Polymérisation à deux photons : impression 3D de dispositifs de culture de cellules neuronales à micro-échelle
Summary
L’impression 3D à l’échelle micrométrique permet le prototypage rapide de dispositifs polymères pour les cultures cellulaires neuronales. En tant que preuve de principe, les connexions structurelles entre les neurones ont été contraintes par la création de barrières et de canaux influençant la croissance des neurites, tandis que les conséquences fonctionnelles d’une telle manipulation ont été observées par électrophysiologie extracellulaire.
Abstract
Les cultures neuronales sont un modèle expérimental de référence depuis plusieurs décennies. Cependant, l’arrangement des cellules 3D, les contraintes spatiales sur la croissance des neurites et la connectivité synaptique réaliste sont absents. Ce dernier limite l’étude de la structure et de la fonction dans le contexte de la compartimentation et diminue l’importance des cultures en neurosciences. Se rapprocher ex vivo de l’arrangement anatomique structuré de la connectivité synaptique n’est pas trivial, bien qu’il soit essentiel pour l’émergence des rythmes, de la plasticité synaptique et, en fin de compte, de la physiopathologie cérébrale. Ici, la polymérisation à deux photons (2PP) est utilisée comme technique d’impression 3D, permettant la fabrication rapide de dispositifs de culture cellulaire polymère utilisant du polydiméthylsiloxane (PDMS) à l’échelle micrométrique. Par rapport aux techniques conventionnelles de moulage de répliques basées sur la microphotolitographie, l’impression à micro-échelle 2PP permet un délai d’exécution rapide et abordable des prototypes. Ce protocole illustre la conception et la fabrication de dispositifs microfluidiques à base de PDMS visant à cultiver des réseaux neuronaux modulaires. En guise de preuve de principe, un dispositif à deux chambres est présenté pour limiter physiquement la connectivité. Plus précisément, une excroissance axonale asymétrique au cours du développement ex vivo est favorisée et autorisée à être dirigée d’une chambre à l’autre. Afin de sonder les conséquences fonctionnelles des interactions synaptiques unidirectionnelles, des réseaux de microélectrodes commerciaux sont choisis pour surveiller l’activité bioélectrique des modules neuronaux interconnectés. Ici, des méthodes pour 1) fabriquer des moules avec une précision micrométrique et 2) effectuer des enregistrements extracellulaires multisites in vitro dans des cultures neuronales corticales de rat sont illustrées. En réduisant les coûts et l’accessibilité généralisée future de l’impression 3D 2PP, cette méthode deviendra de plus en plus pertinente dans les laboratoires de recherche du monde entier. En particulier dans les neurotechnologies et l’enregistrement de données neuronales à haut débit, la facilité et la rapidité du prototypage de modèles in vitro simplifiés amélioreront le contrôle expérimental et la compréhension théorique des systèmes neuronaux in vivo à grande échelle.
Introduction
L’étude de l’activité neuronale chez les organismes comportementaux présente plusieurs défis. Par exemple, l’accès physique au tissu cérébral est limité par la nécessité de maintenir son intégrité, de sorte que les régions superficielles du cerveau sont plus facilement prises en compte. Isoler des cibles spécifiques dans le tissu intact est souvent une tâche ardue et parfois impossible. Bien que les cultures neuronales homogènes dissociées offrent un accès pratique aux propriétés moléculaires, biochimiques et biophysiques des composants (sub)cellulaires individuels d’un circuit neuronal, une connectivité réaliste et une organisation anatomique du cerveau intact sont perdues. Ces contraintes fondamentales ont inspiré les efforts de recherche pour parvenir à un terrain d’entente, où la complexité in vivo est évitée tandis que la structure peut être construite in vitro, ce qui est à la demande 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . En particulier, les cultures neuronales modulaires ont fait l’objet de recherches approfondies au cours des dernières décennies, visant à aborder des questions clés de physiologie cérébrale décrites ci-dessous.
Organisation : Des études in vivo montrent que le cerveau est structuré anatomiquement en couches avec des types de cellules précis et des réseaux de projections. Des tests fonctionnels ont révélé l’organisation des réseaux neuronaux en assemblages de nœuds et en modules, avec des schémas de connectivité précis10,11. Le rôle de la connectivité et des motifs de microcircuits ne peut cependant pas être étudié de manière adéquate in vivo en raison du grand nombre de synapses impliquées, ainsi que des effets imbriqués du développement et de la plasticité dépendante de l’activité.
