القياس الكمي للخصائص المرنة للأغشية الحيوية البيئية باستخدام التصوير الإلستوجرافي للتماسك البصري
Summary
يسلط هذا البحث الضوء على فعالية تقنية التصوير الإلستوجرافي للتماسك البصري (OCE) في توصيف خصائص مرونة الأغشية الحيوية الرقيقة بسرعة ودون تدمير. نوضح إجراءات تنفيذ OCE الهامة لإجراء قياسات دقيقة ونقدم قيم معامل Young لاثنين من الأغشية الحيوية الحبيبية.
Abstract
الأغشية الحيوية هي مواد حيوية معقدة تضم شبكة جيدة التنظيم من الخلايا الميكروبية المغلفة بمواد بوليمرية خارج الخلية منتجة ذاتيا (EPS). تقدم هذه الورقة وصفا مفصلا لتنفيذ قياسات التصوير الإلستوجرافي للتماسك البصري (OCE) المصممة خصيصا للتوصيف المرن للأغشية الحيوية. OCE هي تقنية بصرية غير مدمرة تتيح رسم الخرائط المحلية للبنية المجهرية والتشكل والخصائص اللزجة المرنة للمواد اللينة الشفافة جزئيا بدقة مكانية وزمانية عالية. نحن نقدم دليلا شاملا يوضح بالتفصيل الإجراءات الأساسية للتنفيذ الصحيح لهذه التقنية ، إلى جانب منهجية لتقدير معامل يونغ الأكبر للأغشية الحيوية الحبيبية من القياسات التي تم جمعها. تتكون هذه من إعداد النظام والحصول على البيانات والمعالجة اللاحقة. في المناقشة ، نتعمق في الفيزياء الأساسية لأجهزة الاستشعار المستخدمة في OCE ونستكشف القيود الأساسية فيما يتعلق بالمقاييس المكانية والزمانية لقياسات OCE. نختتم بالاتجاهات المستقبلية المحتملة لتطوير تقنية OCE لتسهيل القياسات المرنة للأغشية الحيوية البيئية.
Introduction
في معالجة مياه الصرف الصحي واستعادة الموارد المائية ، يتم استخدام الأغشية الحيوية المفيدة في مفاعلات النمو المرفقة بشكل متزايد لتمكين الميكروبات من تحويل الملوثات غير المرغوب فيها ، مثل المواد العضوية والنيتروجين والفوسفات ، إلى أشكال مستقرة يمكن إزالتها بسهولة من الماء1. في هذه الأنظمة ، ترتبط الوظيفة الناشئة للغشاء الحيوي ، أي التحولات الكيميائية الحيوية ، ارتباطا وثيقا بتنوع الميكروبات الموجودة فيه والعناصر الغذائية التي تتلقاها هذه الميكروبات2. وبناء على ذلك، يمكن أن يشكل النمو المستمر للأغشية الحيوية تحديا للحفاظ على وظائف متسقة للمفاعل لأن نمو الأغشية الحيوية الجديدة قد يغير عمليات التمثيل الغذائي الشاملة للغشاء الحيوي، وخصائص نقل الكتلة، وتكوين المجتمع. إن استقرار بيئة الأغشية الحيوية قدر الإمكان يمكن أن يحمي من مثل هذه التغييرات3. ويشمل ذلك ضمان تدفق ثابت للمغذيات والحفاظ على استقرار بنية الغشاء الحيوي بسمك ثابت4. إن مراقبة صلابة الأغشية الحيوية وبنيتها الفيزيائية ستمكن الباحثين من اكتساب نظرة ثاقبة للصحة العامة وعمل الغشاء الحيوي.
