כימות תכונות אלסטיות של ביופילמים סביבתיים באמצעות אלסטוגרפיה קוהרנטית אופטית
Summary
מאמר זה מדגיש את יעילותה של טכניקת האלסטוגרפיה הקוהרנטית האופטית (OCE) באפיון מהיר ולא הרסני של תכונות אלסטיות של ביופילם. אנו מבהירים הליכי יישום OCE קריטיים למדידות מדויקות ומציגים את ערכי המודולוס של יאנג עבור שני ביופילמים גרעיניים.
Abstract
ביופילמים הם ביו-חומרים מורכבים המרכיבים רשת מאורגנת היטב של תאים מיקרוביאליים העטופים בחומרים פולימריים חוץ-תאיים המיוצרים בייצור עצמי (EPS). מאמר זה מציג תיאור מפורט של יישום מדידות אלסטוגרפיה קוהרנטיות אופטית (OCE) המותאמות לאפיון אלסטי של ביופילמים. OCE היא טכניקה אופטית אל-הרסנית המאפשרת מיפוי מקומי של מיקרו-מבנה, מורפולוגיה ותכונות ויסקו-אלסטיות של חומרים רכים שקופים חלקית ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה. אנו מספקים מדריך מקיף המפרט את ההליכים החיוניים ליישום נכון של טכניקה זו, יחד עם מתודולוגיה להערכת עיקר המודולוס של יאנג של ביופילמים גרעיניים מהמדידות שנאספו. אלה כוללים את הגדרת המערכת, רכישת נתונים ועיבוד לאחר מכן. בדיון, אנו מתעמקים בפיזיקה הבסיסית של החיישנים המשמשים ב-OCE ובוחנים את המגבלות הבסיסיות לגבי קנה המידה המרחבי והזמני של מדידות OCE. אנו מסכמים עם כיוונים עתידיים פוטנציאליים לקידום טכניקת OCE כדי להקל על מדידות אלסטיות של ביופילמים סביבתיים.
Introduction
בטיפול בשפכים ובהשבת משאבי מים, ביופילמים מועילים בכורי גדילה מחוברים משמשים יותר ויותר כדי לאפשר למיקרובים להמיר מזהמים בלתי רצויים, כגון חומר אורגני, חנקן ופוספט, לצורות מיוצבות שניתן להסיר בקלות מהמים1. במערכות אלה, הפונקציה המתהווה של הביופילם, כלומר טרנספורמציות ביוכימיות, קשורה קשר הדוק למגוון המיקרובים השוכנים בו ולחומרי המזון שמיקרובים אלה מקבלים2. בהתאם לכך, גידול מתמשך של ביופילם יכול להוות אתגר לשמירה על פונקציונליות עקבית של כורים מכיוון שהגידול החדש בביופילם עשוי לשנות את התהליכים המטבוליים הכוללים של הביופילם, מאפייני העברת המסה והרכב הקהילה. ייצוב סביבת הביופילם ככל האפשר יכול להגן מפני שינויים כאלה3. זה כולל הבטחת זרימה עקבית של חומרים מזינים ושמירה על מבנה הביופילם יציב עם עובי קבוע4. ניטור הנוקשות והמבנה הפיזי של הביופילם יאפשר לחוקרים לקבל תובנה לגבי הבריאות הכללית והתפקוד של הביופילם.
ביופילמים מציגים תכונות ויסקו-אלסטיות 5,6,7. אופי ויסקו-אלסטי זה גורם לשילוב של עיוות מיידי ואיטי, תלוי זמן, בתגובה לכוחות מכניים חיצוניים. היבט ייחודי אחד של ביופילמים הוא שכאשר הם נתונים לעיוות משמעותי, הם מגיבים כמו נוזלים צמיגים. לעומת זאת, כאשר הם נתונים לעיוות קל, תגובתם דומה למוצקים5. יתר על כן, בתוך אזור עיוות קטן זה, יש טווח עיוות שבו ביופילמים מציגים יחסי כוח-עקירה ליניאריים 5,6,7. עיוותים בטווח ליניארי זה הם אופטימליים להערכת מאפיינים מכניים של ביופילם מכיוון שהם מניבים מדידות הניתנות לשחזור. מספר טכניקות יכולות לכמת את התגובה האלסטית בטווח זה. אלסטוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCE) היא טכניקה מתפתחת המותאמת לניתוח ביופילמים בטווח ליניארי זה (זנים בסדר גודל של 10-4-10-5)8,9.
