Polimerização de dois fótons Impressão 3D de dispositivos de cultura de células neuronais em microescala
Summary
A impressão 3D em escala micrométrica permite a prototipagem rápida de dispositivos poliméricos para culturas de células neuronais. Como prova de princípio, as conexões estruturais entre os neurônios foram restringidas pela criação de barreiras e canais que influenciam o crescimento dos neuritos, enquanto as consequências funcionais de tal manipulação foram observadas pela eletrofisiologia extracelular.
Abstract
As culturas neuronais têm sido um modelo experimental de referência há várias décadas. No entanto, o arranjo de células 3D, restrições espaciais no crescimento de neuritos e conectividade sináptica realista estão faltando. Este último limita o estudo da estrutura e da função no contexto da compartimentalização e diminui o significado das culturas na neurociência. Aproximar ex vivo o arranjo anatômico estruturado da conectividade sináptica não é trivial, apesar de ser fundamental para o surgimento de ritmos, plasticidade sináptica e, em última análise, fisiopatologia cerebral. Aqui, a polimerização de dois fótons (2PP) é empregada como uma técnica de impressão 3D, permitindo a fabricação rápida de dispositivos de cultura de células poliméricas usando polidimetil-siloxano (PDMS) em escala micrométrica. Em comparação com as técnicas convencionais de moldagem de réplicas baseadas em microfotolitografia, a impressão em microescala de 2PP permite um retorno rápido e acessível dos protótipos. Este protocolo ilustra o projeto e fabricação de dispositivos microfluídicos baseados em PDMS destinados à cultura de redes neuronais modulares. Como prova de princípio, um dispositivo de duas câmaras é apresentado para restringir fisicamente a conectividade. Especificamente, um crescimento axonal assimétrico durante o desenvolvimento ex vivo é favorecido e permitido ser direcionado de uma câmara para a outra. A fim de investigar as consequências funcionais de interações sinápticas unidirecionais, arranjos comerciais de microeletrodos são escolhidos para monitorar a atividade bioelétrica de módulos neuronais interconectados. Aqui, métodos para 1) fabricar moldes com precisão micrométrica e 2) realizar registros extracelulares multissítio in vitro em culturas neuronais corticais de ratos são ilustrados. Ao diminuir os custos e a futura acessibilidade generalizada da impressão 3D 2PP, este método tornar-se-á cada vez mais relevante em todos os laboratórios de investigação em todo o mundo. Especialmente em neurotecnologia e registro de dados neurais de alto rendimento, a facilidade e rapidez da prototipagem de modelos in vitro simplificados melhorará o controle experimental e a compreensão teórica de sistemas neurais in vivo em larga escala.
Introduction
A investigação da atividade neuronal em organismos comportados apresenta vários desafios. Por exemplo, o acesso físico ao tecido cerebral é limitado pela necessidade de manter sua integridade, de modo que as regiões superficiais do cérebro são mais facilmente consideradas. Isolar alvos específicos dentro do tecido intacto é muitas vezes uma tarefa assustadora e, às vezes, impossível. Embora culturas neuronais homogêneas dissociadas ofereçam acesso conveniente às propriedades moleculares, bioquímicas e biofísicas de componentes (sub)celulares individuais de um circuito neural, uma conectividade realista e organização anatômica do cérebro intacto é perdida. Essas restrições fundamentais inspiraram esforços de pesquisa para alcançar um meio termo, onde a complexidade in vivo é evitada enquanto a estrutura pode ser construída in vitro, o que é sob demanda 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Em particular, culturas neuronais modulares têm sido objeto de extensa pesquisa nas últimas décadas, com o objetivo de abordar questões-chave da fisiologia cerebral, conforme descrito abaixo.