تظهر الأغشية الحيوية خصائص لزجة مرنة5،6،7. ينتج عن هذه الطبيعة اللزجة المرنة مزيج من التشوه الفوري والبطيء المعتمد على الوقت استجابة للقوى الميكانيكية الخارجية. أحد الجوانب الفريدة للأغشية الحيوية هو أنها عندما تتعرض لتشوه كبير ، فإنها تستجيب مثل السوائل اللزجة. على العكس من ذلك ، عندما تتعرض لتشوه طفيف ، تكون استجابتها قابلة للمقارنة مع المواد الصلبة5. علاوة على ذلك ، داخل منطقة التشوه الصغيرة هذه ، يوجد نطاق تشوه تظهر تحته الأغشية الحيوية علاقة خطية بين القوة والإزاحة5،6،7. تعتبر التشوهات داخل هذا النطاق الخطي مثالية لتقييم الخصائص الميكانيكية للغشاء الحيوي لأن هذه القياسات قابلة للتكرار. يمكن للعديد من التقنيات تحديد الاستجابة المرنة ضمن هذا النطاق. التصوير الإلستوجرافي للتماسك البصري (OCE) هو تقنية ناشئة يتم تكييفها لتحليل الأغشية الحيوية في هذا النطاق الخطي (سلالات بترتيب 10-4-10-5)8,9.
التطبيق الأكثر رسوخا ل OCE حتى الآن هو في المجال الطبي الحيوي ، حيث تم تطبيق التقنية لتوصيف الأنسجة البيولوجية التي تتطلب فقط الوصول البصري السطحي. على سبيل المثال ، استخدم Li et al. OCE لتوصيف الخصائص المرنة لأنسجة الجلد10. وصف مؤلفون آخرون الخصائص المرنة متباينة الخواص لأنسجة القرنية الخنازير والبشرية وكيف تتأثر بضغط العين11،12،13،14،15،16. بعض مزايا طريقة OCE لدراسة الأغشية الحيوية هي أنها غير مدمرة وتوفر دقة مكانية متوسطة الحجم ، ولا تتطلب أي تحضير للعينة ، والطريقة نفسها سريعة ؛ يوفر قياسات مسجلة بشكل مشترك للهيكل الفيزيائي وخصائص المرونة (على سبيل المثال ، المسامية وخشونة السطح والتشكل)8،9،17،18.
تقيس طريقة OCE الإزاحة المحلية لنشر الموجات المرنة في عينة باستخدام التصوير المقطعي للتماسك البصري الحساس للطور (OCT). OCT هو مقياس تداخل بصري منخفض التماسك يحول التغيرات المحلية في إزاحة العينة إلى تغيير شدة يتم تسجيله باستخدام مطياف ضوئي. كما تم استخدام تقنية OCT في أبحاث الأغشية الحيوية لتوصيف بنية متوسطة الحجم ، وتوزيع المسامية في ثلاثة أبعاد ، وتشوه الأغشية الحيوية17،19،20،21. بالإضافة إلى ذلك ، قام Picioreanu et al. بتقدير الخواص الميكانيكية للغشاء الحيوي باستخدام النمذجة العكسية لتفاعل بنية السوائل لصور تشوه المقطع العرضي OCT22.
من ناحية أخرى ، فإن قياسات OCE ، إلى جانب نمذجة الموجات المرنة العكسية ، تسفر عن سرعة موجة الموجات المرنة في العينة ، والتي تمكن من توصيف الخصائص المرنة واللزجة للعينة. قامت مجموعتنا بتكييف تقنية OCE للقياس الكمي لخصائص مرونة الأغشية الحيوية والمرونةاللزجة 8،9،18 والتحقق من صحة التقنية مقابل قياسات قياس ريومترية القص في عينات ألواح هلام الأغاروز18. يوفر نهج OCE تقديرات دقيقة وموثوقة لخصائص الأغشية الحيوية نظرا لأن سرعة الموجة المرنة المقاسة مرتبطة بالخصائص المرنة للعينة. علاوة على ذلك ، يمكن ربط الاضمحلال المكاني لسعة الموجة المرنة ارتباطا مباشرا بالخصائص اللزجة المرنة بسبب التأثيرات اللزجة في المادة. لقد أبلغنا عن قياسات OCE للخصائص اللزجة المرنة للأغشية الحيوية البكتيرية المختلطة المزروعة على كوبونات في مفاعل حلقي دوار (RAR) والأغشية الحيوية الحبيبية ذات الأشكال الهندسية المعقدة باستخدام نماذج الموجات المرنة18.