היישום המבוסס ביותר של OCE עד כה הוא בתחום הביו-רפואי, שם יושמה הטכניקה לאפיון רקמות ביולוגיות הדורשות גישה אופטית שטחית בלבד. לדוגמה, Li et al. השתמשו ב-OCE כדי לאפיין את התכונות האלסטיות של רקמת העור10. מחברים אחרים אפיינו את התכונות האלסטיות האנאיזוטרופיות של רקמות קרנית חזיריות ואנושיות וכיצד הן מושפעות מלחץ תוך עיני 11,12,13,14,15,16. כמה יתרונות של שיטת OCE לחקר ביופילמים הם שהיא אינה הרסנית ומספקת רזולוציה מרחבית מזוסקאלית, היא אינה דורשת הכנת דגימה, והשיטה עצמה מהירה; הוא מספק מדידות רשומות משותפות של מבנה פיזי ותכונות אלסטיות (למשל, נקבוביות, חספוס פני השטח ומורפולוגיה)8,9,17,18.
שיטת OCE מודדת את התזוזה המקומית של גלים אלסטיים מתפשטים בדגימה באמצעות טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית רגישה לפאזה (OCT). OCT הוא אינטרפרומטר אופטי בקוהרנטיות נמוכה שהופך שינויים מקומיים בתזוזת הדגימה לשינוי עוצמה המתועד באמצעות ספקטרומטר אופטי. טכניקת OCT שימשה גם במחקר ביופילם לאפיון מבנה מזוסקאלי, התפלגות נקבוביות בתלת ממד ועיוות ביופילם 17,19,20,21. בנוסף, Picioreanu et al. העריכו תכונות מכניות של ביופילם באמצעות מודלים הופכיים של אינטראקציה בין מבנה נוזל לתמונות דפורמציה של חתך OCT22.
לעומת זאת, מדידות OCE, בשילוב עם מידול גלים אלסטודינמיים הופכיים, מניבות את מהירות הגל של הגלים האלסטיים בדגימה, מה שמאפשר לאפיין את התכונות האלסטיות והויסקו-אלסטיות של הדגימה. הקבוצה שלנו התאימה את טכניקת OCE למדידה כמותית של תכונות אלסטיות וויסקו-אלסטיות של ביופילם 8,9,18 ואישרה את הטכניקה כנגד מדידות ריאומטריית גזירה בדגימות צלחת ג’ל אגרוז18. גישת OCE מספקת הערכות מדויקות ואמינות של תכונות הביופילם מכיוון שמהירות הגל האלסטי הנמדדת מתואמת עם התכונות האלסטיות של הדגימה. יתר על כן, הדעיכה המרחבית של משרעת הגל האלסטי יכולה להיות בקורלציה ישירה עם התכונות הויסקו-אלסטיות עקב השפעות צמיגיות בחומר. דיווחנו על מדידות OCE של תכונות ויסקו-אלסטיות של ביופילמים חיידקיים בתרבית מעורבת שגדלו על קופונים בכור טבעתי מסתובב (RAR) וביופילמים גרגיריים עם גיאומטריות מורכבות באמצעות מודלים של גלים אלסטודינמיים18.