Organização: Estudos in vivo mostram que o cérebro é estruturado anatomicamente em camadas com tipos celulares precisos e arranjos de projeções. Ensaios funcionais revelaram a organização das redes neuronais em conjuntos e módulos de nós, com esquemas precisos deconectividade10,11. O papel da conectividade e dos motivos de microcircuitos não pode, no entanto, ser estudado adequadamente in vivo devido ao grande número de sinapses envolvidas, bem como aos efeitos entrelaçados do desenvolvimento e da plasticidade dependente da atividade.
Transferência de sinal: Em culturas in vivo ou aleatórias in vitro , é um desafio avaliar a transferência de sinal. Examinar a condução axonal e o potencial de ação ao longo de sua extensão requer guiar o crescimento neurítico por funcionalização superficial ou padronização química, proporcionando uma alta relação sinal-ruído em leituras extracelulares da atividade elétrica12.
Relevância translacional: Decifrar o papel exclusivo de elementos pré versus pós-sinápticos em condições patológicas requer ter acesso a esses elementos individualmente. Culturas modulares com conectividade restrita, segregando efetivamente os elementos pré e pós-sinápticos, são ferramentas indispensáveis para esse fim13.
Existem vários métodos para obter alguma forma de estrutura em cultura neuronal. Podem ser amplamente categorizadas como manipulação química e física desuperfícies9. Os primeiros métodos 14,15 baseiam-se na propensão das células neuronais a se ligarem a determinados compostos (bio)químicos. Isso requer a deposição de moléculas adesivas ou atrativas em uma superfície com precisão em microescala e seguindo um padrão detalhado. Embora isso permita uma cobertura parcial da superfície das células, seguindo o padrão desejado, os métodos químicos são inerentemente limitados e têm uma taxa de sucesso relativamente baixa na orientação do crescimento de neuritos16. O controle total sobre a direcionalidade axonal requer o estabelecimento de um gradiente espacial de produtos químicos ad-hoc para moldar a orientação axonal17. Estes últimos métodos envolvem a manipulação física da superfície e são mais comumente usados para estruturar as redes neuronais in vitro. As células neuronais são fisicamente restringidas nos locais desejados por confinamentos geométricos, como câmaras microscópicas, paredes, canais, etc., moldando um polímero biocompatível, como o polidimetilsiloxano (PDMS)3,5,6,7,18,19,20, curado e solidificado em um dispositivo microfluídico. O método de fato para a fabricação microfluídica do PDMS é a fotolitografia suave21, onde uma máscara bidimensional é padronizada em microescala e empregada para condicionar seletivamente um material à base de silício após exposição UV. Em poucas palavras, uma resina curável por UV (isto é, fotorresistente) é revestida sobre um wafer de silício através de spin-coating, atingindo uma altura específica determinada por sua viscosidade e velocidade de rotação. Em seguida, a máscara estampada é posicionada sobre o fotorresistente e exposta à luz UV. Áreas transparentes dentro da máscara, correspondentes a regiões de interesse, permitirão que a luz UV induza ligações cruzadas localizadas das moléculas fotorresistentes. As áreas de fotorresistência não expostas são lavadas usando um solvente, resultando na formação de um molde mestre. Isso é repetidamente usado para assar um elastômero da escolha (ou seja, PDMS), que é então gravado com as geometrias desejadas em quantas réplicas desejar. Este método de fabricação é o mais comum para a fabricação de dispositivos microfluídicos22. Talvez as principais limitações da fotolitografia suave sejam o pré-requisito de um notável investimento de capital e o desconhecimento dos laboratórios biológicos com as técnicas e conhecimentos necessários. A preparação da máscara e as etapas da fotolitografia suave necessárias para projetar geometrias complexas de alta proporção de altura múltipla não são triviais23 e muitas vezes requerem terceirização. Embora métodos alternativos e de baixo orçamento tenham sido propostos, nem sempre satisfazem os requisitos de alta precisão da prototipagem biológica24.
