario para crear el molde, ya que solo se imprime una fracción de su volumen. El curado UV posterior del componente impreso garantiza su estabilidad mecánica y robustez, como se verifica aquí a lo largo de 50 ciclos de fundición con PDMS.
En comparación con los métodos tradicionales, la impresión 3D 2PP cuenta con una clara ventaja, que es más pronunciada cuando se trata de la fabricación de moldes con una relación de aspecto significativa, requisitos de resolución exigentes y geometrías tridimensionales complejas. La producción de moldes maestros mediante litografía UV estándar está limitada por un espesor de resistencia de aproximadamente 200 μm. Se requieren secuencias intrincadas de ciclos de recubrimiento por centrifugado y exposición35, costosos procesos LIGA (litografía, galvanoplastia y moldeo) o grabado iónico reactivo profundo (DRIE)36 36 para lograr una mayor altura y relaciones de aspecto. En marcado contraste, como se demostró en el trabajo pionero de Kumi et al. en 201037, la técnica 2PP ofrece un alcance esencialmente ilimitado para la relación de aspecto de las piezas impresas, que abarca desde submicrómetros hasta milímetros. Aquí, se ha ejemplificado el proceso de microfabricación de un molde con una diferencia significativa en la altura de sus porciones, con una distinción de más de 100 veces entre la altura de los microcanales (5 μm) y la altura máxima del molde (545 μm; ver Figura 2).
Además, la resolución submicrométrica podría lograrse fácilmente siguiendo las especificaciones del protocolo descritas. En comparación, lograr resoluciones de molde mejoradas a través de la fotolitografía UV exige una inversión de capital. Las máscaras con la resolución más fina, que utilizan deposición de cromo sobre cuarzo a una resolución nominal de 600 nm, tienen un precio varios órdenes de magnitud más alto que las máscaras de transparencia aéreas impresas con láser, que poseen una resolución de 250 μm35, sin embargo, véase el trabajo de Pirlo et al.41. Para que sea viable para el uso interno, el método elegido debe ser rentable. Para muchos laboratorios biológicos, el gasto total asociado con la fotolitografía blanda convencional o la escritura láser directa presenta una barrera. Si bien es factible hacer que ambas tecnologías sean más accesibles mediante la compra y el ensamblaje de los componentes esenciales, este enfoque exige experiencia adicional y aún requiere una inversión notable. En este contexto, un punto esencial a tener en cuenta es el amplio espectro de aplicaciones que se pueden lograr a través de la escritura láser directa. A diferencia de la fotolitografía blanda convencional, limitada principalmente a la microfabricación de moldes, la impresión 3D 2PP exhibe una notable versatilidad. Sus aplicaciones potenciales abarcan desde la microfluídica y la microóptica hasta la fotónica integrada y la micromecánica. Esto hace que invertir en esta tecnología sea atractivo como una instalación compartida para múltiples y diversos campos científicos. Por ejemplo, la metodología basada en 2PP ideada en este protocolo es el resultado de una colaboración interdisciplinaria entre los departamentos de neurociencia y matemáticas de nuestra institución. Además, el desarrollo de fotorresistencia es un campo activo de investigación y puede ampliar potencialmente la gama de aplicaciones de la impresión 3D 2PP. Un ejemplo de ello es la reciente introducción de la resina IP-PDMS. Al polimerizar en estructuras con propiedades como PDMS38, esta resina desbloquea el potencial para la microfabricación directa de componentes biocompatibles que tienen una superficie enrevesada o contienen espacios huecos. Estas complejidades se erigen como barreras para lograr resultados similares a través de los procedimientos convencionales de moldeo de réplicas.
Como demostración de este método, se proporcionó evidencia que sugiere el desarrollo de conectividad unidireccional entre dos módulos en una red neuronal modular. El molde a microescala, fabricado con la técnica 2PP, tenía suficiente resistencia para someterse a múltiples fundiciones de PDMS y tiene la precisión a microescala requerida. En conclusión, el ámbito de aplicación del protocolo descrito en este trabajo se extiende más allá del caso ilustrado. A medida que el acceso a la tecnología de impresión 2PP se generalice cada vez más, la inversión inicial necesaria para su implementación disminuirá, mientras que su gama de aplicaciones potenciales se ampliará.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.G. agradece el apoyo financiero del Programa Marco H2020 de la Unión Europea a través del Consejo Europeo de Innovación (proyecto IN-FET, GA n. 862882, proyecto Arbor-IO, FLAG-ERA y Human Brain Project, ID 650003) y de SISSA (Área de Neurociencias). G.N. agradece el apoyo financiero del Ministerio de Universidad e Investigación de Italia (MUR) a través de la beca Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (Área de Matemáticas). Agradecemos a M. Gigante, B. Pastore y M. Grandolfo por su ayuda con la impresión 3D, el cultivo celular y la imagen en vivo, así como a los Dres. P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente y H.C. Schultheiss por las discusiones. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
| BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). ————————————– Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
| CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-AP5 | Tocris | #0106 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
| Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
| in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
| NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
| Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
| Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
| Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |
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