تعد تقنية OCE أيضا بديلا قويا لقياس الريومترية التقليدية18والتي تستخدم للتوصيف اللزج المرن. طرق قياس الروماتيروس هي الأنسب للعينات ذات الهندسة المستوية. على هذا النحو ، لا يمكن تمييز الأغشية الحيوية الحبيبية ، التي لها أشكال تعسفية وأشكال سطحية ، بدقة على مقياس ريومتر 8,23. بالإضافة إلى ذلك ، على عكس OCE ، قد يكون من الصعب التكيف مع طرق قياس الريومتر للقياسات في الوقت الفعلي ، على سبيل المثال ، أثناء نمو الأغشية الحيوية في خلايا التدفق24,25.
في هذا البحث ، نوضح أنه يمكن استخدام قياسات OCE لسرعة الموجة المستقلة عن التردد للموجات السطحية لتوصيف خصائص مرونة الأغشية الحيوية دون الحاجة إلى نماذج معقدة. سيجعل هذا التطور نهج OCE في متناول مجتمع الأغشية الحيوية الأوسع لدراسة الخواص الميكانيكية للأغشية الحيوية.
يوضح الشكل 1 توضيحا تخطيطيا لنظام OCT المستخدم في هذه الدراسة. يشتمل النظام على العديد من الأدوات ، بما في ذلك نظام OCT التجاري الحساس للطور الطيفي ، ومولد التأخير ، ومولد الوظائف ، ومحول الطاقة الكهرضغطية. يعمل نظام OCT على مبدأ قياس التداخل من خلال استخدام مصدر ضوء عريض النطاق بطول موجي مركزي يبلغ 930 نانومتر. يتم تحليل شدة الضوء المجمعة ، والتي ترتبط بالتفاصيل الهيكلية المعقدة في العينة ، في وحدة المعالجة اللاحقة ثم تحويلها إلى صورة مقطعية للعينة – يشار إليها عادة باسم صورة OCT. يعتمد عمق التصوير المقطعي المحوسب على شدة التشتت البصري في العينة التي تنبع من التباين المحلي في معامل الانكسار ويقتصر على 1-3 مم في الأنسجة البيولوجية والأغشية الحيوية. نظرا لأن الطور البصري في العينة وشدة التداخل يتم تشكيلهما بواسطة الحركة ، يمكن استخدام OCT للكشف عن إزاحة العينة المحلية. نحن نستفيد من حساسية الإزاحة ل OCT في طريقة OCE لتتبع مجال إزاحة الحالة المستقرة للموجات المرنة في العينة. على وجه التحديد ، يقوم مولد الوظيفة بإخراج جهد جيبي لتشغيل محول الطاقة الكهرضغطية. محول الطاقة ، بدوره ، يمتد ويتقلص مع تاريخ زمني تذبذبي. يضفي الإزاحة التذبذبية لمحول الطاقة قوة جيبية على سطح العينة من خلال طرف إسفين مطبوع 3D في قمة محول الطاقة ، مما يؤدي إلى توليد موجات مرنة توافقية في العينة. يتلامس طرف الإسفين مع العينة بالضوء ، بحيث تظل العينة سليمة بعد سحب المشغل من سطح العينة. لتسجيل الإزاحة المحلية في العينة، يتم الحصول على عمليات مسح العمق المجاورة المفصولة بتأخير زمني ثابت عند كل بكسل في العينة. يتناسب فرق الطور البصري بين عمليات المسح المتتالية عند كل نقطة بكسل مع الإزاحة الرأسية المحلية عند نفس النقطة. يتم تحقيق التزامن بين إزاحة محول الطاقة وبصريات المسح في نظام OCT من خلال نبضة الزناد التي تنشأ من مولد الوظائف وتتأخر في مولد التأخير. تسهل خطوة التزامن هذه الحصول على صور مقطعية متسقة لتوزيع الطور البصري المحلي في العينة. تتناسب هذه الصور طرديا مع الإزاحة التوافقية الرأسية المحلية في العينة وتعرف باسم صورة OCE. يتم الحصول على صور OCE بترددات تشغيل محول طاقة مختلفة للحصول على الطول الموجي المرن وسرعة الموجة كدالة للتردد. يتم تحليل سرعات الموجة المقاسة باستخدام نموذج ديناميكي مرن لتحديد الخصائص المرنة للعينة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تحديد عمق التصوير الذي يمكن تحقيقه في نظام OCT من خلال درجة تغلغل الضوء من مصدر الضوء ، والذي يعتمد على الطول الموجي للمصدر. علاوة على ذلك ، يحدد الطول الموجي الدقة المحورية. يمكن للأطوال الموجية الأطول أن تخترق العينة بعمق أكبر ولكن على حساب الدقة المحورية المنخفضة مقارنة بالأطوال المو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون شركة Aqua-Aerobic Systems، Inc. (روكفورد ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية) على توفير الأغشية الحيوية الحبيبية التي تمت دراستها في هذا العمل. يعترف المؤلفون أيضا بدعم المؤسسة الوطنية للعلوم من خلال جائزة #210047 و #193729.