טכניקת OCE היא גם חלופה רבת עוצמה לריאומטריה18המסורתית המשמשת לאפיון ויסקו-אלסטי. שיטות הראומטריה מתאימות ביותר לדגימות עם גאומטריה מישורית. לפיכך, לא ניתן לאפיין במדויק ביופילמים גרגיריים, בעלי צורות שרירותיות ומורפולוגיה של פני השטח, על גבי ראומטר 8,23. בנוסף, שלא כמו OCE, שיטות ראומטריה עשויות להיות מאתגרות להסתגל למדידות בזמן אמת, למשל, במהלך גידול ביופילם בתאי זרימה24,25.
במאמר זה אנו מראים כי מדידות OCE של מהירות הגל הבלתי תלויה בתדר של גלי פני השטח יכולות לשמש לאפיון התכונות האלסטיות של הביופילם ללא צורך במודלים מסובכים. פיתוח זה יהפוך את גישת OCE לנגישה יותר לקהילת הביופילם הרחבה יותר לחקר התכונות המכניות של הביופילם.
איור 1 מראה המחשה סכמטית של מערכת OCT ששימשה במחקר זה. המערכת משלבת מספר מכשירים, כולל מערכת OCT מסחרית רגישה לפאזה, מחולל השהיה, מחולל פונקציות ומתמר פיאזואלקטרי. מערכת OCT פועלת על עקרון האינטרפרומטריה על ידי שימוש במקור אור רחב פס עם אורך גל מרכזי של 930 ננומטר. עוצמת האור שנאספת, המתואמת עם פרטים מבניים מורכבים בדגימה, מנותחת ביחידת העיבוד שלאחר מכן ומומרת לתמונת חתך רוחב של הדגימה – המכונה בדרך כלל תמונת OCT. עומק הדמיית OCT תלוי בחומרת הפיזור האופטי בדגימה הנובע משונות מקומית במקדם השבירה ומוגבל ל-1-3 מ”מ ברקמות ביולוגיות ובביופילמים. מכיוון שהפאזה האופטית בדגימה ועוצמת ההפרעה מווסתות על ידי תנועה, ניתן להשתמש ב-OCT כדי לזהות את תזוזת הדגימה המקומית. אנו ממנפים את רגישות התזוזה של OCT בשיטת OCE כדי לעקוב אחר שדה התזוזה במצב יציב של גלים אלסטיים בדגימה. באופן ספציפי, מחולל הפונקציה מפיק מתח סינוסואידלי כדי להניע את המתמר הפיזואלקטרי. המתמר, בתורו, נמתח ומתכווץ עם היסטוריית זמן מתנודדת. התזוזה התנודתית של המתמר מקנה כוח סינוסואידי על פני הדגימה דרך קצה טריז מודפס בתלת-ממד בקודקוד המתמר, מה שמוביל ליצירת גלים אלסטיים הרמוניים בדגימה. קצה הטריז יוצר מגע קל עם הדגימה, כך שהדגימה נשארת שלמה לאחר שהמפעיל נסוג משטח הדגימה. לתיעוד התזוזה המקומית בדגימה, מתקבלות סריקות עומק סמוכות המופרדות בהשהיית זמן קבועה בכל פיקסל בדגימה. הפרש הפאזה האופטית בין סריקות עוקבות בכל נקודת פיקסל פרופורציונלי לתזוזה האנכית המקומית באותה נקודה. הסנכרון בין תזוזת המתמר לבין אופטיקת הסריקה במערכת OCT מושג באמצעות פולס טריגר שמקורו במחולל הפונקציות ומתעכב במחולל ההשהיה. שלב סנכרון זה מאפשר קבלת תמונות חתך עקביות של התפלגות הפאזה האופטית המקומית בדגימה. תמונות אלה עומדות ביחס ישר לתזוזה ההרמונית האנכית המקומית בדגימה וידועות כתמונת OCE. תמונות OCE נרכשות בתדרי הפעלת מתמרים שונים כדי לקבל את אורך הגל האלסטי ואת מהירות הגל כפונקציה של תדר. מהירויות הגל הנמדדות מנותחות באמצעות מודל אלסטודינמי כדי לקבוע את התכונות האלסטיות של הדגימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
עומק ההדמיה הניתן להשגה במערכת OCT נקבע על פי מידת חדירת האור ממקור האור, התלויה באורך הגל של המקור. יתר על כן, אורך הגל קובע את הרזולוציה הצירית. אורכי גל ארוכים יותר יכולים לחדור עמוק יותר לתוך הדגימה אך על חשבון רזולוציה צירית מופחתת בהשוואה לאורכי גל קצרים יותר. הרזולוציה הרוחבית, לעומת ז?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ל-Aqua-Aerobic Systems, Inc. (רוקפורד, אילינוי, ארה”ב) על אספקת הביופילמים הגרעיניים שנחקרו בעבודה זו. המחברים גם מודים על תמיכתה של הקרן הלאומית למדע באמצעות פרסים #210047 ו- #193729.
