Summary

Optik Koherens Elastografi Kullanılarak Çevresel Biyofilmlerin Elastik Özelliklerinin Ölçülmesi

Published: March 01, 2024
doi:

Summary

Bu makale, optik koherens elastografi (OCE) tekniğinin biyofilm elastik özelliklerini hızlı ve tahribatsız bir şekilde karakterize etmedeki etkinliğini vurgulamaktadır. Doğru ölçümler için kritik OCE uygulama prosedürlerini açıklıyoruz ve iki granüler biyofilm için Young modül değerlerini sunuyoruz.

Abstract

Biyofilmler, kendi ürettiği hücre dışı polimerik maddelerle (EPS) kaplı, iyi organize edilmiş bir mikrobiyal hücre ağı içeren karmaşık biyomalzemelerdir. Bu makale, biyofilmlerin elastik karakterizasyonu için uyarlanmış optik koherens elastografi (OCE) ölçümlerinin uygulanmasının ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır. OCE, kısmen saydam yumuşak malzemelerin mikro yapısının, morfolojisinin ve viskoelastik özelliklerinin yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle yerel olarak haritalanmasını sağlayan tahribatsız bir optik tekniktir. Bu tekniğin doğru uygulanması için gerekli prosedürleri detaylandıran kapsamlı bir kılavuzun yanı sıra, toplanan ölçümlerden granüler biyofilmlerin toplu Young modülünü tahmin etmek için bir metodoloji sunuyoruz. Bunlar sistem kurulumu, veri toplama ve son işlemden oluşur. Tartışmada, OCE’de kullanılan sensörlerin altında yatan fiziği inceliyoruz ve OCE ölçümlerinin uzamsal ve zamansal ölçekleriyle ilgili temel sınırlamaları keşfediyoruz. Çevresel biyofilmlerin elastik ölçümlerini kolaylaştırmak için OCE tekniğini ilerletmek için gelecekteki potansiyel yönlerle sonuçlandırıyoruz.

Introduction

Atık su arıtımında ve su kaynaklarının geri kazanılmasında, mikropların organik madde, nitrojen ve fosfat gibi istenmeyen kirleticileri sudan kolayca çıkarılabilen stabilize formlara dönüştürmesini sağlamak için bağlı büyüme reaktörlerindeki faydalı biyofilmler giderek daha fazla kullanılmaktadır1. Bu sistemlerde biyofilmin ortaya çıkan işlevi, yani biyokimyasal dönüşümler, içinde bulunan mikropların çeşitliliği ve bu mikropların aldığı besinlerle yakından ilişkilidir2. Buna göre, devam eden biyofilm büyümesi, tutarlı reaktör işlevselliğini sürdürmek için bir zorluk oluşturabilir, çünkü yeni biyofilm büyümesi biyofilmin genel metabolik süreçlerini, kütle transfer özelliklerini ve topluluk bileşimini değiştirebilir. Biyofilm ortamını mümkün olduğunca stabilize etmek, bu tür değişikliklere karşı koruma sağlayabilir3. Bu, tutarlı bir besin akışının sağlanmasını ve biyofilmin yapısının sabit bir kalınlıkla sabit tutulmasınıiçerir 4. Biyofilmin sertliğini ve fiziksel yapısını izlemek, araştırmacıların biyofilmin genel sağlığı ve işleyişi hakkında fikir edinmelerini sağlayacaktır.

Biyofilmler viskoelastik özellikler sergiler 5,6,7. Bu viskoelastik yapı, dış mekanik kuvvetlere yanıt olarak anlık ve yavaş, zamana bağlı bir deformasyonun bir kombinasyonu ile sonuçlanır. Biyofilmlerin benzersiz bir yönü, önemli deformasyona maruz kaldıklarında viskoz sıvılar gibi tepki vermeleridir. Tersine, küçük deformasyona maruz kaldıklarında, tepkileri katılarlakarşılaştırılabilir 5. Ayrıca, bu küçük deformasyon bölgesi içinde, biyofilmlerin doğrusal bir kuvvet-yer değiştirme ilişkisisergilediği bir deformasyon aralığı vardır 5,6,7. Bu doğrusal aralıktaki deformasyonlar, biyofilm mekanik özelliklerini değerlendirmek için idealdir, çünkü bunlar tekrarlanabilir ölçümler sağlar. Bu aralıktaki elastik tepkiyi birkaç teknik ölçebilir. Optik koherens elastografi (OCE), bu doğrusal aralıktaki (10-4-10-5 mertebesinde suşlar) biyofilmleri analiz etmek için uyarlanan yeni bir tekniktir8,9.