Materials
| 3D printed sample holder | |||
| 3D printed wedge tip | 3 mm width | ||
| BNC cables | Any brand | ||
| Delay generator | Stanford Research Systems | DG535 | DG535 Digital delay/ Pulse Generator |
| Function generator | Agilent Technologies | 33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator | |
| Granular biofilm | Aqua-Aerobic Systems | Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.) | |
| MATLAB | MathWorks | Release 2022a (MATLAB 9.12) | |
| Piezoelectric transducer | Thorlabs | PK2JUP1 | Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement |
| SD-OCT System | Thorlabs | Ganymede II, LSM03 scan lens | |
| ThorImageOCT | Thorlabs | Version: 5.5.5 |
References
- Mahto, K. U., Das, S. Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the moving bed biofilm reactor for wastewater treatment: A review. Bioresour Technol. 345, 126476 (2022).
- Pholchan, M. K., Baptista, J. d. e. C., Davenport, R. J., Curtis, T. P. Systematic study of the effect of operating variables on reactor performance and microbial diversity in laboratory-scale activated sludge reactors. Water Res. 44 (5), 1341-1352 (2010).
- Briones, A., Raskin, L. Diversity and dynamics of microbial communities in engineered environments and their implications for process stability. Curr Opin in Biotechnol. 14 (3), 270-276 (2003).
- Sanchez-Huerta, C., Sanchez Medina, J., Wang, C., Fortunato, L., Hong, P. Understanding the role of sorption and biodegradation in the removal of organic micropollutants by membrane aerated biofilm reactor (MABR) with different biofilm thickness. Water Res. 236, 119935 (2023).
- Wang, H. F., Hu, H., Yang, H. Y., Zeng, R. J. Characterization of anaerobic granular sludge using a rheological approach. Water Res. 106, 116-125 (2016).
- Ma, Y. J., Xia, C. W., Yang, H. Y., Zeng, R. J. A rheological approach to analyze aerobic granular sludge. Water Res. 50, 171-178 (2014).
- Lin, X., Wang, Y. Microstructure of anammox granules and mechanisms endowing their intensity revealed by microscopic inspection and rheometry. Water Res. 120, 22-31 (2017).
- Liou, H. C., et al. Towards mechanical characterization of granular biofilms by optical coherence elastography measurements of circumferential elastic waves. Soft Matter. 15 (28), 5562-5573 (2019).
- Liou, H. C., Sabba, F., Wang, Z., Wells, G., Balogun, O. Layered viscoelastic properties of granular biofilms. Water Res. 202, 117394 (2021).
- Li, C., Guan, G., Reif, R., Huang, Z., Wang, R. K. Determining elastic properties of skin by measuring surface waves from an impulse mechanical stimulus using phase-sensitive optical coherence tomography. J R Soc Interface. 9, 831-841 (2012).
- Ramier, A., et al. In vivo measurement of shear modulus of the human cornea using optical coherence elastography. Sci Rep. 10, 17366 (2020).