Aqui, um método alternativo de fabricação é apresentado, baseado na polimerização de dois fótons (2PP) e manufatura aditiva. É simples e não requer por si só conhecimentos avançados em microfabricação e microfotolitografia. O campo de pesquisa da micromanufatura de 2PP surgiu no final da década de 9025 e, desde então, tem testemunhado um crescimento exponencial26. Mais sobre os princípios fundamentais dessa técnica podem ser encontrados em outra publicação26. Resumidamente, ao focalizar o impulso de luz de excitação no espaço tridimensional, 2PP aproveita a dependência não linear da absorção de multifótons na intensidade. Isso confere a capacidade de absorção confinada, garantindo excitação precisa e seletiva dentro de regiões muito localizadas. Em essência, um fotorresiste de tom negativo, um material com solubilidade diminuída após exposição à luz, é submetido a um feixe focalizado de pulsos de laser de femtossegundo em um ciclo de trabalhobaixo 27. Isso permite impulsos com altas intensidades em baixas potências médias, possibilitando a polimerização sem agredir o material. A interação de monômeros radicais fotoinduzidos dá origem a oligômeros radicais, iniciando a polimerização que se estende por todo o fotorresiste até um volume distinto, ou seja, voxel, cujo tamanho depende da intensidade e duração dos pulsos de laser28.
Neste trabalho, dois componentes são apresentados: A) o projeto e a fabricação rápida de um molde impresso em 3D, reutilizável muitas vezes para produzir dispositivos descartáveis de cultura de células neuronais poliméricas (Figura 1), e B) seu acoplamento mecânico à superfície de substratos de cultura de células neuronais planas, ou mesmo de arranjos de microeletrodos integrados a substratos capazes de registros multissítio de sinais bioelétricos.
O Projeto Assistido por Computador de um modelo mecânico 3D é descrito muito brevemente aqui e acompanhado pelas etapas que levam a um molde impresso em 3D e a fabricação de dispositivos PDMS também é detalhada.
Uma variedade de aplicativos de software de design auxiliado por computador pode ser usada para gerar o modelo de objeto 3D inicial e produzir um arquivo STL para controlar o processo de impressão 2PP. Dentro da Tabela de Materiais, o primeiro e o último aplicativos listados são gratuitos ou fornecidos com uma licença gratuita. A construção de um modelo 3D sempre requer a criação de um esboço 2D, que é então extrudado nas etapas de modelagem subsequentes. Para demonstrar esse conceito, um processo genérico de projeto de software CAD 3D é destacado na seção de protocolo, levando a uma estrutura feita de cubos sobrepostos. Para obter informações mais abrangentes, vários tutoriais on-line e recursos de treinamento gratuitos estão disponíveis, conforme indicado na Tabela de Materiais.
O arquivo STL resultante é então convertido em uma série de comandos a serem executados pela impressora 3D (ou seja, procedimento de fatiamento). Para a impressora 3D 2PP específica em uso, o software DeScribe é usado para importar o arquivo STL e convertê-lo no formato proprietário General Writing Language (GWL). O sucesso do processo de impressão 2PP depende de vários parâmetros, notavelmente, a potência do laser e sua velocidade de digitalização, costura e distâncias de eclosão-fatiamento. A escolha desses parâmetros, juntamente com a seleção de objetiva e fotorresistente, depende das menores características do projeto, bem como da aplicação pretendida. Assim, a otimização de parâmetros torna-se essencial para atender aos requisitos de diferentes cenários de projeto e casos de uso. Para este trabalho, a receita recomendada IP-S 25x ITO Shell (3D MF) foi considerada como uma configuração para os parâmetros de impressão. Em última análise, uma peça impressa mecanicamente estável é impressa com a resolução necessária, minimizando seu tempo de impressão 3D.
O projeto do molde e o arquivo STL relacionado, demonstrado neste trabalho, compreende uma estrutura quadrada para segregar o espaço de uma cultura de células em dois compartimentos: uma área externa (i.e., referida como Source posteriormente) e uma área interna (i.e., referida como Target posteriormente). Esses dois compartimentos são conectados através de conjuntos de microcanais, cada um caracterizado por bordas de ângulo nítido, projetadas especificamente para impedir o crescimento de neuritos do Alvo para a Fonte, mas não vice-versa, e como tal promover uma conectividade sináptica direcional entre os neurônios que crescem nas duas áreas.
