Summary

Quantificação das Propriedades Elásticas de Biofilmes Ambientais utilizando Elastografia de Coerência Óptica

Published: March 01, 2024
doi:

Summary

Este trabalho destaca a eficácia da técnica de elastografia de coerência óptica (OCE) na caracterização rápida e não destrutiva das propriedades elásticas do biofilme. Nós elucidamos procedimentos críticos de implementação de OCE para medições precisas e apresentamos os valores do módulo de Young para dois biofilmes granulares.

Abstract

Biofilmes são biomateriais complexos que compreendem uma rede bem organizada de células microbianas envoltas em substâncias poliméricas extracelulares (EPS) autoproduzidas. Este trabalho apresenta um relato detalhado da implementação de medidas de elastografia de coerência óptica (ECO) adaptadas para a caracterização elástica de biofilmes. OCE é uma técnica óptica não destrutiva que permite o mapeamento local da microestrutura, morfologia e propriedades viscoelásticas de materiais moles parcialmente transparentes com alta resolução espacial e temporal. Nós fornecemos um guia abrangente detalhando os procedimentos essenciais para a implementação correta desta técnica, juntamente com uma metodologia para estimar o módulo de elasticidade de biofilmes granulares a partir das medidas coletadas. Estes consistem na configuração do sistema, aquisição de dados e pós-processamento. Na discussão, nos aprofundamos na física subjacente dos sensores usados na OCE e exploramos as limitações fundamentais em relação às escalas espaciais e temporais das medições da OCE. Concluímos com possíveis direções futuras para o avanço da técnica OCE para facilitar as medidas elásticas de biofilmes ambientais.

Introduction

No tratamento de águas residuais e na recuperação de recursos hídricos, biofilmes benéficos em reatores de crescimento acoplados são cada vez mais empregados para permitir que micróbios convertam poluentes indesejáveis, como matéria orgânica, nitrogênio e fosfato, em formas estabilizadas que podem ser facilmente removidas da água1. Nesses sistemas, a função emergente do biofilme, ou seja, as transformações bioquímicas, está intimamente associada à diversidade de micróbios que nele residem e aos nutrientes que esses micróbios recebem2. Assim, o crescimento contínuo do biofilme pode representar um desafio para manter a funcionalidade consistente do reator, pois o crescimento do novo biofilme pode alterar os processos metabólicos gerais do biofilme, as características de transferência de massa e a composição da comunidade. Estabilizar ao máximo o ambiente do biofilme pode proteger contra tais alterações3. Isso inclui garantir um fluxo consistente de nutrientes e manter a estrutura do biofilme estável com uma espessura constante4. O monitoramento da rigidez e da estrutura física do biofilme permitiria que os pesquisadores obtivessem informações sobre a saúde geral e o funcionamento do biofilme.

Os biofilmes apresentam propriedades viscoelásticas 5,6,7. Essa natureza viscoelástica resulta em uma combinação de uma deformação instantânea e lenta, dependente do tempo, em resposta a forças mecânicas externas. Um aspecto único dos biofilmes é que, quando submetidos a deformações substanciais, respondem como líquidos viscosos. Por outro lado, quando submetidos a pequenas deformações, sua resposta é comparável aos sólidos5. Além disso, dentro dessa pequena região de deformação, existe uma faixa de deformação sob a qual os biofilmes exibem uma relação linear força-deslocamento 5,6,7. Deformações dentro dessa faixa linear são ótimas para avaliar as características mecânicas do biofilme, pois produzem medidas reprodutíveis. Várias técnicas podem quantificar a resposta elástica dentro dessa faixa. A elastografia de coerência óptica (ECO) é uma técnica emergente que está sendo adaptada para a análise de biofilmes nessa faixa linear (deformações da ordem de 10-4-10-5)8,9.

A aplicação mais estabelecida da OCE até agora é na área biomédica, onde a técnica tem sido aplicada para caracterizar tecidos biológicos que requerem apenas acesso óptico superficial. Por exemplo, Li e col. utilizaram a OCE para caracterizar as propriedades elásticas do tecido cutâneo10. Outros autores caracterizaram as propriedades elásticas anisotrópicas dos tecidos corneanos suínos e humanos e como eles são afetados pela pressão intraocular 11,12,13,14,15,16. Algumas vantagens do método OCE para o estudo de biofilmes são que ele não é destrutivo e fornece resolução espacial de mesoescala, não requer nenhum preparo de amostra e o método em si é rápido; Ele fornece medidas co-registradas da estrutura física e propriedades elásticas (por exemplo, porosidade, rugosidade superficial e morfologia)8,9,17,18.