- Ramier, A., Tavakol, B., Yin, S. H. Measuring mechanical wave speed, dispersion, and viscoelastic modulus of cornea using optical coherence elastography. Optics Express. 27 (12), 16635 (2019).
- Crespo, M. A., et al. In vivo determination of human corneal elastic modulus using vibrational optical coherence tomography. Cornea Ext Dis. 11 (7), 1-11 (2022).
- Ambrozinski, L., et al. Acoustic micro-tapping for non-contact 4D imaging of tissue elasticity. Sci Rep. 6 (38967), 1-11 (2016).
- Pitre, J. J., et al. Nearly-incompressible transverse isotropy (NITI) of cornea elasticity: model and experiments with acoustic micro-tapping OCE. Sci Rep. 10 (12983), 1-14 (2020).
- Lan, G., Aglyamov, S. R., Larin, K. V., Twa, M. D. In vivo human corneal shear wave optical coherence elastography. Optom Vis Sci. 98, 58-63 (2021).
- Rosenthal, A., et al. Morphological analysis of pore size and connectivity in a thick mixed-cultured biofilm. Biotechnol Bioeng. 115, 2268-2279 (2018).
- Liou, H. C., Sabba, F. I., Packman, A., Wells, G., Balogun, O. Nondestructive characterization of soft materials and biofilms by measurement of guided elastic wave propagation using optical coherence elastography. Soft Matter. 15, 575-586 (2019).
- Wagner, M., Taherzadeh, D., Haisch, C., Horn, H. Investigation of the mesoscale structure and volumetric features of biofilms using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 107 (5), 844-853 (2010).
- Leite-Andrade, M. C., et al. A new approach by optical coherence tomography for elucidating biofilm formation by emergent Candida species. PLoS ONE. 12 (11), e0188020 (2017).
- Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Time-resolved biofilm deformation measurements using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 112 (9), 1893-1905 (2015).
- Picioreanu, C., Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Determination of mechanical properties of biofilms by modeling the deformation measured using optical coherence tomography. Water Res. 145, 588-598 (2018).
- Li, M., Nahum, Y., Matouš, K., Stoodley, P., Nerenberg, R. Effects of biofilm heterogeneity on the apparent mechanical properties obtained by shear rheometry. Biotechnol Bioeng. 120, 553-561 (2023).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Geisel, S., Secchi, E., Vermant, J. Experimental challenges in determining the rheological properties of bacterial biofilms. Interface Focus. 12 (6), 20220032 (2022).
- Winkler, M. K. H., van Loosdrecht, M. C. M. Intensifying existing urban wastewater. Science. 375 (6579), 377-378 (2022).
- Graff, K. F. . Wave motion in elastic solids. , (1991).
- Kennedy, B. F., Kennedy, K. M., Sampson, D. D. A review of optical coherence elastography: Fundamentals, techniques and prospects. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (2), 272-288 (2014).
- Ang, M., et al. Anterior segment optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 66, 132-156 (2018).
- Kirby, M. A., et al. Spatial resolution in dynamic optical coherence elastography. J Biomed Opt. 24 (9), 1-16 (2019).
- Larin, K. V., Sampson, D. D. Optical coherence elastography – OCT at work in tissue biomechanics. Biomed Opt Express. 8, 1172-1202 (2017).
- Muhammad, A., et al. Importance of species sorting and immigration on the bacterial assembly of different-sized aggregates in a full-scale aerobic granular sludge. Environ Sci Technol. 53 (14), 8291-8301 (2019).
- Candry, P., et al. Tailoring polyvinyl alcohol-sodium alginate (PVA-SA) hydrogel beads by controlling crosslinking pH and time. Sci Rep. 12 (1), 20822 (2022).
- Kirby, M. A., et al. Optical coherence elastography in ophthalmology. J Biomed Opt. 22 (12), 1-28 (2017).
- Liang, X., Boppart, S. A. Biomechanical properties of in vivo human skin from dynamic optical coherence elastography. IEEE Trans Biomed Eng. 57 (4), 953-959 (2010).