Estudos anteriores empregaram diferentes geometrias de microcanais para incentivar o crescimento direcional de neuritos. Exemplos incluem formas triangulares18, estruturas farpadas de canal19 e canais de afunilamento20. Aqui, é empregado um projeto com barreiras angulares nítidas através das bordas do microcanal, caracterizado também por entradas assimétricas. Esses microcanais servem para estabelecer a continuidade entre um interior fechado, o compartimento Alvo, e a área externa, o compartimento Fonte. A forma de funil da parte inicial dos microcanais, do lado da Fonte, é projetada para promover a formação de feixes axonais e seu crescimento ao longo do caminho mais curto, ou seja, em linha reta, conectando a Fonte ao Alvo. O espaço triangular realizado por ângulos agudos tem maior volume no lado do Alvo para efetivamente retardar a descoberta do caminho dos neuritos, favorecendo o disparo rápido de feixes provenientes da Fonte e a ocupação do espaço disponível. A escolha de 540 μm para o comprimento dos microcanais filtra efetivamente o crescimento dendrítico geralmente mais curto39. Além disso, sua altura de 5 μm impede que a somata celular penetre através dos microcanais. No geral, essa configuração provou promover conectividade unidirecional entre os módulos externo, Source e interno, Target, e é apresentada aqui como uma prova de princípio entre as muitas opções alternativas.
Enquanto os dispositivos PDMS, fabricados pelo molde de 2PP, podem ser fixados à superfície de substratos comuns de cultura celular, tais como lamínulas de vidro ou placas de Petri, neste trabalho foram utilizados arranjos de microeletrodos integrados a substratos comercialmente disponíveis. Nenhum esforço foi feito para otimizar o projeto 3D para o layout do arranjo de microeletrodos, e o acoplamento mecânico foi realizado sob orientação de estereomicroscopia visando apenas posicionar o dispositivo através do array, deixando alguns microeletrodos descobertos em ambos os lados, a Fonte e o Alvo. Isso permite a avaliação preliminar das consequências funcionais da conectividade restrita em culturas de células neuronais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apesar de ser centenária, a aplicação da tecnologia 2PP na moldagem de réplicas baseadas em PDMS em escala micrométrica é um desenvolvimento recente43,44. Nesse contexto, uma série de pontos são discutidos a seguir para auxiliar os usuários na reprodução efetiva deste trabalho.
Para o projeto do modelo 3D, certifique-se de que o modelo não tenha furos ou auto-interseções. Privilegie o formato de arquivo binário ao salvar como STL, por seu tamanho de arquivo menor do que o codificado em ASCII. Isso é especialmente benéfico para projetos com geometrias intrincadas e para objetos de mililitros. O uso de arquivos STL binários também implica baixa carga de CPU, mais tarde no processo de preparação da parte mecânica a ser impressa em 3D. As dimensões físicas dos recursos dentro do arquivo STL são representadas em unidades adimensionais. Durante o pós-processamento do arquivo STL, as unidades são interpretadas como micrômetros. Portanto, recomenda-se adotar antecipadamente a unidade de interesse, ou seja, micrômetro, ao preparar o arquivo. A precisão do modelo impresso é determinada pelo número de superfícies que se aproximam dos triângulos tesselados. Para um número insuficiente de superfícies, surgirá rugosidade superficial indesejada. No entanto, almejar uma precisão excessivamente alta por um número muito grande de superfícies tem o preço de uma alta carga computacional, fazendo com que o processamento do arquivo seja lento.