Transfert de signal : Dans les cultures in vivo ou in vitro aléatoires, il est difficile d’évaluer le transfert de signaux. L’examen de la conduction axonale et du potentiel d’action sur toute sa longueur nécessite de guider la croissance des neurites par fonctionnalisation de surface ou par structuration chimique, fournissant un rapport signal/bruit élevé dans les lectures extracellulaires de l’activité électrique12.
Pertinence translationnelle : Déchiffrer le rôle exclusif des éléments pré- et post-synaptiques dans des conditions pathologiques nécessite d’avoir accès à ces éléments individuellement. Les cultures modulaires à connectivité limitée, séparant efficacement les éléments pré et post-synaptiques, sont des outils indispensables à cette fin13.
Plusieurs méthodes existent pour obtenir une certaine forme de structure dans la culture neuronale. Ils peuvent être classés dans la catégorie des manipulations chimiques et physiques de surface9. Les premières méthodes 14,15 reposent sur la propension des cellules neuronales à se fixer à certains composés (bio)chimiques. Cela nécessite de déposer des molécules adhésives ou attrayantes sur une surface avec une précision microscopique et en suivant un motif détaillé. Bien que cela permette une couverture partielle de la surface des cellules, suivant le modèle souhaité, les méthodes chimiques sont intrinsèquement limitées et ont un taux de réussite relativement faible dans le guidage de la croissance des neurites16. Le contrôle total de la directionnalité axonale nécessite l’établissement d’un gradient spatial de produits chimiques ad hoc pour façonner le guidage axonal17. Ces dernières méthodes impliquent une manipulation physique de surface et sont plus couramment utilisées pour structurer les réseaux neuronaux in vitro. Les cellules neuronales sont physiquement contraintes aux endroits souhaités par des confinements géométriques, tels que des chambres microscopiques, des parois, des canaux, etc., façonnant un polymère biocompatible tel que le polydiméthylsiloxane (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 durci et solidifié dans un dispositif microfluidique. La méthode de facto pour la fabrication microfluidique PDMS est la photolithographie douce21, où un masque bidimensionnel est modelé à une échelle microscopique et utilisé pour graver sélectivement un matériau à base de silicium lors d’une exposition aux UV. En un mot, une résine durcissable aux UV (c’est-à-dire la résine photosensible) est appliquée sur une plaquette de silicium par spin-coating, atteignant une hauteur spécifique déterminée par sa viscosité et sa vitesse de rotation. Ensuite, le masque à motifs est positionné sur la résine photosensible et exposé à la lumière UV. Les zones transparentes à l’intérieur du masque, correspondant aux régions d’intérêt, permettront à la lumière UV d’induire une réticulation localisée des molécules de photorésine. Les zones de résine photosensible non exposées sont lavées à l’aide d’un solvant, ce qui entraîne la formation d’un moule maître. Ceci est utilisé à plusieurs reprises pour cuire un élastomère de votre choix (c’est-à-dire PDMS), qui est ensuite gravé avec les géométries souhaitées dans autant de répliques que souhaité. Une telle méthode de fabrication est la méthode la plus courante pour fabriquer des dispositifs microfluidiques22. Les principales limites de la photolithographie douce sont peut-être la condition préalable à un investissement en capital notable et la méconnaissance des laboratoires biologiques avec les techniques et l’expertise requises. La préparation du masque et les étapes de photolithographie douce nécessaires à la conception de géométries complexes à hauteur multiple et à haut rapport d’aspect ne sont pas triviales23 et nécessitent souvent une sous-traitance. Même si des méthodes alternatives et peu coûteuses ont été proposées, elles ne répondent pas toujours aux exigences de haute précision du prototypage biologique24.