OCE’nin şimdiye kadarki en köklü uygulaması, tekniğin yalnızca yüzeysel optik erişim gerektiren biyolojik dokuları karakterize etmek için uygulandığı biyomedikal alandadır. Örneğin, Li ve ark. cilt dokusunun elastik özelliklerini karakterize etmek için OCE’yi kullandı10. Diğer yazarlar, domuz ve insan kornea dokularının anizotropik elastik özelliklerini ve göz içi basıncından nasıl etkilendiklerini karakterize ettiler 11,12,13,14,15,16. Biyofilmleri incelemek için OCE yönteminin bazı avantajları, tahribatsız olması ve orta ölçekli uzamsal çözünürlük sağlaması, herhangi bir numune hazırlığı gerektirmemesi ve yöntemin kendisinin hızlı olmasıdır; Fiziksel yapı ve elastik özelliklerin (örneğin, gözeneklilik, yüzey pürüzlülüğü ve morfoloji) ortak kayıtlı ölçümlerini sağlar8,9,17,18.

OCE yöntemi, faza duyarlı optik koherens tomografi (OCT) kullanarak bir numunede yayılan elastik dalgaların yerel yer değiştirmesini ölçer. OCT, numune yer değiştirmesindeki yerel değişiklikleri bir optik spektrometre ile kaydedilen bir yoğunluk değişikliğine dönüştüren düşük tutarlı bir optik interferometredir. OCT tekniği, biyofilm araştırmalarında mezoscale yapının, üç boyutta gözeneklilik dağılımının ve biyofilm deformasyonunun karakterizasyonu için de kullanılmıştır 17,19,20,21. Ek olarak, Picioreanu ve ark. OCT kesit deformasyon görüntülerinin akışkan-yapı etkileşimi ters modellemesini kullanarak biyofilm mekanik özelliklerini tahmin etti22.

Öte yandan, OCE ölçümleri, ters elastodinamik dalga modellemesi ile birleştiğinde, numunedeki elastik dalgaların dalga hızını verir, bu da numunenin elastik ve viskoelastik özelliklerinin karakterizasyonunu sağlar. Grubumuz, biyofilm elastik ve viskoelastik özelliklerin kantitatif ölçümü için OCE tekniğiniuyarladı 8,9,18 ve tekniği agaroz jel plaka numunelerinde kayma reometrisi ölçümlerine karşı doğruladı 18. OCE yaklaşımı, ölçülen elastik dalga hızı numunenin elastik özellikleri ile ilişkili olduğundan, biyofilm özelliklerinin kesin ve güvenilir tahminlerini sağlar. Ayrıca, elastik dalga genliğinin uzamsal bozunması, malzemedeki viskoz etkilerden dolayı viskoelastik özelliklerle doğrudan ilişkilendirilebilir. Dönen bir dairesel reaktörde (RAR) kuponlar üzerinde büyütülen karışık kültür bakteri biyofilmlerinin ve karmaşık geometrilere sahip granüler biyofilmlerin viskoelastik özelliklerinin OCE ölçümlerini elastodinamik dalga modelleri18 kullanarak rapor ettik.

OCE tekniği ayrıca viskoelastik karakterizasyon için kullanılan geleneksel reometri18’egüçlü bir alternatiftir. Reometri yöntemleri, düzlemsel geometriye sahip numuneler için en uygunudur. Bu nedenle, keyfi şekillere ve yüzey morfolojilerine sahip olan granüler biyofilmler, bir reometre 8,23 üzerinde doğru bir şekilde karakterize edilemez. Ek olarak, OCE’den farklı olarak, reometri yöntemlerinin, örneğin akış hücrelerindebiyofilm büyümesi sırasında gerçek zamanlı ölçümlere uyarlanması zor olabilir 24,25.

Bu yazıda, yüzey dalgalarının frekanstan bağımsız dalga hızının OCE ölçümlerinin, karmaşık modellere ihtiyaç duymadan biyofilm elastik özelliklerini karakterize etmek için kullanılabileceğini gösteriyoruz. Bu gelişme, OCE yaklaşımını, biyofilm mekanik özelliklerini incelemek için daha geniş biyofilm topluluğu için daha erişilebilir hale getirecektir.

