光干渉エラストグラフィを用いた環境バイオフィルムの弾性特性の定量化

廃水処理や水資源回収では、微生物が有機物、窒素、リン酸塩などの望ましくない汚染物質^を水から容易に除去できる安定した形に変換できるようにするために、付着した成長反応器内の有益なバイオフィルムがますます採用されています1。これらの系では、バイオフィルムの創発機能、すなわち生化学的変換は、そこに生息する微生物の多様性と、これらの微生物が受け取る栄養素と密接に関連しています²。したがって、進行中のバイオフィルムの成長は、新しいバイオフィルムの成長がバイオフィルムの全体的な代謝プロセス、物質移動特性、およびコミュニティ組成を変化させる可能性があるため、一貫した反応器の機能を維持することに課題をもたらす可能性があります。バイオフィルムの環境を可能な限り安定させることで、^{このような変化を防ぐ}ことができます3。これには、栄養素の一貫した流れを確保し、バイオフィルムの構造を安定した厚さで安定させること^{が含まれます4。}バイオフィルムの剛性と物理的構造をモニタリングすることで、研究者はバイオフィルムの全体的な健康状態と機能に関する洞察を得ることができます。

バイオフィルムは粘弾性特性を示す^5,6,7。この粘弾性により、外部の機械的力に応答して、瞬間的な変形と遅い時間依存の変形が組み合わされます。バイオフィルムのユニークな点の1つは、大きな変形を受けると、粘性のある液体のように反応することです。逆に、微小な変形を受けると、その応答は固体⁵に匹敵します。また、この小変形領域内には、バイオフィルムが直線的な力変^{位関係を示す}変形範囲がある^5,6,7。この線形範囲内の変形は、再現性のある測定が得られるため、バイオフィルムの機械的特性を評価するのに最適です。いくつかの手法は、この範囲内の弾性応答を定量化できます。光干渉エラストグラフィ(OCE)は、この線形範囲(10-4-10-5オーダーのひずみ)のバイオフィルムの分析に適応している新しい技術です^8,9。

OCEのこれまでで最も確立された用途は生物医学分野で、表面的な光アクセスのみを必要とする生体組織の特性評価にこの技術が適用されています。例えば、Liらは、皮膚組織の弾性特性を特徴付けるためにOCEを用いた¹⁰。他の著者は、ブタとヒトの角膜組織の異方性弾性特性と、それらが眼圧によってどのように影響を受けるかを特徴付けました^{11、12、13、14、15、16}。バイオフィルムを研究するためのOCE法のいくつかの利点は、非破壊でメソスケールの空間分解能を提供すること、サンプル調製を必要としないこと、および方法自体が迅速であることです。物理的構造と弾性特性(多孔性、表面粗さ、形態など)の同時登録測定を提供します^8,9,17,18。

OCE法は、位相感応型光干渉断層撮影法(OCT)を用いて、試料内を伝搬する弾性波の局所変位を測定します。OCTは、サンプルの変位の局所的な変化を、光分光計で記録される強度変化に変換する低コヒーレンス光干渉計です。OCT技術は、メソスケール構造、3次元の空隙率分布、およびバイオフィルムの変形の特性評価のためのバイオフィルム研究にも利用されています^{17、19、20、21}。さらに、Picioreanuらは、OCT断面変形画像の流体-構造連成逆モデリングを用いてバイオフィルムの力学的特性を推定した²²。

一方、OCE測定は、逆弾性波モデリングと組み合わせることで、サンプル内の弾性波の波速が得られ、サンプルの弾性および粘弾性特性の特性評価が可能になります。私たちのグループは、バイオフィルムの弾性および粘弾性特性の定量的測定にOCE技術を採用し^8,9,18、アガロースゲルプレートサンプルのせん断レオメトリー測定に対してこの技術を検証しました¹⁸。OCEアプローチでは、測定された弾性波速度がサンプルの弾性特性と相関しているため、バイオフィルム特性を正確かつ確実に推定できます。さらに、弾性波振幅の空間的減衰は、材料の粘性効果による粘弾性特性と直接相関させることができます。我々は、回転環状反応器(RAR)のクーポン上に増殖した混合培養細菌バイオフィルムと、弾力波モデルを用いた複雑な形状の粒状バイオフィルムの粘弾性特性のOCE測定を報告した¹⁸。

OCE技術は、粘弾性特性評価に使用される従来のレオメ^トリー18の強力な代替手段でもあります。レオメトリー法は、平面形状のサンプルに最適です。そのため、任意の形状および表面形態を有する粒状バイオフィルムは、^{レオメータ8,23}上で正確に特性評価することができない。加えて、OCEとは異なり、レオメトリー法は、例えば、フローセル^24,25におけるバイオフィルム成長中のリアルタイム測定に適応することが困難な場合がある。

本論文では、表面波の周波数に依存しない波速をOCEで測定することで、複雑なモデルを必要とせずにバイオフィルムの弾性特性を評価できることを示しました。この開発により、バイオフィルムの機械的特性を研究するために、より広範なバイオフィルムコミュニティがOCEアプローチをより利用しやすくなります。

図1 に、本研究で用いたOCTシステムの概略図を示します。このシステムには、市販のスペクトル領域位相感応型OCTシステム、遅延発生器、関数発生器、圧電トランスデューサなど、いくつかの機器が組み込まれています。OCTシステムは、中心波長930nmの広帯域光源を採用することにより、干渉法の原理で動作します。採取された光強度は、サンプルの複雑な構造の詳細と相関しており、後処理ユニットで分析され、一般にOCT画像と呼ばれるサンプルの断面画像に変換されます。OCTイメージングの深さは、屈折率の局所的な変動に起因するサンプル内の光散乱の重症度に依存し、生体組織およびバイオフィルムでは1〜3 mmに制限されます。試料中の光位相や干渉強度は動きによって変調されるため、OCTを用いて試料の局所的な変位を検出することができます。OCE法におけるOCTの変位感度を利用して、試料中の弾性波の定常変位場を追跡します。具体的には、関数発生器は正弦波電圧を出力して圧電トランスデューサを駆動する。次に、トランスデューサは振動する時刻歴で伸縮します。探触子の振動変位は、探触子の頂点にある3Dプリントされたくさびの先端を介して試料表面に正弦波の力を与え、試料に高調波弾性波を発生させます。ウェッジチップはサンプルと軽く接触するため、アクチュエータがサンプル表面から引き抜かれた後もサンプルは無傷のままになります。サンプルの局所的な変位を記録するために、一定の時間遅延で区切られた隣接する深度スキャンがサンプルの各ピクセルで取得されます。各ピクセルポイントでの連続スキャン間の光学的位相差は、同じポイントでの局所的な垂直変位に比例します。OCTシステムにおけるトランスデューサと走査光学系の変位間の同期は、関数発生器から発信され、遅延発生器で遅延されるトリガーパルスによって達成されます。この同期ステップにより、サンプル中の局所的な光位相分布の一貫した断面画像の取得が容易になります。これらの画像は、サンプル内の局所的な垂直高調波変位に正比例し、OCE画像として知られています。OCE画像は、異なるトランスデューサ作動周波数で取得され、周波数の関数として弾性波長と波速を取得します。測定された波速は弾力学的モデルで分析され、サンプルの弾性特性が決定されます。