Ici, une méthode de fabrication alternative est présentée, reposant sur la polymérisation à deux photons (2PP) et la fabrication additive. Il est simple et ne nécessite pas en soi une expertise avancée en microfabrication et en microphotolographie. Le domaine de recherche de la microfabrication 2PP a émergé à la fin des années 9025, et depuis lors, il a connu une croissance exponentielle26. Vous trouverez plus d’informations sur les principes fondamentaux de cette technique ailleurs26. En bref, en concentrant l’impulsion lumineuse d’excitation dans un espace tridimensionnel, le 2PP exploite la dépendance non linéaire de l’absorption multiphotonique à l’intensité. Cela confère la capacité d’absorption confinée, assurant une excitation précise et sélective dans des régions très localisées. En substance, une résine photosensible à tons négatifs, un matériau dont la solubilité diminue lors de l’exposition à la lumière, est soumise à un faisceau focalisé d’impulsions laser femtosecondes à un faible facteur de service27. Cela permet des impulsions de haute intensité à de faibles puissances moyennes, permettant la polymérisation sans endommager le matériau. L’interaction des monomères radicaux photo-induits donne naissance à des oligomères radicaux, initiant une polymérisation qui s’étend dans toute la résine jusqu’à un volume distinct, c’est-à-dire un voxel, dont la taille dépend de l’intensité et de la durée des impulsions laser28.
Dans ce travail, deux composantes sont présentées : A) la conception et la fabrication rapide d’un moule imprimé en 3D, réutilisable plusieurs fois pour produire des dispositifs de culture cellulaire neuronale polymère jetables (Figure 1), et B) leur couplage mécanique à la surface de substrats de culture cellulaire neuronale plane, ou encore de réseaux de microélectrodes intégrés au substrat capables d’enregistrements multisites de signaux bioélectriques.
La conception assistée par ordinateur d’un modèle mécanique 3D est très brièvement décrite ici et accompagnée des étapes menant à un moule imprimé en 3D et à la fabrication de dispositifs PDMS est également détaillée.
Une variété d’applications logicielles de conception assistée par ordinateur peuvent être utilisées pour générer le modèle d’objet 3D de départ et produire un fichier STL pour contrôler le processus d’impression 2PP. Dans la table des matières, la première et la dernière application répertoriées sont gratuites ou fournies avec une licence gratuite. La construction d’un modèle 3D nécessite toujours la création d’une esquisse 2D, qui est ensuite extrudée lors des étapes de modélisation suivantes. Pour démontrer ce concept, un processus de conception générique de logiciel de CAO 3D est mis en évidence dans la section protocole, conduisant à une structure faite de cubes superposés. Pour des informations plus complètes, un certain nombre de tutoriels en ligne et de ressources de formation gratuites sont disponibles, comme indiqué dans le tableau des matériaux.
Le fichier STL résultant est ensuite traduit en une série de commandes à exécuter par l’imprimante 3D (c’est-à-dire la procédure de découpage). Pour l’imprimante 3D 2PP spécifique utilisée, le logiciel DeScribe est utilisé pour importer le fichier STL et le convertir au format propriétaire General Writing Language (GWL). Le succès du processus d’impression 2PP dépend de divers paramètres, notamment la puissance du laser et sa vitesse de numérisation, ses distances d’assemblage et de hachures-tranchage. Le choix de ces paramètres, ainsi que la sélection de l’objectif et de la résine photosensible, dépendent des plus petites caractéristiques de la conception, ainsi que de l’application prévue. Ainsi, l’optimisation des paramètres devient essentielle pour répondre aux exigences des différents scénarios de conception et cas d’utilisation. Pour ce travail, la recette recommandée IP-S 25x ITO Shell (3D MF) a été considérée comme une configuration pour les paramètres d’impression. En fin de compte, une pièce imprimée mécaniquement stable est imprimée avec la résolution nécessaire tout en minimisant son temps d’impression 3D.
La conception du moule et le fichier STL associé, démontrés dans ce travail, comprennent un cadre carré pour séparer l’espace d’une culture cellulaire en deux compartiments : une zone externe (c’est-à-dire appelée Source par la suite) et une zone intérieure (c’est-à-dire appelée Cible par la suite). Ces deux compartiments sont reliés par des ensembles de microcanaux, chacun caractérisé par des bordures à angle aigu, conçus pour entraver spécifiquement la croissance des neurites de la cible à la source, mais pas l’inverse, et en tant que tels favoriser une connectivité synaptique directionnelle entre les neurones se développant sur les deux zones.
