Zwei-Photonen-Polymerisation 3D-Druck von neuronalen Zellkulturgeräten im Mikromaßstab
Summary
Der 3D-Druck im Mikrometermaßstab ermöglicht das schnelle Prototyping von polymeren Bauelementen für neuronale Zellkulturen. Als Proof-of-Principle wurden strukturelle Verbindungen zwischen Neuronen durch die Schaffung von Barrieren und Kanälen eingeschränkt, die das Wachstum von Neuriten beeinflussen, während die funktionellen Konsequenzen einer solchen Manipulation durch extrazelluläre Elektrophysiologie beobachtet wurden.
Abstract
Neuronale Kulturen sind seit mehreren Jahrzehnten ein experimentelles Referenzmodell. Es fehlen jedoch die 3D-Zellanordnung, räumliche Einschränkungen des Neuritenwachstums und eine realistische synaptische Konnektivität. Letzteres schränkt die Untersuchung von Struktur und Funktion im Kontext der Kompartimentierung ein und verringert die Bedeutung von Kulturen in den Neurowissenschaften. Die Annäherung an die strukturierte anatomische Anordnung der synaptischen Konnektivität ex vivo ist nicht trivial, obwohl sie für die Entstehung von Rhythmen, synaptischer Plastizität und letztendlich für die Pathophysiologie des Gehirns von entscheidender Bedeutung ist. Hier wird die Zwei-Photonen-Polymerisation (2PP) als 3D-Drucktechnik eingesetzt, die die schnelle Herstellung von polymeren Zellkulturgeräten unter Verwendung von Polydimethylsiloxan (PDMS) im Mikrometermaßstab ermöglicht. Im Vergleich zu herkömmlichen Replik-Formtechniken auf der Grundlage der Mikrophotolitographie ermöglicht der 2PP-Mikrodruck eine schnelle und kostengünstige Bearbeitung von Prototypen. Dieses Protokoll veranschaulicht das Design und die Herstellung von PDMS-basierten mikrofluidischen Geräten, die auf die Kultivierung modularer neuronaler Netze abzielen. Als Proof-of-Principle wird ein Zweikammergerät vorgestellt, um die Konnektivität physisch einzuschränken. Insbesondere wird ein asymmetrischer axonaler Auswuchs während der ex vivo-Entwicklung bevorzugt und darf von einer Kammer zur anderen geleitet werden. Um die funktionellen Konsequenzen unidirektionaler synaptischer Wechselwirkungen zu untersuchen, werden kommerzielle Mikroelektroden-Arrays ausgewählt, um die bioelektrische Aktivität miteinander verbundener neuronaler Module zu überwachen. Hier werden Methoden zur 1) Herstellung von Formen mit Mikrometergenauigkeit und 2) zur Durchführung extrazellulärer In-vitro-Multisite-Aufzeichnungen in kortikalen neuronalen Kulturen der Ratte veranschaulicht. Durch sinkende Kosten und die zukünftige breite Zugänglichkeit des 2PP-3D-Drucks wird diese Methode in Forschungslabors weltweit immer relevanter. Insbesondere in der Neurotechnologie und der neuronalen Datenaufzeichnung mit hohem Durchsatz wird die Leichtigkeit und Schnelligkeit des Prototypings vereinfachter In-vitro-Modelle die experimentelle Kontrolle und das theoretische Verständnis von in vivo großräumigen neuronalen Systemen verbessern.
