Регистрация функциональной целостности барьера на клетках эндотелия сосудов bEnd.3 с помощью детектирования трансэндотелиального электрического сопротивления

ГЭБ представляет собой уникальный биологический интерфейс между кровообращением и нервной тканью, который состоит из эндотелиальных клеток сосудов, перицитов, астроцитов, нейронов и других клеточных структур¹. Поток ионов, химических веществ и клеток между кровью и мозгом строго регулируется этим барьером. Этот гомеостаз защищает нервные ткани от токсинов и болезнетворных микроорганизмов, а также обеспечивает надлежащую работу нервов головного мозга ^2,3. Поддержание целостности ГЭБ может эффективно предотвращать развитие и прогрессирование нарушений, влияющих на центральную нервную систему, таких как дисфункция нейронов, отек и нейровоспаление⁴. Однако уникальные физиологические свойства ГЭБ предотвращают попадание в центральную нервную систему более 98% низкомолекулярных лекарственных препаратов и 100% высокомолекулярных фармацевтических препаратов⁵. Поэтому увеличение проникновения лекарственных средств через ГЭБ при разработке препаратов для центральной нервной системы имеет существенное значение для достижения терапевтической эффективности ^6,7. Несмотря на то, что скрининг субстратов с помощью компьютерного моделирования значительно повысил вероятность того, что кандидаты в лекарственные препараты проникнут через ГЭБ, для удовлетворения потребностей^{научных исследований} по-прежнему необходимы надежные и доступные модели ГЭБ in vitro/in vivo.

Быстрым и доступным методом высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов является модель in vitro ⁹. Для того, чтобы пролить свет на фундаментальные процессы влияния лекарственных средств на функцию ГЭБ и их роль в развитии и прогрессировании заболевания, была создана серия упрощенных моделей ГЭБ in vitro. В настоящее время распространенными моделями ГЭБ in vitro являются монослойные, кокультуральные, динамические и микрофлюидные модели 10,11,12, построенные сосудистыми эндотелиальными клетками и астроцитами, перицитами или микроглией ^13,14. Несмотря на то, что 3D-клеточные культуры в большей степени соответствуют физиологической структуре ГЭБ¹⁵, их применение в качестве средства скрининга лекарств на ГЭБ по-прежнему ограничено их сложной конструкцией и низкой воспроизводимостью. В отличие от этого, модель монослоя in vitro является наиболее часто используемой для исследования ГЭБ и применима для определения экспрессии мембранных транспортеров и белков плотного соединения в конкретных клетках.

Измерение трансмембранного электрического сопротивления (TEER) — это метод оценки и мониторинга слоя клеток поперек сопротивления, а также оценки целостности клеток и проницаемости барьера. При одновременном введении двух электродов в питательную среду или буферный раствор с обеих сторон монослоя можно измерить переменный ток или электрический импеданс через компактный слой ячейки^16,17. Для того, чтобы определить, правильно ли была создана модель ГВВ in vitro, в качестве золотого стандарта обычно используется измерение TEER¹⁸. С другой стороны, тенденция действия лекарств на проницаемость ГЭБ может быть точно предсказана путем измерения изменения электрического сопротивления клеточного слоя после введения препарата¹⁹. Например, Feng et al. обнаружили, что catalpol (первичный активный мономер rehmanniae) может эффективно обратить вспять вызванную липополисахаридами подавление регуляции белков плотных соединений в ГЭБ и повысить значение TEER^20-го слоя эндотелиальных клеток головного мозга мыши.

Нейровоспалительная реакция обычно является основной причиной дисбаланса гомеостаза ГЭБ²¹. Гипоксическое лечение для индуцирования нейровоспалительного повреждения является основным методом разрушения гематоэнцефалического барьера, в основном включающим физические методы и методы химических реагентов. В первом случае в основном используется инкубатор из трех газов для изменения содержания кислорода в среде роста клеток для моделирования гипоксических условий²², в то время как второй достигается путем искусственного введения дезоксиреагентов, таких как CoCl₂, в среду^{клеточной культуры 23}. Клетки останутся в деоксигенированном состоянии, если Fe²⁺ будет заменен на Co²⁺ в геме. Если Fe²⁺ заменить Co²⁺ в каталитической группе, активность пролингидроксилазы и аспартатгидроксилазы будет ингибирована, что приведет к накоплению гипоксически-индуцируемого фактора-1α (HIF-1α)²⁴. При персистирующей гипоксии дефосфорилирование HIF-1α в цитоплазме вызывает гибель клеток и активирует фактор роста эндотелия сосудов, что в конечном итоге повышает проницаемость сосудов. В предыдущих исследованиях^25,26 было хорошо продемонстрировано, что гипоксия может значительно снижать экспрессию эндотелиальных белков плотного соединения для увеличения проницаемости ГЭБ. В этом исследовании была измерена кривая сопротивления времени клеток bEnd.3, засеянных в 24-луночные планшеты, чтобы создать прямолинейную модель ГЭБ. Используя эту модель, мы охарактеризовали изменения в клеточном TEER после вмешательства CoCl₂ с целью построения клеточной модели, которая может быть использована для скрининга лекарств на защиту от ГЭБ.