Des études antérieures utilisaient différentes géométries de microcanaux pour encourager la croissance directionnelle des neurites. Les exemples incluent les formes triangulaires18, les structures barbeléesde canal 19 et les canaux effilés20. Ici, une conception comportant des barrières à angle vif sur les bords du microcanal est utilisée, caractérisée également par des entrées asymétriques. Ces microcanaux servent à établir une continuité entre un intérieur fermé, le compartiment Cible, et la zone externe, le compartiment Source. La forme en entonnoir de la partie initiale des microcanaux, du côté de la Source, est conçue pour favoriser la formation de faisceaux axonaux et leur croissance le long du chemin le plus court, c’est-à-dire en ligne droite, reliant la Source à la Cible. L’espace triangulaire réalisé en faisant face à des angles vifs a un volume plus important du côté de la cible pour viser à retarder efficacement la recherche de chemin des neurites tout en favorisant la prise de vue rapide des faisceaux provenant de la Source et l’occupation de l’espace disponible. Le choix de 540 μm pour la longueur des microcanaux filtre efficacement l’excroissance dendritique généralement plus courte39. De plus, leur hauteur de 5 μm empêche les somates cellulaires de pénétrer à travers les microcanaux. Dans l’ensemble, cette configuration s’est avérée favoriser la connectivité unidirectionnelle entre les modules Target externe et Target et elle est présentée ici comme une preuve de principe parmi les nombreux choix alternatifs.
Alors que les dispositifs PDMS, fabriqués par le moule 2PP, peuvent être fixés à la surface de substrats de culture cellulaire courants, tels que des lamelles de verre ou des boîtes de Pétri, dans ce travail, des réseaux de microélectrodes intégrés au substrat disponibles dans le commerce ont été utilisés. Aucun effort n’a été fait pour optimiser la conception 3D à la disposition du réseau de microélectrodes, et le couplage mécanique a été effectué sous guidage de stéréomicroscopie visant uniquement à positionner le dispositif sur le réseau, laissant une partie de la microélectrode découverte des deux côtés, la source et la cible. Cela permet d’évaluer de manière préliminaire les conséquences fonctionnelles de la connectivité contrainte dans les cultures de cellules neuronales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien qu’elle date de plusieurs décennies, l’application de la technologie 2PP dans le moulage de répliques à base de PDMS à l’échelle micrométrique est un développement récent43,44. Dans ce contexte, une série de points sont examinés ci-dessous pour aider les utilisateurs à reproduire efficacement ce travail.
Pour la conception d’un modèle 3D, assurez-vous que le modèle ne comporte pas de trous ou d’auto-intersections. Privilégiez le format de fichier binaire lors de l’enregistrement au format STL, pour sa taille de fichier plus petite que celle encodée en ASCII. Ceci est particulièrement avantageux pour les conceptions avec des géométries complexes et pour les objets de quelques millilitres de large. L’utilisation de fichiers STL binaires implique également une faible charge CPU, plus tard dans le processus de préparation de la pièce mécanique à imprimer en 3D. Les dimensions physiques des entités dans le fichier STL sont représentées en unités sans dimension. Lors du post-traitement du fichier STL, les unités sont interprétées comme des micromètres. Par conséquent, il est recommandé d’adopter dès le départ l’unité d’intérêt, c’est-à-dire le micromètre, lors de la préparation du fichier. La précision du modèle imprimé est déterminée par le nombre de surfaces se rapprochant des triangles tessellés. Pour un nombre insuffisant de surfaces, une rugosité de surface indésirable apparaîtra. Néanmoins, viser une précision trop élevée sur un très grand nombre de surfaces se fait au prix d’une charge de calcul élevée, ce qui ralentit le traitement des fichiers.