Para impressão 3D, durante a impressão, o objeto físico 3D é formado usando digitalização rápida de galvo no plano x-y e movimento piezo na direção z. Isso foca o feixe de laser de femtossegundo dentro de qualquer voxel 3D dado. No entanto, quando as estruturas de impressão são maiores do que as faixas de cobertura espacial do galvo e do piezo, o objeto deve ser programaticamente dividido em blocos. Embora isso seja um requisito para peças impressas de tamanho milimétrico, as junções entre blocos estão associadas a linhas de costura (imperfeitas). A otimização cuidadosa da contagem de blocos e a colocação de linhas de costura nas direções x, y e z são cruciais para evitar interromper as características geométricas críticas do objeto final com linhas de costura. Bolhas podem se formar na interface de impressão por várias razões (por exemplo, impurezas e inomogeneidades de substratos fotoresistentes) e afetar negativamente a qualidade e a integridade da estrutura impressa. Além disso, uma maior potência do laser pode levar a um aumento na sua ocorrência. Reduzir a potência do laser, na camada mais baixa da peça impressa, minimizará as chances de formação de bolhas. Como alternativa à impressão de toda a peça como uma estrutura sólida, o método shell-and-scaffold pode ser considerado. Envolve imprimir apenas a superfície externa da peça (concha), bem como elementos de prisma triangular dentro dela. Esses elementos são separados por camadas horizontais (andaimes), segurando a resina não polimerizada em pequenos bolsos. Este método reduz significativamente o tempo de impressão, particularmente relevante para estruturas de tamanho milimétrico. No entanto, como a resina não polimerizada permanece, a exposição UV pós-impressão é imprescindível para garantir total estabilidade mecânica, embora essa etapa deva ser realizada suavemente para evitar qualquer deformação da peça impressa. O tempo de pós-cura depende da resina escolhida, da espessura da peça e da potência UV40. Para obter os melhores resultados, recomenda-se a realização de um ensaio inicial para estimar o tempo necessário para a cura em profundidade total, usando uma gota de fotorresiste e avaliando seu corte de seção, após a exposição aos raios UV. O período habitual de cura varia entre 5 a 20 min.
Para a moldagem de réplicas de PDMS, a fabricação limpa de um dispositivo PDMS com recursos em escala micrométrica, sem instalações de sala limpa, pode ser desafiadora: micropartículas transportadas pelo ar podem residir na superfície altamente adesiva do PDMS e dificultar a vedação entre o dispositivo e o substrato, ou bloquear a seção de microcanais individuais. Executar as etapas do protocolo sob uma capela de fluxo laminar e proteger consistentemente a superfície do PDMS com isopropanol minimiza substancialmente os riscos de contaminação. A temperatura de cura e sua duração afetam diretamente a reticulação PDMS e as propriedades físicas resultantes. Em particular, a adesividade do PDMS curado é um fator crítico. Por um lado, é necessária uma vedação apertada entre o dispositivo PDMS e a superfície usada para a cultura de células neuronais (por exemplo, uma lamínula de vidro ou um MEA), para restringir efetivamente a passagem dos neuritos. Por outro lado, o dispositivo PDMS deve se fixar à superfície de forma reversível, para que a delicada camada isolante MEAs não seja danificada após a remoção do dispositivo. Embora o encolhimento do PDMS durante a cura ocorra e possa ser corrigido pelo reescalonamento inicial do molde, para temperaturas e intervalos de cura indicados aqui, a contração será inferior a 2%42 e não afetará significativamente os dispositivos PDMS de camada única. No geral, siga com precisão os valores recomendados de temperatura e duração de cura, para obter os melhores resultados.