Introduction
Die Untersuchung der neuronalen Aktivität in sich verhaltenden Organismen bringt mehrere Herausforderungen mit sich. Zum Beispiel ist der physische Zugang zum Hirngewebe durch die Notwendigkeit begrenzt, seine Integrität zu erhalten, so dass die oberflächlichen Regionen des Gehirns leichter berücksichtigt werden können. Die Isolierung spezifischer Ziele innerhalb des intakten Gewebes ist oft eine entmutigende Aufgabe und manchmal unmöglich. Obwohl dissoziierte homogene neuronale Kulturen einen bequemen Zugang zu den molekularen, biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften einzelner (sub)zellulärer Komponenten eines neuronalen Schaltkreises bieten, geht eine realistische Konnektivität und anatomische Organisation des intakten Gehirns verloren. Diese grundlegenden Einschränkungen inspirierten die Forschungsbemühungen, einen Mittelweg zu finden, bei dem In-vivo-Komplexität vermieden wird, während die Struktur in vitro konstruiert werden kann, was bei Bedarf erforderlich ist 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Insbesondere modulare neuronale Kulturen waren in den letzten Jahrzehnten Gegenstand umfangreicher Forschung, die darauf abzielte, Schlüsselfragen der Gehirnphysiologie zu beantworten, wie im Folgenden beschrieben.
Organisation: In-vivo-Studien zeigen, dass das Gehirn anatomisch in Schichten mit präzisen Zelltypen und Anordnungen von Projektionen strukturiert ist. Funktionelle Assays zeigten die Organisation der neuronalen Netzwerke in Knotenanordnungen und Modulen mit präzisen Konnektivitätsschemata10,11. Die Rolle von Konnektivitäts- und Mikroschaltungsmotiven kann jedoch aufgrund der schieren Anzahl der beteiligten Synapsen sowie der miteinander verwobenen Effekte von entwicklungs- und aktivitätsabhängiger Plastizität in vivo nicht ausreichend untersucht werden.
Signalübertragung: In In-vivo – oder zufälligen In-vitro-Kulturen ist es schwierig, die Signalübertragung zu beurteilen. Die Untersuchung der axonalen Leitung und des Aktionspotentials entlang seiner Länge erfordert die Steuerung des Neuritenwachstums durch Oberflächenfunktionalisierung oder chemische Strukturierung, die ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis bei extrazellulären Auslesungen der elektrischen Aktivität liefert12.
Translationale Relevanz: Um die ausschließliche Rolle von prä- und postsynaptischen Elementen bei pathologischen Zuständen zu entschlüsseln, muss man individuell auf diese Elemente zugreifen. Modulare Kulturen mit eingeschränkter Konnektivität, die die prä- und postsynaptischen Elemente effektiv trennen, sind zu diesem Zweck unverzichtbare Werkzeuge13.
Es gibt mehrere Methoden, um eine Form von Struktur in der neuronalen Kultur zu erhalten. Sie können grob als chemische und physikalische Oberflächenmanipulation kategorisiert werden9. Die erstgenannten Methoden14,15 beruhen auf der Neigung neuronaler Zellen, sich an bestimmte (bio)chemische Verbindungen zu binden. Dazu müssen Klebstoffe oder attraktive Moleküle mit Präzision im Mikromaßstab und nach einem detaillierten Muster auf eine Oberfläche aufgetragen werden. Während dies eine teilweise Abdeckung der Zelloberfläche nach dem gewünschten Muster ermöglicht, sind chemische Methoden von Natur aus begrenzt und haben eine relativ geringe Erfolgsrate bei der Steuerung des Neuritenwachstums16. Die vollständige Kontrolle über die Axondirektionalität erfordert die Etablierung eines räumlichen Gradienten von Ad-hoc-Chemikalien, um die axonale Führung zu formen17. Letztere Methoden beinhalten die physikalische Oberflächenmanipulation und werden häufiger verwendet, um die neuronalen Netzwerke in vitro zu strukturieren. Neuronale Zellen sind an den gewünschten Stellen durch geometrische Einschlüsse wie mikroskopische Kammern, Wände, Kanäle usw. physikalisch eingeschränkt