Pour l’impression 3D, pendant l’impression, l’objet physique 3D est formé à l’aide d’un balayage galvo rapide dans le plan x-y et d’un mouvement piézoélectrique dans la direction z. Cela focalise le faisceau laser femtoseconde dans un voxel 3D donné. Cependant, lorsque les structures d’impression sont plus grandes que les plages de couverture spatiale du galvo et du piézo, l’objet doit être divisé par programmation en blocs. Bien que cela soit une exigence pour les pièces imprimées de taille millimétrique, les jonctions entre les blocs sont associées à des lignes de couture (imparfaites). Une optimisation minutieuse du nombre de blocs et du placement des lignes de couture dans les directions x, y et z est cruciale pour éviter de perturber les caractéristiques géométriques critiques de l’objet final avec des lignes de couture. Des bulles peuvent se former à l’interface d’impression pour diverses raisons (par exemple, les impuretés et les inhomogénéités des substrats photorésines) et avoir un impact négatif sur la qualité et l’intégrité de la structure imprimée. De plus, une puissance laser plus élevée peut entraîner une augmentation de leur occurrence. La réduction de la puissance laser, à la couche la plus basse de la pièce imprimée, minimisera les risques de formation de bulles. Comme alternative à l’impression de la pièce entière en tant que structure solide, la méthode de la coque et de l’échafaudage peut être envisagée. Il s’agit d’imprimer uniquement la surface extérieure de la pièce (coque) ainsi que les éléments du prisme triangulaire à l’intérieur de celle-ci. Ces éléments sont séparés par des couches horizontales (échafaudage), retenant la résine non polymérisée dans de petites poches. Cette méthode réduit considérablement le temps d’impression, ce qui est particulièrement important pour les structures de taille millimétrique. Cependant, comme il reste de la résine non polymérisée, l’exposition aux UV post-impression est impérative pour assurer une stabilité mécanique totale, bien que cette étape doive être effectuée en douceur pour éviter toute déformation de la pièce imprimée. Le temps de post-polymérisation dépend de la résine choisie, de l’épaisseur de la pièce et de la puissance UV40. Pour des résultats optimaux, il est recommandé de mener un premier essai pour estimer le temps nécessaire au durcissement en profondeur, en utilisant une goutte de résine photosensible et en évaluant sa coupe en coupe, après une exposition aux UV. La période de durcissement habituelle varie entre 5 et 20 min.
Pour le moulage de répliques PDMS, la fabrication propre d’un dispositif PDMS avec des caractéristiques à l’échelle micrométrique, sans installations de salle blanche, peut être difficile : les microparticules en suspension dans l’air peuvent résider sur la surface hautement adhésive du PDMS et entraver l’étanchéité entre le dispositif et le substrat, ou bloquer la section des microcanaux individuels. L’exécution des étapes du protocole sous une hotte à flux laminaire et le blindage constant de la surface du PDMS avec de l’isopropanol minimisent considérablement les risques de contamination. La température de durcissement et sa durée affectent directement la réticulation PDMS et les propriétés physiques qui en résultent. En particulier, l’adhérence du PDMS durci est un facteur critique. D’une part, une étanchéité est nécessaire entre le dispositif PDMS et la surface utilisée pour la culture des cellules neuronales (par exemple, une lamelle en verre ou un MEA), pour restreindre efficacement le passage des neurites. D’autre part, le dispositif PDMS doit se fixer à la surface de manière réversible, afin que la délicate couche isolante MEA ne soit pas endommagée après le retrait de l’appareil. Bien que le rétrécissement du PDMS pendant le durcissement se produise et puisse être corrigé par un redimensionnement initial du moule, pour les températures et les intervalles de durcissement indiqués ici, le rétrécissement sera inférieur à 2 %42 et n’affectera pas de manière significative les dispositifs PDMS monocouches. Dans l’ensemble, suivez précisément les valeurs de température et de durée de durcissement recommandées, pour de meilleurs résultats.
Aperçu des avantages et des limites de la méthode
Une technique basée sur l’écriture laser directe à 2 photons est proposée pour la fabrication rapide de dispositifs polymères à micro-échelle pour l’étude expérimentale de réseaux de neurones modulaires. Contrairement à la photolithographie douce, l’approche proposée ne nécessite pas un haut niveau d’expertise technique, à condition qu’une configuration d’impression 3D 2PP fonctionnelle soit accessible et opérationnelle. Remarquablement, la méthode permet de passer d’un modèle 3D conçu par CAO à un dispositif PDMS fonctionnel en une seule journée, offrant ainsi un chemin direct et efficace du concept à la réalisation tangible. Plus précisément, opter pour le mode d’impression coque et échafaudage réduit considérablement le temps nécessaire à la création du moule, car seule une fraction de son volume est imprimée. Le durcissement UV ultérieur du composant imprimé garantit sa stabilité mécanique et sa robustesse, comme cela a été vérifié ici sur 50 cycles de coulée avec PDMS.