Visão geral das vantagens e limitações do método
Uma técnica baseada na escrita direta a laser de 2 fótons é proposta para a fabricação rápida de dispositivos poliméricos em microescala para o estudo experimental de redes neurais modulares. Ao contrário da fotolitografia suave, a abordagem proposta não requer um alto nível de conhecimento técnico, desde que uma configuração funcional de impressão 3D 2PP seja acessível e operacional. Notavelmente, o método permite passar de um modelo 3D projetado em CAD para um dispositivo PDMS funcional em um único dia, fornecendo assim um caminho direto e eficiente do conceito à realização tangível. Especificamente, optar pelo modo de impressão shell-and-scaffold reduz significativamente o tempo necessário para criar o molde, já que apenas uma fração de seu volume é impressa. A cura UV subsequente do componente impresso garante sua estabilidade mecânica e robustez, como verificado aqui ao longo de 50 ciclos de fundição com PDMS.
Em comparação com os métodos tradicionais, a impressão 3D 2PP possui uma vantagem clara, que é mais pronunciada quando se trata da fabricação de moldes com uma proporção significativa, requisitos de resolução exigentes e geometrias tridimensionais complexas. A produção de moldes mestres usando litografia UV padrão é limitada por uma espessura de resistência de aproximadamente 200 μm. Sequências intrincadas de ciclos de spin-coating e exposição35, dispendiosos processos LIGA (Litografia, Galvanoplastia e Moldagem) ou corrosão profunda de íons reativos (DRIE)36 são necessários para alcançar maiores proporções e altura. Em nítido contraste, como demonstrado no trabalho pioneiro de Kumi et al., em 201037, a técnica de 2PP oferece um escopo essencialmente ilimitado para a proporção das peças impressas, abrangendo de sub-micrômetros a milímetros. Aqui, o processo de microfabricação de um molde com diferença significativa na altura de suas porções foi exemplificado, caracterizando uma distinção de mais de 100 vezes entre a altura dos microcanais (5 μm e a altura máxima do molde (545 μm; ver Figura 2).
Além disso, a resolução submicrométrica poderia ser facilmente alcançada seguindo as especificações do protocolo descritas. Em comparação, alcançar resoluções aprimoradas de moldes por meio da fotolitografia UV exige investimento de capital. As máscaras com a melhor resolução, utilizando deposição de cromo no quartzo a uma resolução nominal de 600 nm, têm um preço várias ordens de magnitude maior do que as máscaras de transparência aérea impressas a laser, que possuem uma resolução de 250 μm35, no entanto, veja o trabalho de Pirlo et al.41. Para ser viável para uso interno, um método escolhido deve ser econômico. Para muitos laboratórios biológicos, o gasto global associado à fotolitografia mole convencional ou à escrita direta a laser apresenta uma barreira. Embora seja viável tornar ambas as tecnologias mais acessíveis comprando e montando os componentes essenciais, essa abordagem exige conhecimentos adicionais e ainda requer um investimento notável. Nesse contexto, um ponto essencial a ser considerado é o espectro mais amplo de aplicações alcançáveis por meio da escrita direta a laser. Ao contrário da fotolitografia suave convencional, principalmente limitada à microfabricação de moldes, a impressão 3D 2PP exibe uma versatilidade notável. Suas aplicações potenciais abrangem desde microfluídica e micro-óptica até fotônica e micromecânica integradas. Isso torna o investimento nessa tecnologia atraente como uma instalação compartilhada para múltiplos e diversos campos científicos. Por exemplo, a metodologia baseada em 2PP desenvolvida neste protocolo é o resultado de uma colaboração interdisciplinar entre os departamentos de neurociências e matemática de nossa instituição. Além disso, o desenvolvimento de fotorresistentes é um campo ativo de pesquisa, e pode potencialmente expandir a gama de aplicações da impressão 3D 2PP. Um exemplo é a recente introdução da resina IP-PDMS. Ao polimerizar em estruturas com propriedades como o PDMS38, essa resina libera o potencial para a microfabricação direta de componentes biocompatíveis que têm superfície contorcida ou contêm espaços ocos. Esses meandros são barreiras para alcançar resultados semelhantes por meio de procedimentos convencionais de moldagem de réplicas.