Materials
| 3D printed sample holder | |||
| 3D printed wedge tip | 3 mm width | ||
| BNC cables | Any brand | ||
| Delay generator | Stanford Research Systems | DG535 | DG535 Digital delay/ Pulse Generator |
| Function generator | Agilent Technologies | 33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator | |
| Granular biofilm | Aqua-Aerobic Systems | Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.) | |
| MATLAB | MathWorks | Release 2022a (MATLAB 9.12) | |
| Piezoelectric transducer | Thorlabs | PK2JUP1 | Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement |
| SD-OCT System | Thorlabs | Ganymede II, LSM03 scan lens | |
| ThorImageOCT | Thorlabs | Version: 5.5.5 |
References
- Mahto, K. U., Das, S. Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the moving bed biofilm reactor for wastewater treatment: A review. Bioresour Technol. 345, 126476 (2022).
- Pholchan, M. K., Baptista, J. d. e. C., Davenport, R. J., Curtis, T. P. Systematic study of the effect of operating variables on reactor performance and microbial diversity in laboratory-scale activated sludge reactors. Water Res. 44 (5), 1341-1352 (2010).
- Briones, A., Raskin, L. Diversity and dynamics of microbial communities in engineered environments and their implications for process stability. Curr Opin in Biotechnol. 14 (3), 270-276 (2003).
- Sanchez-Huerta, C., Sanchez Medina, J., Wang, C., Fortunato, L., Hong, P. Understanding the role of sorption and biodegradation in the removal of organic micropollutants by membrane aerated biofilm reactor (MABR) with different biofilm thickness. Water Res. 236, 119935 (2023).
- Wang, H. F., Hu, H., Yang, H. Y., Zeng, R. J. Characterization of anaerobic granular sludge using a rheological approach. Water Res. 106, 116-125 (2016).
- Ma, Y. J., Xia, C. W., Yang, H. Y., Zeng, R. J. A rheological approach to analyze aerobic granular sludge. Water Res. 50, 171-178 (2014).
- Lin, X., Wang, Y. Microstructure of anammox granules and mechanisms endowing their intensity revealed by microscopic inspection and rheometry. Water Res. 120, 22-31 (2017).
- Liou, H. C., et al. Towards mechanical characterization of granular biofilms by optical coherence elastography measurements of circumferential elastic waves. Soft Matter. 15 (28), 5562-5573 (2019).
- Liou, H. C., Sabba, F., Wang, Z., Wells, G., Balogun, O. Layered viscoelastic properties of granular biofilms. Water Res. 202, 117394 (2021).
- Li, C., Guan, G., Reif, R., Huang, Z., Wang, R. K. Determining elastic properties of skin by measuring surface waves from an impulse mechanical stimulus using phase-sensitive optical coherence tomography. J R Soc Interface. 9, 831-841 (2012).
- Ramier, A., et al. In vivo measurement of shear modulus of the human cornea using optical coherence elastography. Sci Rep. 10, 17366 (2020).