Şekil 1 , bu çalışmada kullanılan OCT sisteminin şematik bir gösterimini göstermektedir. Sistem, ticari bir spektral alan faza duyarlı OCT sistemi, bir gecikme üreteci, bir fonksiyon üreteci ve bir piezoelektrik dönüştürücü dahil olmak üzere çeşitli enstrümanlar içerir. OCT sistemi, merkez dalga boyu 930 nm olan geniş bantlı bir ışık kaynağı kullanarak interferometri prensibine göre çalışır. Numunedeki karmaşık yapısal detaylarla ilişkilendirilen toplanan ışık yoğunluğu, son işlem ünitesinde analiz edilir ve daha sonra numunenin enine kesit görüntüsüne dönüştürülür – genellikle OCT görüntüsü olarak adlandırılır. OCT görüntüleme derinliği, kırılma indisindeki lokal varyasyondan kaynaklanan numunedeki optik saçılmanın şiddetine bağlıdır ve biyolojik dokularda ve biyofilmlerde 1-3 mm ile sınırlıdır. Numunedeki optik faz ve girişim yoğunluğu hareketle modüle edildiğinden, OCT yerel numune yer değiştirmesini tespit etmek için kullanılabilir. Numunedeki elastik dalgaların kararlı durum yer değiştirme alanını izlemek için OCE yönteminde OCT’nin yer değiştirme hassasiyetinden yararlanıyoruz. Spesifik olarak, fonksiyon üreteci, piezoelektrik dönüştürücüyü çalıştırmak için sinüzoidal bir voltaj verir. Dönüştürücü, sırayla, salınımlı bir zaman geçmişi ile gerilir ve büzülür. Dönüştürücünün salınımlı yer değiştirmesi, dönüştürücünün tepesindeki 3D baskılı bir kama ucu aracılığıyla numune yüzeyine sinüzoidal bir kuvvet verir ve numunede harmonik elastik dalgaların oluşmasına yol açar. Kama ucu, aktüatör numune yüzeyinden geri çekildikten sonra numunenin bozulmadan kalması için numune ile hafif temas sağlar. Numunedeki yerel yer değiştirmeyi kaydetmek için, numunedeki her pikselde sabit bir zaman gecikmesiyle ayrılmış bitişik derinlik taramaları elde edilir. Her piksel noktasındaki ardışık taramalar arasındaki optik faz farkı, aynı noktadaki yerel dikey yer değiştirme ile orantılıdır. OCT sistemindeki dönüştürücünün yer değiştirmesi ile tarama optikleri arasındaki senkronizasyon, fonksiyon üretecinden kaynaklanan ve gecikme üretecinde geciktirilen bir tetikleme darbesi ile sağlanır. Bu senkronizasyon adımı, numunedeki yerel optik faz dağılımının tutarlı kesit görüntülerinin elde edilmesini kolaylaştırır. Bu görüntüler, numunedeki yerel dikey harmonik yer değiştirme ile doğru orantılıdır ve OCE görüntüsü olarak bilinir. OCE görüntüleri, frekansın bir fonksiyonu olarak elastik dalga boyunu ve dalga hızını elde etmek için farklı dönüştürücü çalıştırma frekanslarında elde edilir. Ölçülen dalga hızları, numunenin elastik özelliklerini belirlemek için elastodinamik bir model ile analiz edilir.

Protocol

1. Sistem kurulumu Ticari OCT sistemini (ana ünite, stand, görüntüleme kafası ve bilgisayar), dalga formu üreteci, dönüştürücü, gecikme/darbe üreteci, BNC bağlantılı bir anahtar, BNC kabloları ve adaptörleri, optik direkler ve kelepçeleri içeren sistem bileşenlerini toplayın. İşlev oluşturucudan gelen senkronizasyon sinyalini bir anahtara bağlayın. Anahtarın diğer bağlantı noktasını gecikme üretecine bağlayın. Fonksiyon üretecinin çıkı…