und formen ein biokompatibles Polymer wie Polydimethylsiloxan (PDMS)3,5,6,7,18,19,20, das ausgehärtet und zu einem mikrofluidischen Gerät verfestigt wird. Das De-facto-Verfahren für die mikrofluidische Herstellung von PDMS ist die weiche Photolithographie21, bei der eine zweidimensionale Maske im Mikromaßstab strukturiert und verwendet wird, um ein siliziumbasiertes Material unter UV-Belichtung selektiv zu ätzen. Kurz gesagt, ein UV-härtendes Harz (d. h. Fotolack) wird durch Schleuderbeschichtung auf einen Siliziumwafer aufgetragen und erreicht eine bestimmte Höhe, die durch seine Viskosität und Schleudergeschwindigkeit bestimmt wird. Dann wird die gemusterte Maske über dem Fotolack positioniert und UV-Licht ausgesetzt. Transparente Bereiche innerhalb der Maske, die den interessierenden Regionen entsprechen, lassen UV-Licht eine lokalisierte Vernetzung der Fotolackmoleküle induzieren. Die Bereiche des unbelichteten Fotolacks werden mit einem Lösungsmittel abgewaschen, wodurch sich eine Urform bildet. Damit wird immer wieder ein Elastomer der Wahl (z.B. PDMS) eingebrannt, das dann mit den gewünschten Geometrien in beliebig viele Repliken graviert wird. Ein solches Herstellungsverfahren ist das gebräuchlichste Verfahren zur Herstellung mikrofluidischer Geräte22. Vielleicht sind die Haupteinschränkungen der weichen Photolithographie die Voraussetzung einer nennenswerten Kapitalinvestition und die Unkenntnis biologischer Labore mit den erforderlichen Techniken und Fachkenntnissen. Die Vorbereitung der Maske und die Schritte der weichen Photolithographie, die zum Entwerfen komplexer Geometrien mit mehreren Höhen und hohem Aspektverhältnis erforderlich sind, sind nicht trivial23 und erfordern oft Outsourcing. Auch wenn alternative und kostengünstige Methoden vorgeschlagen wurden, erfüllen sie nicht immer die hohen Präzisionsanforderungen des biologischen Prototyping24.
Hier wird ein alternatives Herstellungsverfahren vorgestellt, das auf Zwei-Photonen-Polymerisation (2PP) und additiver Fertigung basiert. Es ist unkompliziert und erfordert nicht per se fortgeschrittenes Fachwissen in der Mikrofabrikation und Mikrophotolitographie. Das Forschungsfeld der 2PP-Mikrofertigung entstand in den späten 90erJahren 25 und hat seitdem ein exponentielles Wachstum erlebt26. Mehr über die Grundprinzipien dieser Technik finden Sie an anderer Stelle26. Kurz gesagt, durch die Fokussierung des Anregungslichtimpulses im dreidimensionalen Raum nutzt 2PP die nichtlineare Abhängigkeit der Multiphotonenabsorption von der Intensität. Dies ermöglicht die Fähigkeit einer begrenzten Absorption und gewährleistet eine präzise und selektive Anregung in sehr lokalisierten Regionen. Im Wesentlichen wird ein Negativton-Fotolack, ein Material mit verminderter Löslichkeit bei Lichteinwirkung, einem fokussierten Strahl von Femtosekunden-Laserpulsen bei niedrigem Tastverhältnis27 ausgesetzt. Dies ermöglicht Impulse mit hoher Intensität bei niedrigen Durchschnittsleistungen und ermöglicht eine Polymerisation, ohne das Material zu schädigen. Die Wechselwirkung von photoinduzierten Radikalmonomeren führt zu radikalischen Oligomeren, die eine Polymerisation initiieren, die sich über den gesamten Fotolack bis zu einem bestimmten Volumen, d. h. Voxel, erstreckt, dessen Größe von der Intensität und Dauer der Laserpulse abhängt28.
In dieser Arbeit werden zwei Komponenten vorgestellt: A) das Design und die schnelle Herstellung einer 3D-gedruckten Form, die viele Male zur Herstellung von polymeren neuronalen Einweg-Zellkulturgeräten wiederverwendbar ist (Abbildung 1), und B) ihre mechanische Kopplung an die Oberfläche von planaren neuronalen Zellkultursubstraten oder sogar von substratintegrierten Mikroelektrodenarrays, die in der Lage sind, bioelektrische Signale an mehreren Standorten aufzuzeichnen.