O método OCE mede o deslocamento local de propagação de ondas elásticas em um espécime usando tomografia de coerência óptica (OCT) sensível à fase. OCT é um interferômetro óptico de baixa coerência que transforma mudanças locais no deslocamento da amostra em uma mudança de intensidade que é registrada com um espectrômetro óptico. A técnica de OCT também tem sido utilizada em pesquisas de biofilmes para caracterização da estrutura de mesoescala, distribuição de porosidade em três dimensões e deformação do biofilme17,19,20,21. Além disso, Picioreanu e col. estimaram propriedades mecânicas do biofilme usando a modelagem inversa da interação fluido-estrutura de imagens de deformação transversal da OCT22.

Por outro lado, as medidas de OCE, juntamente com a modelagem de onda elastodinâmica inversa, fornecem a velocidade de onda das ondas elásticas na amostra, o que permite a caracterização das propriedades elásticas e viscoelásticas da amostra. Nosso grupo adaptou a técnica OCE para mensuração quantitativa das propriedades elásticas e viscoelásticas do biofilme 8,9,18 e validou a técnica contra medidas de reometria de cisalhamento em amostras de placa gel de agarose18. A abordagem OCE fornece estimativas precisas e confiáveis das propriedades do biofilme, uma vez que a velocidade de onda elástica medida está correlacionada com as propriedades elásticas da amostra. Além disso, o decaimento espacial da amplitude da onda elástica pode ser diretamente correlacionado com as propriedades viscoelásticas devido aos efeitos viscosos no material. Nós relatamos medidas OCE de propriedades viscoelásticas de biofilmes bacterianos de cultura mista cultivados em um reator anular rotativo (RAR) e biofilmes granulares com geometrias complexas usando modelos de ondas elastodinâmicas18.

A técnica OCE também é uma alternativa poderosa à reometriatradicional18, que é utilizada para caracterização viscoelástica. Os métodos de reometria são mais adequados para amostras com geometria plana. Dessa forma, biofilmes granulares, que apresentam formas e morfologias superficiais arbitrárias, não podem ser caracterizados com precisão em um reômetro 8,23. Além disso, ao contrário da OCE, os métodos de reometria podem ser difíceis de adaptar para medidas em tempo real, por exemplo, durante o crescimento de biofilme em células de fluxo24,25.

Neste artigo, mostramos que as medidas OCE da velocidade de onda independente da frequência das ondas de superfície podem ser usadas para caracterizar as propriedades elásticas do biofilme sem a necessidade de modelos complicados. Este desenvolvimento tornará a abordagem OCE mais acessível à comunidade mais ampla de biofilmes para o estudo das propriedades mecânicas do biofilme.

A Figura 1 mostra uma ilustração esquemática do sistema de OCT utilizado neste estudo. O sistema incorpora vários instrumentos, incluindo um sistema OCT comercial sensível à fase no domínio espectral, um gerador de atraso, um gerador de função e um transdutor piezoelétrico. O sistema OCT opera com o princípio da interferometria empregando uma fonte de luz de banda larga com um comprimento de onda central de 930 nm. A intensidade luminosa coletada, que está correlacionada com detalhes estruturais intrincados na amostra, é analisada na unidade de pós-processamento e, em seguida, convertida em uma imagem transversal da amostra – comumente referida como uma imagem de OCT. A profundidade da OCT depende da gravidade do espalhamento óptico na amostra, que decorre da variação local no índice de refração e é limitada a 1-3 mm em tecidos biológicos e biofilmes. Como a fase óptica na amostra e a intensidade da interferência são moduladas pelo movimento, a OCT pode ser usada para detectar o deslocamento local da amostra. Aproveitamos a sensibilidade de deslocamento da OCT no método OCE para rastrear o campo de deslocamento em estado estacionário das ondas elásticas na amostra. Especificamente, o gerador de função emite uma tensão senoidal para acionar o transdutor piezoelétrico. O transdutor, por sua vez, se alonga e contrai com um histórico de tempo oscilante. O deslocamento oscilatório do transdutor confere uma força senoidal na superfície da amostra através de uma ponta de cunha impressa em 3D no ápice do transdutor, levando à geração de ondas elásticas harmônicas na amostra. A ponta da cunha faz contato leve com a amostra, de modo que a amostra permanece intacta depois que o atuador é retraído da superfície da amostra. Para registrar o deslocamento local na amostra, varreduras de profundidade adjacentes separadas por um atraso de tempo fixo são adquiridas em cada pixel da amostra. A diferença de fase óptica entre varreduras consecutivas em cada ponto de pixel é proporcional ao deslocamento vertical local no mesmo ponto. A sincronização entre o deslocamento do transdutor e a óptica de varredura no sistema OCT é obtida através de um pulso de disparo que se origina do gerador de função e é retardado no gerador de atraso. Esta etapa de sincronização facilita a aquisição de imagens transversais consistentes da distribuição de fase óptica local na amostra. Essas imagens são diretamente proporcionais ao deslocamento harmônico vertical local na amostra e são conhecidas como imagem OCE. As imagens OCE são adquiridas em diferentes frequências de atuação do transdutor para obter o comprimento de onda elástico e a velocidade de onda em função da frequência. As velocidades de onda medidas são analisadas com um modelo elastodinâmico para determinar as propriedades elásticas da amostra.