- Ramier, A., Tavakol, B., Yin, S. H. Measuring mechanical wave speed, dispersion, and viscoelastic modulus of cornea using optical coherence elastography. Optics Express. 27 (12), 16635 (2019).
- Crespo, M. A., et al. In vivo determination of human corneal elastic modulus using vibrational optical coherence tomography. Cornea Ext Dis. 11 (7), 1-11 (2022).
- Ambrozinski, L., et al. Acoustic micro-tapping for non-contact 4D imaging of tissue elasticity. Sci Rep. 6 (38967), 1-11 (2016).
- Pitre, J. J., et al. Nearly-incompressible transverse isotropy (NITI) of cornea elasticity: model and experiments with acoustic micro-tapping OCE. Sci Rep. 10 (12983), 1-14 (2020).
- Lan, G., Aglyamov, S. R., Larin, K. V., Twa, M. D. In vivo human corneal shear wave optical coherence elastography. Optom Vis Sci. 98, 58-63 (2021).
- Rosenthal, A., et al. Morphological analysis of pore size and connectivity in a thick mixed-cultured biofilm. Biotechnol Bioeng. 115, 2268-2279 (2018).
- Liou, H. C., Sabba, F. I., Packman, A., Wells, G., Balogun, O. Nondestructive characterization of soft materials and biofilms by measurement of guided elastic wave propagation using optical coherence elastography. Soft Matter. 15, 575-586 (2019).
- Wagner, M., Taherzadeh, D., Haisch, C., Horn, H. Investigation of the mesoscale structure and volumetric features of biofilms using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 107 (5), 844-853 (2010).
- Leite-Andrade, M. C., et al. A new approach by optical coherence tomography for elucidating biofilm formation by emergent Candida species. PLoS ONE. 12 (11), e0188020 (2017).
- Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Time-resolved biofilm deformation measurements using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 112 (9), 1893-1905 (2015).
- Picioreanu, C., Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Determination of mechanical properties of biofilms by modeling the deformation measured using optical coherence tomography. Water Res. 145, 588-598 (2018).
- Li, M., Nahum, Y., Matouš, K., Stoodley, P., Nerenberg, R. Effects of biofilm heterogeneity on the apparent mechanical properties obtained by shear rheometry. Biotechnol Bioeng. 120, 553-561 (2023).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Geisel, S., Secchi, E., Vermant, J. Experimental challenges in determining the rheological properties of bacterial biofilms. Interface Focus. 12 (6), 20220032 (2022).
- Winkler, M. K. H., van Loosdrecht, M. C. M. Intensifying existing urban wastewater. Science. 375 (6579), 377-378 (2022).
- Graff, K. F. . Wave motion in elastic solids. , (1991).
- Kennedy, B. F., Kennedy, K. M., Sampson, D. D. A review of optical coherence elastography: Fundamentals, techniques and prospects. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (2), 272-288 (2014).
- Ang, M., et al. Anterior segment optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 66, 132-156 (2018).
- Kirby, M. A., et al. Spatial resolution in dynamic optical coherence elastography. J Biomed Opt. 24 (9), 1-16 (2019).
- Larin, K. V., Sampson, D. D. Optical coherence elastography – OCT at work in tissue biomechanics. Biomed Opt Express. 8, 1172-1202 (2017).
- Muhammad, A., et al. Importance of species sorting and immigration on the bacterial assembly of different-sized aggregates in a full-scale aerobic granular sludge. Environ Sci Technol. 53 (14), 8291-8301 (2019).
- Candry, P., et al. Tailoring polyvinyl alcohol-sodium alginate (PVA-SA) hydrogel beads by controlling crosslinking pH and time. Sci Rep. 12 (1), 20822 (2022).
- Kirby, M. A., et al. Optical coherence elastography in ophthalmology. J Biomed Opt. 22 (12), 1-28 (2017).
- Liang, X., Boppart, S. A. Biomechanical properties of in vivo human skin from dynamic optical coherence elastography. IEEE Trans Biomed Eng. 57 (4), 953-959 (2010).