Das computergestützte Design eines mechanischen 3D-Modells wird hier sehr kurz beschrieben und von den Schritten begleitet, die zu einer 3D-gedruckten Form und zur Herstellung von PDMS-Geräten führen.
Eine Vielzahl von computergestützten Design-Softwareanwendungen kann verwendet werden, um das Start-3D-Objektmodell zu generieren und eine STL-Datei zur Steuerung des 2PP-Druckprozesses zu erstellen. Innerhalb der Materialtabelle sind die erste und die letzte aufgeführte Anwendung kostenlos oder mit einer freien Lizenz versehen. Die Konstruktion eines 3D-Modells erfordert immer die Erstellung einer 2D-Skizze, die dann in nachfolgenden Modellierungsschritten extrudiert wird. Um dieses Konzept zu demonstrieren, wird im Protokollabschnitt ein generischer 3D-CAD-Software-Designprozess hervorgehoben, der zu einer Struktur aus überlappenden Würfeln führt. Für umfassendere Informationen stehen eine Reihe von Online-Tutorials und kostenlosen Schulungsressourcen zur Verfügung, wie in der Materialtabelle angegeben.
Die resultierende STL-Datei wird dann in eine Reihe von Befehlen übersetzt, die vom 3D-Drucker ausgeführt werden (d.h. Slicing-Verfahren). Für den jeweils verwendeten 2PP 3D-Drucker wird die Software DeScribe verwendet, um die STL-Datei zu importieren und in das proprietäre General Writing Language (GWL) Format zu konvertieren. Der Erfolg des 2PP-Druckverfahrens hängt von verschiedenen Parametern ab, insbesondere von der Laserleistung und der Scangeschwindigkeit, den Näh- und Schraffur-Schneide-Abständen. Die Wahl dieser Parameter sowie die Auswahl von Objektiv und Fotolack hängen von den kleinsten Merkmalen des Designs sowie der beabsichtigten Anwendung ab. Daher wird die Parameteroptimierung unerlässlich, um den Anforderungen verschiedener Designszenarien und Anwendungsfälle gerecht zu werden. Für diese Arbeit wurde die empfohlene Rezeptur IP-S 25x ITO Shell (3D MF) als Konfiguration für die Druckparameter berücksichtigt. Letztendlich wird ein mechanisch stabiles gedrucktes Teil mit der erforderlichen Auflösung gedruckt und gleichzeitig die 3D-Druckzeit minimiert.
Das Formdesign und die zugehörige STL-Datei, die in dieser Arbeit demonstriert werden, umfassen einen quadratischen Rahmen, um den Raum einer Zellkultur in zwei Kammern zu unterteilen: einen äußeren Bereich (d. h. später als Quelle bezeichnet) und einen inneren Bereich (d. h. später als Ziel bezeichnet). Diese beiden Kompartimente sind durch Sätze von Mikrokanälen verbunden, die jeweils durch scharfwinklige Grenzen gekennzeichnet sind, die speziell das Wachstum von Neuriten vom Ziel zur Quelle behindern sollen, aber nicht umgekehrt, und als solche eine gerichtete synaptische Konnektivität zwischen Neuronen fördern, die auf den beiden Bereichen wachsen.