Representative Results

Bu çalışmada, ticari olarak elde edilen granüler biyofilmler (granüler çamur olarak da bilinir) kullandık. Granüller, kendi kendine toplanma yoluyla oluşan küresel biyofilmlerdir, yani üzerinde büyümek için bir taşıyıcı veya yüzey gerektirmezler26. Şekil 3A , granüler bir biyofilmdeki yerel kırılma indisinin uzamsal varyasyonu nedeniyle ortaya çıkan temsili bir kesitsel OCT görüntüsünü göstermektedir. Biyofilmin nominal…

Discussion

OCT sisteminde ulaşılabilir görüntüleme derinliği, kaynağın dalga boyuna bağlı olarak ışık kaynağından gelen ışığın penetrasyon derecesi ile belirlenir. Ayrıca, dalga boyu eksenel çözünürlüğü belirler. Daha uzun dalga boyları numuneye daha derinden nüfuz edebilir, ancak daha kısa dalga boylarına kıyasla daha düşük eksenel çözünürlük pahasına. Öte yandan enine çözünürlük, hem sistemin sayısal açıklığına hem de dalga boyuna bağlıdır ve daha kısa dalga boyları daha …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, bu çalışmada incelenen granüler biyofilmleri sağladığı için Aqua-Aerobic Systems, Inc.’e (Rockford, IL, ABD) teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Ulusal Bilim Vakfı’nın #210047 ve #193729 Ödülü ile desteğini kabul ediyor.

Materials

3D printed sample holder
3D printed wedge tip 3 mm width
BNC cables Any brand
Delay generator Stanford Research Systems DG535 DG535 Digital delay/ Pulse Generator 
Function generator Agilent Technologies 33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator
Granular biofilm Aqua-Aerobic Systems Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.)
MATLAB MathWorks Release 2022a (MATLAB 9.12)
Piezoelectric transducer Thorlabs PK2JUP1 Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement
SD-OCT System Thorlabs Ganymede II, LSM03 scan lens
ThorImageOCT Thorlabs Version: 5.5.5