Protocol

1. Configuração do sistema Reúna os componentes do sistema que incluem o sistema OCT comercial (unidade base, suporte, cabeça de imagem e computador), gerador de forma de onda, transdutor, gerador de atraso/pulso, um interruptor com conexões BNC, cabos e adaptadores BNC, postes ópticos e grampos. Conecte o sinal de sincronização do gerador de funções a um switch. Conecte a outra porta do switch ao gerador de atraso. Conecte a saída do gerador de funções aos cabo…

Representative Results

Neste estudo, foram utilizados biofilmes granulares (também conhecidos como lodo granular), os quais foram obtidos comercialmente. Os grânulos são biofilmes esféricos que se formam por autoagregação, ou seja, não necessitam de um carreador ou superfície para crescer26. A Figura 3A mostra uma imagem representativa da OCT transversal que surge devido à variação espacial do índice de refração local em um biofilme granular. O biofilme tem u…

Discussion

A profundidade de imagem atingível no sistema OCT é determinada pelo grau de penetração de luz da fonte de luz, que depende do comprimento de onda da fonte. Além disso, o comprimento de onda determina a resolução axial. Comprimentos de onda mais longos podem penetrar mais profundamente na amostra, mas às custas de resolução axial reduzida em comparação com comprimentos de onda mais curtos. A resolução transversal, por outro lado, é dependente tanto da abertura numérica do sistema quanto do comprimento de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

(Rockford, IL, EUA) pelo fornecimento dos biofilmes granulares estudados neste trabalho. Os autores também agradecem o apoio da National Science Foundation via Prêmio #210047 e #193729.

Materials

3D printed sample holder
3D printed wedge tip 3 mm width
BNC cables Any brand
Delay generator Stanford Research Systems DG535 DG535 Digital delay/ Pulse Generator 
Function generator Agilent Technologies 33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator
Granular biofilm Aqua-Aerobic Systems Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.)
MATLAB MathWorks Release 2022a (MATLAB 9.12)
Piezoelectric transducer Thorlabs PK2JUP1 Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement
SD-OCT System Thorlabs Ganymede II, LSM03 scan lens
ThorImageOCT Thorlabs Version: 5.5.5