Frühere Studien verwendeten verschiedene Geometrien von Mikrokanälen, um das gerichtete Wachstum von Neuriten zu fördern. Beispiele sind dreieckige Formen18, Kanal-Stachelstrukturen19 und sich verjüngende Kanäle20. Hier wird ein Design mit scharfen Winkelbarrieren über die Grenzen des Mikrokanals verwendet, das sich auch durch asymmetrische Eingänge auszeichnet. Diese Mikrokanäle dienen dazu, die Kontinuität zwischen einem geschlossenen Innenraum, dem Target-Kompartiment, und dem externen Bereich, dem Source-Kompartiment, herzustellen. Die Trichterform des anfänglichen Teils der Mikrokanäle von der Quellenseite aus soll die Bildung von axonalen Bündeln und deren Wachstum entlang des kürzesten, d.h. geraden Weges, der die Quelle mit dem Ziel verbindet, fördern. Der dreieckige Raum, der durch scharfe Winkel realisiert wird, hat ein größeres Volumen auf der Zielseite, um die Wegfindung von Neuriten effektiv zu verzögern und gleichzeitig das schnelle Schießen von Bündeln aus der Quelle und die Besetzung des verfügbaren Raums zu begünstigen. Die Wahl von 540 μm für die Länge der Mikrokanäle filtert den im Allgemeinen kürzeren dendritischen Auswuchs effektivheraus 39. Darüber hinaus verhindert ihre Höhe von 5 μm, dass Zellspalte durch die Mikrokanäle eindringen. Insgesamt hat sich gezeigt, dass diese Konfiguration die unidirektionale Konnektivität zwischen dem äußeren Quell- und dem inneren Zielmodul fördert, und sie wird hier als Proof-of-Principle unter den vielen alternativen Optionen vorgestellt.
Während die PDMS-Bauelemente, die durch die 2PP-Form hergestellt werden, an der Oberfläche gängiger Zellkultursubstrate wie Glasdeckgläser oder Petrischalen befestigt werden können, wurden in dieser Arbeit kommerziell erhältliche substratintegrierte Mikroelektrodenarrays verwendet. Es wurden keine Anstrengungen unternommen, um das 3D-Design für das Layout des Mikroelektrodenarrays zu optimieren, und die mechanische Kopplung wurde unter stereomikroskopischer Anleitung durchgeführt, um das Gerät nur über das Array zu positionieren, wobei auf beiden Seiten, der Quelle und dem Target, eine Mikroelektrode freigelegt wurde. Dies ermöglicht die vorläufige Bewertung der funktionellen Konsequenzen der eingeschränkten Konnektivität in neuronalen Zellkulturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl die 2PP-Technologie Jahrzehnte alt ist, ist die Anwendung der 2PP-Technologie im PDMS-basierten Replik-Spritzguss im Mikrometermaßstab eine neue Entwicklung43,44. In diesem Zusammenhang werden im Folgenden eine Reihe von Punkten erörtert, die den Benutzern bei der effektiven Reproduktion dieser Arbeit helfen sollen.
Stellen Sie bei der 3D-Modellkonstruktion sicher, dass das Modell keine Löcher oder Selbstschnitte aufweist. Privilegieren Sie das binäre Dateiformat beim Speichern als STL, da es eine geringere Dateigröße als ASCII-codiert hat. Dies ist besonders vorteilhaft für Designs mit komplizierten Geometrien und für milliliterbreite Objekte. Die Verwendung von binären STL-Dateien impliziert auch eine geringe CPU-Last, wodurch später im Prozess das mechanische Teil für den 3D-Druck vorbereitet wird. Die physischen Abmessungen der Features in der STL-Datei werden in dimensionslosen Einheiten dargestellt. Bei der Nachbearbeitung der STL-Datei werden Einheiten als Mikrometer interpretiert. Daher wird empfohlen, bei der Vorbereitung der Datei im Voraus die interessierende Einheit, d. h. Mikrometer, zu verwenden. Die Genauigkeit des gedruckten Modells wird durch die Anzahl der Oberflächen bestimmt, die sich den mosaikartierten Dreiecken annähern. Bei einer unzureichenden Anzahl von Oberflächen tritt eine unerwünschte Oberflächenrauheit auf. Das Streben nach übermäßig hoher Genauigkeit durch eine sehr große Anzahl von Oberflächen geht jedoch mit einer hohen Rechenlast einher, was zu einer langsamen Dateiverarbeitung führt.