Como demonstração deste método, evidências foram fornecidas sugerindo o desenvolvimento de conectividade unidirecional entre dois módulos em uma rede neuronal modular. O molde em microescala, fabricado pela técnica de 2PP, tinha resistência suficiente para ser submetido a múltiplas fundições de PDMS, e tem a precisão de microescala necessária. Em conclusão, o escopo de aplicação do protocolo descrito neste trabalho vai além do caso ilustrado. À medida que o acesso à tecnologia de impressão 2PP se torna cada vez mais difundido, o investimento inicial necessário para sua implementação diminuirá, enquanto sua gama de aplicações potenciais se expandirá.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.G. reconhece o apoio financeiro do Programa-Quadro H2020 da União Europeia através do Conselho Europeu de Inovação (projeto IN-FET, GA N. 862882, projeto Arbor-IO, FLAG-ERA e Projeto Cérebro Humano, ID 650003) e da SISSA (Área de Neurociências). A G.N. reconhece o apoio financeiro do Ministério Universitário e de Pesquisa (MUR) da Itália por meio da bolsa Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (Área de Matemática). Agradecemos a M. Gigante, B. Pastore e M. Grandolfo por sua assistência com impressão 3D, cultivo de células e imagens ao vivo, bem como aos Drs. P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente e H.C. Schultheiss pelas discussões. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.
Materials
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
| BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). ————————————– Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
| CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-AP5 | Tocris | #0106 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
| Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
| in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
| NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
| Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
| Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
| Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |
References
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Dual-compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front Neuroeng. 4, 13 (2011).
- Maeda, E., Robinson, H. P. C., Kawana, A. The mechanisms of generation and propagation of synchronized bursting in developing networks of cortical neurons. J Neurosci. 15 (10), 6834-6845 (1995).
- Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Designing neural networks in culture. Proc IEEE Inst Electr Electron Eng. 98 (3), 398-406 (2010).
- DeMarse, T. B., Pan, L., Alagapan, S., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Feed-forward propagation of temporal and rate information between cortical populations during coherent activation in engineered in vitro networks. Front Neural Circuits. 10, 32 (2016).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J Neural Eng. 9 (3), 036010 (2012).
- Brofiga, M., Pisano, M., Tedesco, M., Raiteri, R., Massobrio, P. Three-dimensionality shapes the dynamics of cortical interconnected to hippocampal networks. J Neural Eng. 15 (5), 056044 (2020).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PLoS One. 9 (9), e107400 (2014).
- Hasan, M. F., Berdichevsky, Y. Neural circuits on a chip. Micromachines. 7 (9), 157 (2016).
- Aebersold, M. J., et al. 34;Brains on a chip": Towards engineered neural networks. TrAC Tren Anal Chem. 78, 60-69 (2016).
- Zamora-López, G., Chen, Y., Deco, G., Kringelbach, M. L., Zhou, C. Functional complexity emerging from anatomical constraints in the brain: The significance of network modularity and rich-clubs. Sci Rep. 6, 38424 (2016).
- Eytan, D., Marom, S. Dynamics and effective topology underlying synchronization in networks of cortical neurons. J Neurosci. 26 (33), 8465-8476 (2006).
- Pan, L., Alagapan, S., Franca, E., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Propagation of action potential activity in a predefined microtunnel neural network. J Neural Eng. 8 (4), 046031 (2011).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting corticostriatal network on-a-chip reveals the contribution of the presynaptic compartment to Huntington’s disease. Cell Rep. 22 (1), 110-122 (2018).
- Kleinfeld, D., Kahler, K., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
- Vogt, A. K., Wrobel, G., Meyer, W., Knoll, W., Offenhäusser, A. Synaptic plasticity in micropatterned neuronal networks. Biomaterials. 26 (15), 2549-2557 (2005).
- Staii, C., et al. Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy. Biomaterials. 30 (20), 3397-3404 (2009).
- Fricke, R., et al. Axon guidance of rat cortical neurons by microcontact printed gradients. Biomaterials. 32 (8), 2070-2076 (2011).