References

  1. Mahto, K. U., Das, S. Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the moving bed biofilm reactor for wastewater treatment: A review. Bioresour Technol. 345, 126476 (2022).
  2. Pholchan, M. K., Baptista, J. d. e. C., Davenport, R. J., Curtis, T. P. Systematic study of the effect of operating variables on reactor performance and microbial diversity in laboratory-scale activated sludge reactors. Water Res. 44 (5), 1341-1352 (2010).
  3. Briones, A., Raskin, L. Diversity and dynamics of microbial communities in engineered environments and their implications for process stability. Curr Opin in Biotechnol. 14 (3), 270-276 (2003).
  4. Sanchez-Huerta, C., Sanchez Medina, J., Wang, C., Fortunato, L., Hong, P. Understanding the role of sorption and biodegradation in the removal of organic micropollutants by membrane aerated biofilm reactor (MABR) with different biofilm thickness. Water Res. 236, 119935 (2023).
  5. Wang, H. F., Hu, H., Yang, H. Y., Zeng, R. J. Characterization of anaerobic granular sludge using a rheological approach. Water Res. 106, 116-125 (2016).
  6. Ma, Y. J., Xia, C. W., Yang, H. Y., Zeng, R. J. A rheological approach to analyze aerobic granular sludge. Water Res. 50, 171-178 (2014).
  7. Lin, X., Wang, Y. Microstructure of anammox granules and mechanisms endowing their intensity revealed by microscopic inspection and rheometry. Water Res. 120, 22-31 (2017).
  8. Liou, H. C., et al. Towards mechanical characterization of granular biofilms by optical coherence elastography measurements of circumferential elastic waves. Soft Matter. 15 (28), 5562-5573 (2019).
  9. Liou, H. C., Sabba, F., Wang, Z., Wells, G., Balogun, O. Layered viscoelastic properties of granular biofilms. Water Res. 202, 117394 (2021).
  10. Li, C., Guan, G., Reif, R., Huang, Z., Wang, R. K. Determining elastic properties of skin by measuring surface waves from an impulse mechanical stimulus using phase-sensitive optical coherence tomography. J R Soc Interface. 9, 831-841 (2012).
  11. Ramier, A., et al. In vivo measurement of shear modulus of the human cornea using optical coherence elastography. Sci Rep. 10, 17366 (2020).
  12. Ramier, A., Tavakol, B., Yin, S. H. Measuring mechanical wave speed, dispersion, and viscoelastic modulus of cornea using optical coherence elastography. Optics Express. 27 (12), 16635 (2019).
  13. Crespo, M. A., et al. In vivo determination of human corneal elastic modulus using vibrational optical coherence tomography. Cornea Ext Dis. 11 (7), 1-11 (2022).
  14. Ambrozinski, L., et al. Acoustic micro-tapping for non-contact 4D imaging of tissue elasticity. Sci Rep. 6 (38967), 1-11 (2016).
  15. Pitre, J. J., et al. Nearly-incompressible transverse isotropy (NITI) of cornea elasticity: model and experiments with acoustic micro-tapping OCE. Sci Rep. 10 (12983), 1-14 (2020).
  16. Lan, G., Aglyamov, S. R., Larin, K. V., Twa, M. D. In vivo human corneal shear wave optical coherence elastography. Optom Vis Sci. 98, 58-63 (2021).
  17. Rosenthal, A., et al. Morphological analysis of pore size and connectivity in a thick mixed-cultured biofilm. Biotechnol Bioeng. 115, 2268-2279 (2018).
  18. Liou, H. C., Sabba, F. I., Packman, A., Wells, G., Balogun, O. Nondestructive characterization of soft materials and biofilms by measurement of guided elastic wave propagation using optical coherence elastography. Soft Matter. 15, 575-586 (2019).
  19. Wagner, M., Taherzadeh, D., Haisch, C., Horn, H. Investigation of the mesoscale structure and volumetric features of biofilms using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 107 (5), 844-853 (2010).
  20. Leite-Andrade, M. C., et al. A new approach by optical coherence tomography for elucidating biofilm formation by emergent Candida species. PLoS ONE. 12 (11), e0188020 (2017).
  21. Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Time-resolved biofilm deformation measurements using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 112 (9), 1893-1905 (2015).
  22. Picioreanu, C., Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Determination of mechanical properties of biofilms by modeling the deformation measured using optical coherence tomography. Water Res. 145, 588-598 (2018).
  23. Li, M., Nahum, Y., Matouš, K., Stoodley, P., Nerenberg, R. Effects of biofilm heterogeneity on the apparent mechanical properties obtained by shear rheometry. Biotechnol Bioeng. 120, 553-561 (2023).
  24. Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
  25. Geisel, S., Secchi, E., Vermant, J. Experimental challenges in determining the rheological properties of bacterial biofilms. Interface Focus. 12 (6), 20220032 (2022).
  26. Winkler, M. K. H., van Loosdrecht, M. C. M. Intensifying existing urban wastewater. Science. 375 (6579), 377-378 (2022).
  27. Graff, K. F. . Wave motion in elastic solids. , (1991).
  28. Kennedy, B. F., Kennedy, K. M., Sampson, D. D. A review of optical coherence elastography: Fundamentals, techniques and prospects. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (2), 272-288 (2014).
  29. Ang, M., et al. Anterior segment optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 66, 132-156 (2018).
  30. Kirby, M. A., et al. Spatial resolution in dynamic optical coherence elastography. J Biomed Opt. 24 (9), 1-16 (2019).
  31. Larin, K. V., Sampson, D. D. Optical coherence elastography – OCT at work in tissue biomechanics. Biomed Opt Express. 8, 1172-1202 (2017).
  32. Muhammad, A., et al. Importance of species sorting and immigration on the bacterial assembly of different-sized aggregates in a full-scale aerobic granular sludge. Environ Sci Technol. 53 (14), 8291-8301 (2019).
  33. Candry, P., et al. Tailoring polyvinyl alcohol-sodium alginate (PVA-SA) hydrogel beads by controlling crosslinking pH and time. Sci Rep. 12 (1), 20822 (2022).
  34. Kirby, M. A., et al. Optical coherence elastography in ophthalmology. J Biomed Opt. 22 (12), 1-28 (2017).
  35. Liang, X., Boppart, S. A. Biomechanical properties of in vivo human skin from dynamic optical coherence elastography. IEEE Trans Biomed Eng. 57 (4), 953-959 (2010).

Play Video

Cite This Article
Dieppa, E., Schmitz, H., Wang, Z., Sabba, F., Wells, G., Balogun, O. Quantifying Elastic Properties of Environmental Biofilms using Optical Coherence Elastography. J. Vis. Exp. (205), e66118, doi:10.3791/66118 (2024).

View Video