Beim 3D-Druck wird das physische 3D-Objekt während des Drucks durch schnelles Galvo-Scannen in der x-y-Ebene und Piezobewegung in z-Richtung geformt. Dadurch wird der Femtosekunden-Laserstrahl innerhalb eines bestimmten 3D-Voxels fokussiert. Wenn die Druckstrukturen jedoch größer sind als die räumlichen Abdeckungsbereiche von Galvo und Piezo, muss das Objekt programmgesteuert in Blöcke aufgeteilt werden. Während dies eine Anforderung für millimetergroße gedruckte Teile ist, sind Verbindungsstellen zwischen Blöcken mit (unvollkommenen) Heftlinien verbunden. Eine sorgfältige Optimierung der Anzahl der Blöcke und die Platzierung von Stitching-Linien in x-, y- und z-Richtung sind entscheidend, um zu vermeiden, dass kritische geometrische Merkmale des endgültigen Objekts durch Stitching-Linien gestört werden. Blasen können sich aus verschiedenen Gründen an der Druckschnittstelle bilden (z. B. Verunreinigungen und Inhomogenitäten von Fotolacken von Substraten) und sich negativ auf die Qualität und Integrität der gedruckten Struktur auswirken. Darüber hinaus kann eine höhere Laserleistung zu einer Zunahme ihres Auftretens führen. Durch die Reduzierung der Laserleistung in der untersten Schicht des gedruckten Teils wird die Wahrscheinlichkeit der Blasenbildung minimiert. Als Alternative zum Drucken des gesamten Teils als feste Struktur kann das Schalen-Gerüst-Verfahren in Betracht gezogen werden. Dabei werden nur die Außenfläche des Teils (Schale) sowie dreieckige Prismenelemente darin gedruckt. Diese Elemente sind durch horizontale Schichten (Gerüst) getrennt, die das nicht polymerisierte Harz in kleinen Taschen halten. Dieses Verfahren verkürzt die Druckzeit erheblich, was insbesondere für millimetergroße Strukturen relevant ist. Da jedoch nicht polymerisiertes Harz zurückbleibt, ist eine UV-Belichtung nach dem Druck unerlässlich, um die volle mechanische Stabilität zu gewährleisten, obwohl dieser Schritt vorsichtig durchgeführt werden muss, um eine Verformung des gedruckten Teils zu vermeiden. Die Nachhärtungszeit hängt vom gewählten Harz, der Dicke des Teils und der UV-Leistung40 ab. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, wird empfohlen, einen ersten Versuch durchzuführen, um die Zeit abzuschätzen, die für die vollständige Aushärtung benötigt wird, indem ein Tropfen Fotolack verwendet und der Schnitt nach der UV-Exposition ausgewertet wird. Die übliche Aushärtungszeit liegt zwischen 5 und 20 Minuten.
Für das PDMS-Replik-Spritzgießen kann die saubere Herstellung eines PDMS-Geräts mit mikrometergroßen Merkmalen ohne Reinraumeinrichtungen eine Herausforderung darstellen: Luftgetragene Mikropartikel können sich auf der stark haftenden Oberfläche des PDMS befinden und die Abdichtung zwischen dem Gerät und dem Substrat behindern oder den Abschnitt einzelner Mikrokanäle blockieren. Die Durchführung der Protokollschritte unter einer Laminar-Flow-Haube und die konsequente Abschirmung der PDMS-Oberfläche mit Isopropanol minimiert das Kontaminationsrisiko erheblich. Die Aushärtungstemperatur und ihre Dauer wirken sich direkt auf die PDMS-Vernetzung und die daraus resultierenden physikalischen Eigenschaften aus. Insbesondere die Haftfähigkeit von ausgehärtetem PDMS ist ein kritischer Faktor. Einerseits ist eine dichte Abdichtung zwischen dem PDMS-Gerät und der für die neuronale Zellkultivierung verwendeten Oberfläche (z. B. einem Glasdeckglas oder einem MEA) erforderlich, um den Durchgang der Neuriten effektiv zu begrenzen. Andererseits sollte das PDMS-Gerät reversibel an der Oberfläche befestigt werden, damit die empfindliche Isolierschicht MEAs nach dem Entfernen des Geräts nicht beschädigt wird. Während die PDMS-Schrumpfung während der Aushärtung auftritt und durch eine vorherige Neuskalierung der Form korrigiert werden kann, beträgt die Schrumpfung bei den hier angegebenen Temperaturen und Aushärtungsintervallen weniger als 2 %42 und wirkt sich nicht wesentlich auf einschichtige PDMS-Geräte aus. Befolgen Sie insgesamt genau die empfohlenen Werte für Aushärtungstemperatur und -dauer, um die besten Ergebnisse zu erzielen.