References

  1. Mahto, K. U., Das, S. Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the moving bed biofilm reactor for wastewater treatment: A review. Bioresour Technol. 345, 126476 (2022).
  2. Pholchan, M. K., Baptista, J. d. e. C., Davenport, R. J., Curtis, T. P. Systematic study of the effect of operating variables on reactor performance and microbial diversity in laboratory-scale activated sludge reactors. Water Res. 44 (5), 1341-1352 (2010).
  3. Briones, A., Raskin, L. Diversity and dynamics of microbial communities in engineered environments and their implications for process stability. Curr Opin in Biotechnol. 14 (3), 270-276 (2003).
  4. Sanchez-Huerta, C., Sanchez Medina, J., Wang, C., Fortunato, L., Hong, P. Understanding the role of sorption and biodegradation in the removal of organic micropollutants by membrane aerated biofilm reactor (MABR) with different biofilm thickness. Water Res. 236, 119935 (2023).
  5. Wang, H. F., Hu, H., Yang, H. Y., Zeng, R. J. Characterization of anaerobic granular sludge using a rheological approach. Water Res. 106, 116-125 (2016).
  6. Ma, Y. J., Xia, C. W., Yang, H. Y., Zeng, R. J. A rheological approach to analyze aerobic granular sludge. Water Res. 50, 171-178 (2014).
  7. Lin, X., Wang, Y. Microstructure of anammox granules and mechanisms endowing their intensity revealed by microscopic inspection and rheometry. Water Res. 120, 22-31 (2017).
  8. Liou, H. C., et al. Towards mechanical characterization of granular biofilms by optical coherence elastography measurements of circumferential elastic waves. Soft Matter. 15 (28), 5562-5573 (2019).
  9. Liou, H. C., Sabba, F., Wang, Z., Wells, G., Balogun, O. Layered viscoelastic properties of granular biofilms. Water Res. 202, 117394 (2021).
  10. Li, C., Guan, G., Reif, R., Huang, Z., Wang, R. K. Determining elastic properties of skin by measuring surface waves from an impulse mechanical stimulus using phase-sensitive optical coherence tomography. J R Soc Interface. 9, 831-841 (2012).
  11. Ramier, A., et al. In vivo measurement of shear modulus of the human cornea using optical coherence elastography. Sci Rep. 10, 17366 (2020).
  12. Ramier, A., Tavakol, B., Yin, S. H. Measuring mechanical wave speed, dispersion, and viscoelastic modulus of cornea using optical coherence elastography. Optics Express. 27 (12), 16635 (2019).
  13. Crespo, M. A., et al. In vivo determination of human corneal elastic modulus using vibrational optical coherence tomography. Cornea Ext Dis. 11 (7), 1-11 (2022).
  14. Ambrozinski, L., et al. Acoustic micro-tapping for non-contact 4D imaging of tissue elasticity. Sci Rep. 6 (38967), 1-11 (2016).
  15. Pitre, J. J., et al. Nearly-incompressible transverse isotropy (NITI) of cornea elasticity: model and experiments with acoustic micro-tapping OCE. Sci Rep. 10 (12983), 1-14 (2020).
  16. Lan, G., Aglyamov, S. R., Larin, K. V., Twa, M. D. In vivo human corneal shear wave optical coherence elastography. Optom Vis Sci. 98, 58-63 (2021).
  17. Rosenthal, A., et al. Morphological analysis of pore size and connectivity in a thick mixed-cultured biofilm. Biotechnol Bioeng. 115, 2268-2279 (2018).
  18. Liou, H. C., Sabba, F. I., Packman, A., Wells, G., Balogun, O. Nondestructive characterization of soft materials and biofilms by measurement of guided elastic wave propagation using optical coherence elastography. Soft Matter. 15, 575-586 (2019).
  19. Wagner, M., Taherzadeh, D., Haisch, C., Horn, H. Investigation of the mesoscale structure and volumetric features of biofilms using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 107 (5), 844-853 (2010).
  20. Leite-Andrade, M. C., et al. A new approach by optical coherence tomography for elucidating biofilm formation by emergent Candida species. PLoS ONE. 12 (11), e0188020 (2017).
  21. Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Time-resolved biofilm deformation measurements using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 112 (9), 1893-1905 (2015).
  22. Picioreanu, C., Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Determination of mechanical properties of biofilms by modeling the deformation measured using optical coherence tomography. Water Res. 145, 588-598 (2018).
  23. Li, M., Nahum, Y., Matouš, K., Stoodley, P., Nerenberg, R. Effects of biofilm heterogeneity on the apparent mechanical properties obtained by shear rheometry. Biotechnol Bioeng. 120, 553-561 (2023).
  24. Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
  25. Geisel, S., Secchi, E., Vermant, J. Experimental challenges in determining the rheological properties of bacterial biofilms. Interface Focus. 12 (6), 20220032 (2022).
  26. Winkler, M. K. H., van Loosdrecht, M. C. M. Intensifying existing urban wastewater. Science. 375 (6579), 377-378 (2022).
  27. Graff, K. F. . Wave motion in elastic solids. , (1991).
  28. Kennedy, B. F., Kennedy, K. M., Sampson, D. D. A review of optical coherence elastography: Fundamentals, techniques and prospects. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (2), 272-288 (2014).
  29. Ang, M., et al. Anterior segment optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 66, 132-156 (2018).
  30. Kirby, M. A., et al. Spatial resolution in dynamic optical coherence elastography. J Biomed Opt. 24 (9), 1-16 (2019).
  31. Larin, K. V., Sampson, D. D. Optical coherence elastography – OCT at work in tissue biomechanics. Biomed Opt Express. 8, 1172-1202 (2017).
  32. Muhammad, A., et al. Importance of species sorting and immigration on the bacterial assembly of different-sized aggregates in a full-scale aerobic granular sludge. Environ Sci Technol. 53 (14), 8291-8301 (2019).
  33. Candry, P., et al. Tailoring polyvinyl alcohol-sodium alginate (PVA-SA) hydrogel beads by controlling crosslinking pH and time. Sci Rep. 12 (1), 20822 (2022).
  34. Kirby, M. A., et al. Optical coherence elastography in ophthalmology. J Biomed Opt. 22 (12), 1-28 (2017).
  35. Liang, X., Boppart, S. A. Biomechanical properties of in vivo human skin from dynamic optical coherence elastography. IEEE Trans Biomed Eng. 57 (4), 953-959 (2010).

Play Video

Cite This Article
Dieppa, E., Schmitz, H., Wang, Z., Sabba, F., Wells, G., Balogun, O. Quantifying Elastic Properties of Environmental Biofilms using Optical Coherence Elastography. J. Vis. Exp. (205), e66118, doi:10.3791/66118 (2024).

View Video