Par rapport aux méthodes traditionnelles, l’impression 3D 2PP présente un avantage évident, qui est le plus prononcé lorsqu’il s’agit de fabriquer des moules avec un rapport d’aspect important, des exigences de résolution exigeantes et des géométries tridimensionnelles complexes. La production de moules maîtres à l’aide de la lithographie UV standard est limitée par une épaisseur de réserve d’environ 200 μm. Des séquences complexes de cycles de revêtement et d’exposition par centrifugation35, des procédés coûteux de lithographie, de galvanoplastie et de moulage ou de gravure ionique réactive profonde (DRIE)36 sont nécessaires pour obtenir des rapports de hauteur et d’aspect plus élevés. En revanche, comme le démontrent les travaux pionniers de Kumi et al. en 201037, la technique 2PP offre un champ d’application pratiquement illimité pour le rapport d’aspect des pièces imprimées, allant du submicromètre au millimètre. Ici, le processus de microfabrication d’un moule avec une différence significative de hauteur de ses parties a été illustré, avec une distinction de plus de 100 fois entre la hauteur des microcanaux (5 μm) et la hauteur maximale du moule (545 μm ; voir Figure 2).
De plus, une résolution inférieure au micromètre pourrait être facilement atteinte en suivant les spécifications du protocole décrites. En comparaison, l’obtention de meilleures résolutions de moule grâce à la photolithographie UV nécessite un investissement en capital. Les masques avec la résolution la plus fine, utilisant le dépôt de chrome sur quartz à une résolution nominale de 600 nm, ont un prix plusieurs ordres de grandeur plus élevé que les masques transparents aériens imprimés au laser, qui possèdent une résolution de 250 μm35, mais voir les travaux de Pirlo et al.41. Pour être viable pour une utilisation en interne, une méthode choisie doit être rentable. Pour de nombreux laboratoires biologiques, le coût global associé à la photolithographie douce conventionnelle ou à l’écriture laser directe présente un obstacle. Bien qu’il soit possible de rendre les deux technologies plus accessibles en achetant et en assemblant les composants essentiels, cette approche nécessite une expertise supplémentaire et nécessite tout de même un investissement notable. Dans ce contexte, un point essentiel à considérer est le spectre plus large d’applications réalisables grâce à l’écriture laser directe. Contrairement à la photolithographie souple conventionnelle, principalement limitée à la microfabrication de moules, l’impression 3D 2PP présente une polyvalence remarquable. Ses applications potentielles vont de la microfluidique et de la micro-optique à la photonique et à la micromécanique intégrées. Cela rend l’investissement dans cette technologie attrayant en tant qu’installation partagée pour des domaines scientifiques multiples et diversifiés. Par exemple, la méthodologie basée sur le 2PP conçue dans ce protocole est le résultat d’une collaboration interdisciplinaire entre les départements de neurosciences et de mathématiques de notre institution. De plus, le développement de la résine photosensible est un domaine de recherche actif et peut potentiellement élargir la gamme d’applications de l’impression 3D 2PP. L’introduction récente de la résine IP-PDMS en est un bon exemple. En polymérisant en structures ayant des propriétés telles que le PDMS38, cette résine libère le potentiel de microfabrication directe de composants biocompatibles qui ont une surface alvéolée ou contiennent des espaces creux. Ces subtilités constituent des obstacles à l’obtention de résultats similaires grâce aux procédures conventionnelles de moulage de répliques.
En tant que démonstration de cette méthode, des preuves ont été fournies suggérant le développement d’une connectivité unidirectionnelle entre deux modules dans un réseau neuronal modulaire. Le moule à micro-échelle, fabriqué par la technique 2PP, avait suffisamment d’endurance pour subir plusieurs coulées PDMS et a la précision à micro-échelle requise. En conclusion, le champ d’application du protocole décrit dans cet ouvrage s’étend au-delà du cas illustré. L’accès à la technologie d’impression 2PP se généralisant de plus en plus, l’investissement initial requis pour sa mise en œuvre diminuera tandis que sa gamme d’applications potentielles s’élargira.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.G. remercie le soutien financier du programme-cadre H2020 de l’Union européenne par le biais du Conseil européen de l’innovation (projet IN-FET, GA N. 862882, projet Arbor-IO, FLAG-ERA et le projet Human Brain, ID 650003) et de SISSA (Neuroscience Area). G.N. remercie le ministère italien de l’Université et de la Recherche (MUR) de soutenir financièrement la subvention Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (Domaine des mathématiques). Nous remercions M. Gigante, B. Pastore et M. Grandolfo pour leur aide en matière d’impression 3D, de culture cellulaire et d’imagerie en direct, ainsi que les Drs P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente et H.C. Schultheiss pour leurs discussions. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
| BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). ————————————– Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
| CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-AP5 | Tocris | #0106 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
| Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
| in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
| NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
| Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
| Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
| Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |
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