Vorteile und Grenzen der Methode im Überblick
Eine Technik, die auf direktem 2-Photonen-Laserschreiben basiert, wird für die schnelle Herstellung von polymeren Bauelementen im Mikromaßstab für die experimentelle Untersuchung modularer neuronaler Netze vorgeschlagen. Im Gegensatz zur weichen Photolithographie erfordert der vorgeschlagene Ansatz kein hohes Maß an technischem Fachwissen, vorausgesetzt, ein funktionaler 2PP-3D-Druckaufbau ist zugänglich und betriebsbereit. Bemerkenswerterweise ermöglicht die Methode den Übergang von einem CAD-entworfenen 3D-Modell zu einem funktionsfähigen PDMS-Gerät innerhalb eines einzigen Tages und bietet so einen direkten und effizienten Weg vom Konzept zur greifbaren Realisierung. Insbesondere die Entscheidung für den Schalen- und Gerüstdruckmodus reduziert die Zeit, die für die Erstellung der Form benötigt wird, erheblich, da nur ein Bruchteil ihres Volumens gedruckt wird. Die anschließende UV-Härtung des gedruckten Bauteils garantiert dessen mechanische Stabilität und Robustheit, wie hier über 50 Gießzyklen mit PDMS nachgewiesen.
Im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren bietet der 2PP-3D-Druck einen klaren Vorteil, der am deutlichsten ausgeprägt ist, wenn es um die Herstellung von Formen mit einem signifikanten Seitenverhältnis, hohen Auflösungsanforderungen und komplexen dreidimensionalen Geometrien geht. Die Herstellung von Urformen mit Standard-UV-Lithographie ist durch eine Lackdicke von ca. 200 μm eingeschränkt. Komplizierte Sequenzen von Schleuderbeschichtungs- und Belichtungszyklen35, kostspielige LIGA-Prozesse (Lithographie, Galvanik und Formgebung) oder Deep Reactive Ion Etching (DRIE)36 sind erforderlich, um größere Höhen- und Aspektverhältnisse zu erreichen. Im Gegensatz dazu bietet die 2PP-Technik, wie in der Pionierarbeit von Kumi et al. aus dem Jahr 201037 gezeigt wurde, einen im Wesentlichen unbegrenzten Spielraum für das Aspektverhältnis der gedruckten Teile, das von Submikrometern bis zu Millimetern reicht. Hier wurde der Mikroherstellungsprozess einer Form mit signifikanten Höhenunterschieden ihrer Teile veranschaulicht, wobei die Höhe der Mikrokanäle (5 μm) und die maximale Werkzeughöhe (545 μm; siehe Abbildung 2) mehr als 100-fach voneinander unterschieden wurden.