- Gladkov, A., et al. Design of cultured neuron networks in vitro with predefined connectivity using asymmetric microfluidic channels. Sci Rep. 7 (1), 15625 (2017).
- le Feber, J., Postma, W., de Weerd, E., Weusthof, M., Rutten, W. L. Barbed channels enhance unidirectional connectivity between neuronal networks cultured on multi electrode arrays. Front Neurosci. 9, 412 (2015).
- Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie – International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. Eur Phys J Spec Top. 204, 85-101 (2012).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. J Vis Exp. (119), e55276 (2017).
- Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. (153), e60307 (2019).
- Maruo, S., Nakamura, O., Kawata, S. Three-dimensional microfabrication with two-photon-absorbed photopolymerization. Opt Lett. 22 (2), 132-134 (1997).
- Baldacchini, T. . Three-dimensional microfabrication using two-photon polymerization: Fundamentals, technology, and applications. , (2015).
- Madou, M. J. . Fundamentals of Microfabrication. , (2018).
- Sun, H. B., Kawata, S. Two-photon photopolymerization and 3D lithographic microfabrication. NMR, 3D Anal, Photopolymeriz. Adv Poly Sci. 170, 169-273 (2004).
- Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: Lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
- Kamioka, H., Maeda, E., Jimbo, Y., Robinson, H. P. C., Kawana, A. Spontaneous periodic synchronized bursting during formation of mature patterns of connections in cortical cultures. Neurosci Lett. 206 (2-3), 109-112 (1996).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). J Vis Exp. (39), e2056 (2010).
- Mahmud, M., Pulizzi, R., Vasilaki, E., Giugliano, M. QSPIKE tools: A generic framework for parallel batch preprocessing of extracellular neuronal signals recorded by substrate microelectrode arrays. Front Neuroinform. 8, 26 (2014).
- Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6 (1), 24701 (2016).
- Scarsi, F., Tessadori, J., Chiappalone, M., Pasquale, V. Investigating the impact of electrical stimulation temporal distribution on cortical network responses. BMC Neurosci. 18 (1), 49 (2017).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Kim, K., et al. Rapid replication of polymeric and metallic high aspect ratio microstructures using PDMS and liga technology. Microsystem Technologies. 9 (1-2), 5-10 (2002).
- Kumi, G., Yanez, C. O., Belfield, K. D., Fourkas, J. T. High-speed multiphoton absorption polymerization: Fabrication of microfluidic channels with arbitrary cross-sections and high aspect ratios. Lab Chip. 10 (8), 1057-1060 (2010).
- Bunea, A. I., et al. et al.Micro 3D printing by two-photon polymerization: Configurations and parameters for the nanoscribe system. Micro. 1 (2), 164-180 (2021).
- Taylor, A., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Oakdale, J. S., Ye, J., Smith, W. L., Biener, J. Post-print UV curing method for improving the mechanical properties of prototypes derived from two-photon lithography. Opt. Express. 24 (24), 27077-27086 (2016).
- Pirlo, R. K., Sweeney, A. J., Ringeisen, B. R., Kindy, M., Gao, B. Z. Biochip/laser cell deposition system to assess polarized axonal growth from single neurons and neuron/glia pairs in microchannels with novel asymmetrical geometries. Biomicrofluidics. 5 (1), 13408 (2011).
- Madsen, M. H., Feidenhans’l, N. A., Hansen, P. E., Garnæs, J., Dirscherl, K. Accounting for PDMS shrinkage when replicating structures. J Micromech Microeng. 24 (12), 127002 (2014).
- Comina, G., Suskaa, A., Filippini, D. PDMS lab-on-a-chip fabrication using 3D printed templates. Lab Chip. 14 (2), 424-430 (2013).
- Chan, H. N., et al. one-step molding of 3D-printed structures for convenient fabrication of truly 3D PDMS microfluidic chips. Microfluid Nanofluid. 19, 9-18 (2015).