Außerdem könnte eine Auflösung im Submikrometerbereich leicht erreicht werden, indem die beschriebenen Protokollspezifikationen befolgt werden. Im Vergleich dazu erfordert das Erreichen verbesserter Formauflösungen durch UV-Photolithographie Kapitalinvestitionen. Die Masken mit der feinsten Auflösung, bei denen Chromabscheidung auf Quarz mit einer nominalen Auflösung von 600 nm verwendet wird, sind um mehrere Größenordnungen teurer als die lasergedruckten Overhead-Transparenzmasken, die eine Auflösung von 250μm 35 besitzen, siehe jedoch die Arbeit von Pirlo et al.41. Um für den internen Einsatz rentabel zu sein, muss eine gewählte Methode kostengünstig sein. Für viele biologische Labore stellen die Gesamtkosten, die mit der herkömmlichen Soft-Photolithographie oder dem direkten Laserschreiben verbunden sind, ein Hindernis dar. Es ist zwar möglich, beide Technologien durch den Kauf und die Montage der wesentlichen Komponenten zugänglicher zu machen, aber dieser Ansatz erfordert zusätzliches Know-how und erfordert dennoch eine beträchtliche Investition. Ein wesentlicher Punkt ist in diesem Zusammenhang das breitere Anwendungsspektrum, das durch direktes Laserschreiben erreicht werden kann. Im Gegensatz zur herkömmlichen weichen Fotolithographie, die hauptsächlich auf die Mikrofertigung von Formen beschränkt ist, weist der 2PP-3D-Druck eine bemerkenswerte Vielseitigkeit auf. Die Anwendungsmöglichkeiten reichen von der Mikrofluidik und Mikrooptik bis hin zur integrierten Photonik und Mikromechanik. Dies macht die Investition in diese Technologie als gemeinsame Einrichtung für mehrere und unterschiedliche wissenschaftliche Bereiche attraktiv. Zum Beispiel ist die 2PP-basierte Methodik, die in diesem Protokoll entwickelt wurde, das Ergebnis einer interdisziplinären Zusammenarbeit zwischen neurowissenschaftlichen und mathematischen Abteilungen innerhalb unserer Institution. Darüber hinaus ist die Entwicklung von Fotolacken ein aktives Forschungsfeld und kann das Anwendungsspektrum des 2PP-3D-Drucks erweitern. Ein typisches Beispiel ist die kürzliche Einführung von IP-PDMS-Harz. Durch die Polymerisation in Strukturen mit Eigenschaften wie PDMS38 erschließt dieses Harz das Potenzial für die direkte Mikrofabrikation biokompatibler Komponenten mit gewellter Oberfläche oder Hohlräumen. Diese Feinheiten stellen ein Hindernis dar, um ähnliche Ergebnisse durch herkömmliche Nachbauverfahren zu erzielen.
Als Demonstration dieser Methode wurden Beweise für die Entwicklung einer unidirektionalen Konnektivität zwischen zwei Modulen in einem modularen neuronalen Netzwerk vorgelegt. Die im 2PP-Verfahren hergestellte Mikroform hatte genug Ausdauer, um mehreren PDMS-Gussarbeiten unterzogen zu werden, und verfügt über die erforderliche Präzision im Mikromaßstab. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Anwendungsbereich des in dieser Arbeit beschriebenen Protokolls über den dargestellten Fall hinausgeht. Mit zunehmender Verbreitung des Zugangs zur 2PP-Drucktechnologie werden die für die Implementierung erforderlichen Anfangsinvestitionen sinken und gleichzeitig die Anwendungsmöglichkeiten erweitert.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.G. dankt für die finanzielle Unterstützung durch das Rahmenprogramm H2020 der Europäischen Union durch den Europäischen Innovationsrat (IN-FET-Projekt, GA n. 862882, Arbor-IO-Projekt, FLAG-ERA und das Human Brain Project, ID 650003) und durch SISSA (Neuroscience Area). G.N. bedankt sich für die finanzielle Unterstützung des italienischen Ministeriums für Universität und Forschung (MUR) durch das Stipendium Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (Bereich Mathematik). Wir danken M. Gigante, B. Pastore und M. Grandolfo für ihre Unterstützung beim 3D-Druck, der Zellkultivierung und der Live-Bildgebung sowie Dr. P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente und H.C. Schultheiss für die Diskussionen. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
| BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). ————————————– Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
| CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-AP5 | Tocris | #0106 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
| Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
| in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
| NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
| Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
| Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
| Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |
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